This translation into Turkish was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages
Department of Cell Biology and Anatomy, University of South Carolina- School of Medicine
This article is a part ofJoVE Immunology and Infection. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.Recommend JoVE to Your Librarian
Current Access Through Your IP Address
Current Access Through Your Registered Email Address
McLarty, J. L., Meléndez, G. C., Spencer, W. J., Levick, S. P., Brower, G. L., Janicki, J. S. Isolation of Functional Cardiac Immune Cells. J. Vis. Exp. (58), e3020, doi:10.3791/3020 (2011).
Kardiyak bağışıklık hücreleri, birçok kalp hastalıkları patolojik remodeling oynadıkları roller için faiz kazanıyor mast hücreleri, T hücreleri ve makrofajlar 1-5 Bu bağışıklık hücreleri, depo ve sitokinler ve dahil olmak üzere çeşitli biyolojik olarak aktif mediatörlerin serbest triptaz olarak proteazlar 6-8 Bu aracılar, ekstraselüler matriks metabolizmasında anahtar oyuncular matriks metalloproteinazların aktive veya modüle kardiyak fibroblastlar 'fonksiyonu kollajen birikimi neden olduğu gösterilmiştir. 9-11 Bununla birlikte, kardiyak bağışıklık hücrelerini izole etmek için uygun teknikler var miyokard doku sindirimi bakteriyel kollajenaz kullanımı nedeniyle sorunlu olmuştur. Bu teknik, bağışıklık hücrelerinin aktivasyonu ve böylece fonksiyon kaybına neden olur. Örneğin, kalp mast hücrelerinin degranülasyonu neden olan bileşiklerin önemli ölçüde daha az duyarlı hale gelir. 12 Bu nedenle, biz t sağlayan bir teknik geliştirdikalp hastalığı bu hücrelerin rolü daha iyi anlaşılmasına yol açacak fonksiyonel kardiyak bağışıklık hücrelerinin izolasyonu 13, 14
Bu yöntem, kalbin anatomik sıçan kılıç şeklinde süreci, koltuk altı ve orak şeklinde ligaman konumu ve perikard ile bir aşinalık gerektirir. Bu simge prosedürün başarısını artırmak ve kalp bağışıklık hücrelerini daha yüksek bir verim sağlamak için önemlidir. Bu izole kardiyak bağışıklık hücrelerini sonra, fenotip, olgunluk, ve diğer kalp hücreleri ile ko-kültür deneyler, bunların karşılıklı etkileşimi daha iyi bir anlayış kazanmak için karakterizasyonu için kullanılabilir.
1. Hanks 'Balance Tuz Çözeltisi Hazırlama (HBSS)
2. Hayvan preparatlarn - Trakeal Tüp yerleştirilmesi
3. Bağışıklık Hücre İzolasyon Aracı Hazırlama
3.2.1. Izolasyon prosedürü için orijinal uzunluğunun 1 / 2 3 / 4 iğne hızlı cath (1.6 cm) üzerinden 24 gauge Baxter intravasküler teflon ucu azaltın.
Not: perikard diyafram ve zarar görmemesi için sternum bağlanır hiç farkında olun. Orak şeklinde ligaman perikard karşı tarafında diyaframın bağlı olduğu notu için bir dönüm noktası olarak kullanın. Ayrıca, perikard kesilir, hücreleri izole etme yeteneğini kaybetti.
Not: Bunu yaparken biraz perikard yırtılma ve orijinal bir delik daha büyük kalp üstündeki delik, panik yapmayın . Perikard sürece hala yeterince kalp çevreleyen tampon daha az miktarda da olsa kalp üzerinde hala başka bir yıkama gerçekleştirebilirsiniz. Optimal miktarda hücre toplama, 03:57 ek yıkar ihtiyaç vardır.
Not: bağışıklık hücre izolasyon prosedürü sonra her kalp elde edilen bağışıklık hücrelerinin sayısını çok önemlidir.
5. Temsilcisi Sonuçlar:
Bu toluidin mavi ve safranin O / alcian mavi ve vitray tekniği ile elde edilen izole kardiyak mast hücreleri bir örnek, 2A ve 2B rakamlar sırasıyla sunulmuştur. Şekil 3, kalp direk görülebileceği gibi, Morgan ve ark açıklandığı gibi bileşik 48/80 ve P maddesi olarak bilinen aktivatörleri ile tedaviden sonra histamin salınımı yeteneğini sürdürdü. CD4 flow sitometri 9 Temsilcisi dağılım araziler + hücreleri ve sırasıyla Şekil 4 ve 5, CD8 + hücreleri sunulmaktadır. T-lenfositler daha da tanımlanır ve bu tekniğin bir hücre popülasyonu olarak phenotyped.
Şekil 2 kalp mast hücrelerinin histolojik temsilcisi görüntüleri aşağıdaki gibi lekeli: (A) (B) toluidin mavi ve safranin O / alcian mavi.
Şekil 3 epikardiyal miyokard bölgeden izole edilmiş ve bileşik 48/80 (10μg/mL) ve P maddesi (10μM) ile uyarılan kalp mast hücreleri fonksiyonel çalışma.
Şekil 4 izole CD4 + hücreler, P maddesi (1:100 dilut ile etiketlenen Temsilcisi flow sitometri dağılım arazileriyon).
Şekil 5, P maddesi (1:100 dilüsyon) ile etiketlenmiş izole CD8 + hücreleri Temsilcisi flow sitometri .
Kardiyak bağışıklık hücrelerini izole Bu yöntem genellikle enzimatik sindirimi geleneksel bir izolasyon tekniği sırasında ortaya çıkan istenmeyen aktivasyon olmadan bunların fonksiyonları, fenotip ve olgunluk analizi sağlar. Bu tekniği ile elde edilen hücrelerin ortalama toplam sayısı sıçan kalbinde başına 400.000 civarındadır ve bu hücrelerin diferansiyel boyama ve flow sitometri analizi, T-lenfositler (~% 70), makrofajlar (~% 12) ve mast hücreleri ile karışık bir nüfus olduğunu gösterir Bu tekniğin kullanılması (~% 12) 13, 14 Bu nedenle, kalp bağışıklık hücre popülasyonlarının daha fazla ayırma saflaştırma yöntemleri ihtiyaç vardır . İzole bağışıklık hücrelerini, fonksiyonel çalışmalar, akış sitometri, immunofluroescence, ve ko-kültür deneyler de dahil olmak üzere birden fazla uygulama için kullanılabilir. Ileri arıtma ve deney ile, bu izole hücreler kardiyak remodeling sürecinde bağışıklık sisteminin rolünü anlamak için yararlı bir araç sağlar.
Sıçanlar standart çevre şartlarında muhafaza ve ticari yem ve musluk suyu ad libitum muhafaza edildi. Tüm çalışmalar, Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım için, Ulusal Sağlık Rehberi Enstitüleri ilkelerine conformed ve Güney Carolina Kurum Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından kabul edildi. Anestezi, deneysel uç noktasında 2 ketamin 1 ksilizin oranında ketamin / xylazine kokteyl etkilendi. Bu unsterilized araçların kullanımına izin veren nonsurvival bir işlemdir. Bağışıklık hücreleri ve diğer istenen dokuya izolasyonu sonra, sıçan hızla ve insanca kemirgenler için Ötenazi (örneğin exsanguination, servikal dislokasyon, ya da anestezik doz aşımı) Amerikan Veteriner Hekimleri Birliği Yönerge göre ötenazi.
Biz ifşa etmek başka bir şey var.
Bu çalışma bir UNCF-Merck Lisansüstü Bilim Araştırma Tezi Bursu (JLM), Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü hibe RO1-HL-62.228 (JSJ) ve RO1-HL-073.990 (JSJ) tarafından desteklenmiştir.
|Name||Company||Catalog Number||Comments|
|Hanks’ Balanced Salt||Sigma-Aldrich||H4891||One bottle makes 1 L of Hanks’ Balance Salt


Solution. Reconstitute Hanks’ Balance Salt
Solution as a part of the procedure.
|Antibiotic- Antimyotic||GIBCO, by Life Technologies||15240-062|
|HEPES||Sigma-Aldrich||H3784|
|Bovine Serum Albumin||Sigma-Aldrich||A3912|
|250 mL Nalogene Filter Bottle||Thermo Fisher Scientific, Inc.||157-0020|
|12 N HCL||Fisher Scientific||CAS 7647-01-0||For 6 N, add equal volumes of HCL to deionized water.|
|10 N NaOH||Fisher Scientific||SC267||For 5 N, add equal volumes of NaOH to deionized water.|
|Double Distilled Water|
|Table of Specific Equipment:|
|3-O Suture Silk Braided||Ethicon Inc.||SA64H|
|Small Animal Ventilator||CWE, Inc.||SAR-830||Set breathing rate to 40.5 breaths per min.|
|Bevel 18 gauge needle||BD Biosciences||305199||Trim needle by 1/2 to 3/4 of its original length for use as a tracheal tube.|
|Teflon Tip (with needle removed) of 24-gauge Baxter quick-cath catheter||Baxter Internationl Inc.||2N111||Reduce the Teflon Tip length by 1/2 to 3/4.|
|10 cc syringe||Fisher Scientific||14-823-16B|
|15 mL Falcon Tubes||BD Biosciences||352097|
|Sorvall RT6000B Refrigerated Centrifuge||Fisher Scientific||75-004-377||Remember to pre-cool and keep at 4°C.|
|Hyclone||Thermo Fisher Scientific, Inc.||S300030.02|
|Hemocytometer||Hausser Scientific||HS-LB-1483|