… Ve Dikkate Alınması Gereken Dört Önemli Değişken
Hücre sayımı, hücre kültürünüzün durumu hakkında harika bilgiler sağlayabilir. Burada, bu konuyla ilgili tüm merak ettiğiniz soruları yanıtlıyoruz, o yüzden yolculuğa hazır olun!
Anahtar noktaları:
- Hücreleri ölçmek, canlılıklarını ve büyüme modellerini belirlemenize yardımcı olur
- Manuel yöntemler, ışık mikroskobu ile gözlemlenen hemasitometrelerin kullanımı etrafında döner
- Otomatik cihazlar ya elektrik empedansına, akış sitometrisine ya da görüntü sitometrisine dayalıdır
- Zaman tüketimi, doğruluk ve tutarlılık bu yaklaşımlar arasında farklılık gösterir.
Hücre Sayma Nedir?
Basit ama önemli bir soru. Bazıları hücre sayımının sadece hücreleri saymak olduğunu söyleyebilir. Ama gerçekte, bundan çok daha fazlası. Pek çok şey arasında, hücre sayımı…
… rutin . Hücreleri içeren deneylerde, onları kontrol ederek tutarlılığı koruyun. Beklendiği gibi göründüklerinden ve hareket ettiklerinden emin olmak sizi bir adım önde tutar.
… anlayışlı . Hücre sayımını birden çok kez yaparsanız, hücre canlılığının yanı sıra standart sapma ve varyans hakkında bilgi verebilir. Tabii ki, sadece hücrelerin durumundan başka faktörler bu sayıları etkiler – daha sonra bunun üzerinde duracağız.
… umursayan . Hücrelerinize ve onların sağlığına özen gösterin. Kültür ortamında nasıl olduklarına bir göz atın ve onlara gelişmek için mümkün olan en iyi koşulları verin.
… hazırlanıyor . Bir hücre kültürünü ihtiyaç duyulana kadar planlayın ve sürdürün. Örneğin, istenen sonuçları sağlamak için bunu farklı tahlillerde veya protein üretiminde yapmak çok önemlidir.
Yöntemler Nelerdir?
Hücre sayımı alanındaki temel ayrım, manuel ve otomatik teknikler arasında yapılır . Hücreleri saymanın her iki yöntemi de , bir numunedeki ölü ve canlı hücreler arasında ayrım yapmak için sayılmadan önce hücre boyaması gerektirir. Özellikle manuel hücre sayımında, tripan mavisi , zar geçirgenliği olmadığı için ölü hücreleri boyamak için sıklıkla kullanılır 1 . Diğer lekeler arasında propidium iyodür (PI), eritrosin B, akridin portakalı (AO) ve DAPI bulunur.
Manuel yönteme bakarak başlayalım.
Manuel Hücre Sayma
Çoğumuzun aşina olduğu bir yöntemdir. Boyadığınız seyreltilmiş bir hücre kültürünüz (PBS’de fx) var. Daha sonra bir hemasitometre ve bir çetele sayacı 2 kullanarak hücreleri sayabilirsiniz
Avantajlar: Çoğu ekipmanın yalnızca bir kez satın alınması gerekir. Değiştirilebilir tek parça hemasitometredir (yıkayıp yeniden kullanmayı seçebilirsiniz), bu da onu hücreleri saymak için son derece ucuz bir yol haline getirir.
Hemositometre odalarından birini doldurmak için yalnızca 10 µl seyreltilmiş hücre süspansiyonuna ihtiyacınız olacak, bu da hücre kültürünüzün hacmi küçük olsa bile sayım yapmanıza olanak tanır.
Dezavantajları: Yöntem, bir hücreyi neyin tanımladığı konusunda çok fazla öznelliğe eğilimlidir ve bu, toplam hücre sayısının doğruluğunu etkileyebilir. Bu sorun, özellikle kümelenmiş hücrelerle çalışırken belirgindir .
Ayrıca, hücreleri sayabilmek için mikroskop kullanma konusunda deneyime ihtiyacınız olacak. Hücreleri manuel olarak saymak nispeten uzun zaman alır ve bu da daha yüksek işçilik maliyetleri anlamına gelir.
Otomatik yöntemleri unutmayalım
Otomatik hücre sayaçları üç tipe ayrılır. Biraz ürkütücü görünebilir, ama korkmayın, size bunları anlatacağız.
Elektriksel Empedans Tabanlı
Elektrik empedansına dayalı hücre sayaçları, Coulter sayaçları olarak da bilinir. Bunlar, bir elektrik akımındaki bir parçacığın empedansının, tampon veya ortamından farklı olduğunu belirten Coulter ilkesine dayanmaktadır. Hücreler, bir açıklıktan pompalanarak ve direnç 3 ölçülerek sayılır .
Avantajlar: Coulter sayaçları, hem çekirdekli hem de çekirdeksiz hücreler dahil olmak üzere birçok farklı türde partikülü sayabilir. Ayrıca, hücrelerin/µl’nin küçük bir alandaki hücre sayısına göre tahmin edildiği manuel yöntemin aksine, her bir hacimde gerçek sayıda hücre elde edersiniz.
Dezavantajları: Bu yöntem, görüntü tabanlı yöntemlerin aksine canlı ve canlı olmayan hücreler arasında ayrım yapmanıza izin vermez. Diğer sınırlamalar şunları içerir: Küçük partiküller fark edilmeden gidebilir, agregalar bir hücre olarak sayılır ve hücre ortamı seçiminiz elektrolitlerle sınırlıdır.
Optik/Akış Sitometrisi Tabanlı
Hücreler ayrıca akış sitometrisi ile sayılabilir ve karakterize edilebilir. Burada, bir uyarı lazeri bypass yapan hücrelere yönlendirilir ve ışık saçılımı çeşitli filtre ve dedektörlerden geçirilir. Bu sinyaller daha sonra amplifiye edilir ve analiz 3 için bir bilgisayar sistemine iletilir .
Avantajları: Manuel hücre sayımına kıyasla hızlı ve hassas hücre sayımına izin veren zaman kazandıran bir yöntemdir. Hücreleri hem zar geçirgen hem de zar geçirmeyen floresan boya ile boyayarak bu yöntemi kullanarak hücre canlılığını belirleyebilirsiniz. Canlı hücrelerin uyarılma dalga boyu canlı olanlardan farklı olacak ve hücre canlılığını yansıtacaktır.
Dezavantajları: Buradaki temel araç, görüntü tabanlı hücre sayaçlarına kıyasla pahalı bir cihaz olan akış sitometresidir (aşağıdaki bölüme bakın). Bu maliyete ek olarak, hücreleri saymak için bir akış sitometresi kullanma konusunda eğitime ihtiyacınız olacak. Topaklanma eğiliminde olan hücreleri ölçerken zorluklar ortaya çıkabilir.
Görüntü Tabanlı Sitometri
Görüntü tabanlı sitometri, makine öğrenimi ve belirli hücre sayma protokolüne uyarlanmış gelişmiş algoritmalar kullanarak hücrelerin görüntü işlemesine büyük ölçüde bağlıdır.
Bu görüntüler ya bir aydınlık alan ya da floresan mikroskop hedefi 3 aracılığıyla alınır .
Avantajlar: Bu yöntemin bilgisayar tabanlı hücre tanıması, agregaların nicelleştirilmesine izin verir.
Ayrıca, insan önyargısını ortadan kaldırmak için mikroskopi bir bilgisayar tarafından işlendiğinden, hücre sayma protokolüyle ilgili tutarlılık sağlar.
Dezavantajları: Bir görüntü sitometresi, hemasitometreye kıyasla maliyetli bir araçtır. Bu hücre sayaçlarının çoğu aynı zamanda numuneyi yüklemek için tek kullanımlık özel slaytlar veya kasetler gerektirir.
Dikkate Alınması Gereken Dört Önemli Değişken
Manuel veya otomatik hücre sayımına geçmeden önce, göz önünde bulundurmanız gereken bazı faktörler şunlardır:
#1 Fiyat Önemlidir!
Yaygın bir bakış açısı, otomatik aletlerin maliyetine kıyasla hemasitometrenin düşük maliyeti nedeniyle manuel hücre sayımının önemli ölçüde daha ucuz olmasıdır. Bununla birlikte, ek insan emeği maliyeti olduğunu (aslında çok fazla olan) göz önünde bulundurmalısınız.
Aynı zamanda birçok hataya eğilimlidir 2 ve hepimizin bildiği gibi, hatalar pahalıdır. Otomatik sayaç kullanıldığında bu masraflar ortadan kalkar.
#2 Tutarlılık Anahtardır
Her bilim adamı, deneysel sonuçlarının geçerli olması için başka bir laboratuvardan bir araştırmacının aynı protokolü takip edebilmesi ve aynı sonuçları alabilmesi gerektiğini bilir.
Bu tekrarlanabilirlik, diğer faktörlerin sonuçlara müdahale ettiği manuel hücre sayımının aksine , yüksek derecede standardizasyon nedeniyle otomatik hücre sayaçları ile sağlanır – bu konuda daha fazla bilgi için bölüm #3’te yer almaktadır.
#3 İnsan Gözü Yeterince Doğru mu?
Aynı örneği kullanmanıza rağmen sayıların birbirinden önemli ölçüde farklı olduğunu bulmak için kesinlikle çift hücre sayımı yapmaya çalıştınız!
Bu sorun özellikle, kısmen insan yanlılığı (neyin hücre olarak tanımlanacağına karar verir) ve kısmen de hemasitometrenin kolayca aşırı doldurulması nedeniyle hücreleri manuel olarak sayarken görülür. İnsan hataları ortadan kalkacağı için otomatik hücre sayaçları ile bu sorunları önleyebilirsiniz.
#4 Süreci Hızlı İzleme
Başlangıçta otomatik hücre sayımı, eğitim gerektirdiği için zaman alıcı olabilir, ancak bir kez alıştığınızda, manuel yönteme göre daha hızlı olacaksınız.
Manuel hücre sayımı, hücreler tek tek sayıldığından ve toplam hücre sayısı ve hücre canlılığı gibi hesaplamalar daha sonra manuel olarak yapıldığından zaman alıcıdır. Otomatik bir yöntemle, tüm bu işler hücre sayacına teslim edilir ve laboratuvarınızdaki diğer tüm heyecan verici projeler için zaman kazandırır!
Hücre Sayımına Dayanan Endüstriler
Artık hücre sayımı hakkında (neredeyse) her şeyi bildiğinize göre, onu ne için kullanabileceğiniz konusunda sizi bilgilendirmek istiyoruz.
- Hücre tedavisi: Hücre sayımı, hücre bazlı terapötikler için doğru dozları belirlemek ve ayrıca ürünün standardize edilmesini sağlamak için bir araç olarak kullanılır 4 .
- Biyoişleme: Bu alanda, hücre sayımı, biyoreaktörlerdeki hücre kültürlerinin durumunu, yani büyümesini ve canlılığını rutin olarak izlemek için kullanılır. Bu, hücre kültürünün büyüme aşaması 5’e dayalı olarak çıktının optimizasyonuna izin verir .
- İlaç geliştirme: Hücreler potansiyel ilaç adaylarıyla tedavi edildikten sonra, canlılığı izlemek için hücre sayımı kullanılır. Tekrarlanabilirliği sağlamak da çok önemlidir 6 .
Yani, gördüğünüz gibi, sınırlar sonsuzdur. İster manuel ister otomatik olarak yapılsın, hücre sayımının laboratuvar çalışmanızı tamamlayacak ve daha iyi sonuçlar elde etmenize yardımcı olacak birçok uygulaması vardır.
Bu notta, ne bekliyorsunuz? Gidin ve bu farklı yöntemlerden bazılarını deneyin ve laboratuvarınız için hangisinin en uygun olduğunu bulun. Mutlu sayım!
Referanslar
- Johnson, S., Nguyen, V. ve Coder, D. (2013), Hücre Canlılığının Değerlendirilmesi . Sitometride Güncel Protokoller, 64: 9.2.1-9.2.26
- Elektron Mikroskopi Bilimleri: Neubauer Hemositometrisi
- Vembadi A, Menachery A, Qasaimeh MA. Hücre Sitometrisi: Biyoteknolojik Gelişmelere İlişkin İnceleme ve Perspektif . Ön Bioeng Biyoteknoloji . 2019;7:147
- Sarkar S, Pierce L, Lin-Gibson S, Lund S (2019). Hücre Sayımında Standartlar Peyzajı: Hücre ve Gen Tedavisi İçin Etkiler . Hücre ve Gen Terapisi Görüşleri. 5. 117-131. 10.18609/cgti.2019.016.
- Butler M, Spearman M, Braasch K (2014). Hücre Büyümesini, Canlılığını ve Apoptozunu İzleme. Moleküler biyolojide yöntemler (Clifton, NJ). 1104. 169-92. 10.1007/978-1-62703-733-4_12.
- Niepel M, Hafner M, Mills CE ve ark. Memeli Hücre Hatlarında İlaç-Yanıt Deneylerinin Tekrarlanabilirliği Üzerine Çok Merkezli Bir Çalışma . Hücre Sist. 2019 Temmuz 24;9(1):35-48.e5
Christina Psaradaki, ChemoMetec Öğrenci Asistanı
Christina Psaradaki, Danimarka Teknik Üniversitesi’nde İnsan Yaşam Bilimleri Mühendisliği okuyor. ChemoMetec’te Hücre Sayma Blogu için yazıyor.