Summary
Yetişkin zebrafish iç kulak duyu epitel yetişkin omurgalıların saç hücre yenilenmesini mekanizmaları anlamak için iyi bir model sistem. Bu protokol, hücresel ve hücre içi düzeyde yenileyici olaylar çalışmak için doku örnekleri elde edebilirsiniz epitel ince diseksiyon, göstermektedir.
Abstract
Nörosensoryel epitel iç kulak, işitme ve denge fonksiyonları için önemli yapılardır. Bu nedenle, esas olarak iki tip hücre oluşan epitel, hücresel ve moleküler özelliklerini anlamak için önemlidir: saç hücreleri (HCS) ve destekleyen hücrelerin (SC'ler). Burada epitelyal yapılar çok incelenen bütün omurgalıların korunmuş çünkü yetişkin zebrafish sadece iç kulak duyu epitel çalışmak için seçer, ancak aynı zamanda yetişkin zebrafish HCS, memelilerde doğumdan kısa bir süre sonra kaybetmek bir yeteneği yeniden mümkün çünkü. Biz yetişkin zebrafish iç kulak HC kaybının bir sonucu olarak insan İşitme / denge açıklarının klinik tedavisi için yararlı olabilir yetişkin omurgalılarda iç kulak HC rejenerasyon mekanizmalarının çalışması için bir model sistem olarak kullanabilirsiniz.
Burada yetişkin zebrafish iç kulak duyu epitel kaba ve ince diseksiyonları nasıl göstermektedir. Brüt diseksiyonu, iç kulak çevresindeki dokuları temizler ve doku kesitlerinde, bize duyu epitel ayrıntılı yapısını incelemek için olanak hazırlamak için yararlı olur. Her bir epitel ince diseksiyon olmayan duyusal-epitel dokuların temizler ve bütün montaj epitel örnekleri kolayca tüm epitel heterojenite incelemek için bize sağlar.
Protocol
Bölüm 1: doku hazırlanması
- Yetişkin zebrafish Euthanize (Etil 3-aminobenzoate methanesulfonate tuz,% 0.03) MS-222 tamponlu.
- Balık başını kesmek. Alt çene kesilmiş, ventral yüzü diseksiyon pad üzerinde kafa yerleştirin ve böcek iğneli doku hareketsiz. Kafatası ventral yumuşak doku çıkarın ve bir diseksiyon mikroskobu altında ince cımbız bir çift ile kafatası kapsül ventral kısmı açık çatlamak.
- 4 ° C gecede paraformaldehid balık kafası (% 4) sabitleyin.
- Her seferinde 3 kez, 5 dakika (Fosfat 1X, Tuzlu Tamponlu) PBS içinde sabit balık kafası durulayın.
Bölüm 2: iç kulak Brüt diseksiyon
- Ventral yüzü yukarı diseksiyon pad üzerinde balık kafası yerleştirin. Böcek iğneli hareketsiz. Tüm aşağıdaki adımları diseksiyon mikroskobu altında yürütülmektedir.
- Ince cımbız, bir çift ile, kafatası kemiğinin iç kulağın üzerine çıkarın ve sonra iç kulak dokular dikkatle çekin: saccules, lagenae ve utricles. Kesecik ve lagena birbirine sıkıca birbirine eklemek ve böylece çekin kesecik (Kesecik ve lagena anterior), diseksiyon sırasında diğer ucunu organları koparılmış olması çok muhtemeldir.
- PBS (1X) iç kulak dokuları koyun. Daha fazla ince diseksiyon gerekiyorsa, PBS (1X) ile doku 2-3 kez yıkayın ve diğer deneyler, örneğin cryosections için kullanılabilir.
Bölüm 3: iç kulak duyu epitel Güzel diseksiyon
- PBS (1X) bir damla temiz bir cam slayt üzerinde ince diseksiyon yapılmalıdır.
- Utricular otolit kesecik iki çift ince cımbız ile çıkarın ve eğer istenirse, ince cımbız bir çift ve bir iğne bıçağı ile keserek olmayan duyu epitel doku ve epitel innervasyon.
- Sakküler ve lagenar epitel ayıran tüm Kesecik mümkün olduğunca sağlam tutmak için çalışırken önce lagenar otolit çıkarın. PBS ventral yüzü yukarı açılan doku yerleştirin. Iğne Kesecik ve lagena arasında dikkatli bir şekilde kesmek için bıçak kullanın. Eğer istenirse, aşırı olmayan duyu epitel doku ve ince cımbız ve iğne bıçağı ile innvervation kesin.
Bölüm 4: duyu epitel saç hücrelerinin Floresan boyama
- PBT (1XPBS ve% 1 Triton X-100) ile 3 kez, 5 dakika, her zaman için duyusal epitelde durulayın.
- Ile epitel inkübe fluophore Phalloidin (örneğin Alexa Un 488 Phalloidin, 1:1,000 seyreltme) etiketli oda sıcaklığında 30 dakika.
- 3 kez, 10 dakika her zaman için PBT duyusal epitelde durulayın.
- Epitelde orta montaj bir slayt üzerine monte edin ve lekeli doku uygun dalga boyu filtreler ile floresan mikroskop altında kontrol edin.
- Başarılı diseksiyon ve boyama sonra, sağlam, güçlü bir saç hücresi paket boyası ile epitel (Şekil 1) mikroskop altında görülebilir.
Şekil 1. Sakküler duyu epitel Saç hücreleri Alexa Un 488 Phalloidin (Yeşil) ile boyandı. Doku örneği yazıda da belirtildiği gibi disseke ve boyandı. Birçok resim, farklı pozisyonlarda örnek alınan ve Adobe Photoshop 7.0 ile birlikte kiremitli.
Ölçek çubuğu = 150μm.
Discussion
Bu protokol, biz bize duyu epitel hücre ve hücre içi eğitim için doku örneği hazırlamak için yetişkin zebrafish, iç kulak duyu epiteli, kaba ve ince diseksiyon nitelendirdi.
Başarılı bir diseksiyon, ilk adım, fiksasyon yürütmek için çok önemlidir. Eski çözüm diseksiyonu sırasında ele sert dokuların altında fiksasyon neden olacaktır, çünkü her zaman taze hazırlanmış paraformaldehid çözüm emin olun. Ancak, diseksiyonu sonra immün / histolojik boyama sonuçları ile müdahale edecektir, çünkü, çok uzun süre tespit çözüm bırakarak dokuların aşırı düzeltmez olduğunu emin olun. Buna ek olarak, uygun boyutlarda bakımlı diseksiyon araçları kullanarak, özellikle ince diseksiyon için de kritik öneme sahiptir.
Bu brüt diseksiyon protokolü doku-spesifik DNA'lar / RNA / protein çıkarılması için iç kulak dokusu elde etmek için de adapte edilebilir. Bu durumda, diseksiyon sağ paraformaldehid fiksasyon olmadan balık kurban sonra yürütülen olmalıdır. Buna ek olarak, bazı rutin yöntemleri hedef makromoleküllerin bozulması korumak için kullanılabilir. Örneğin, doku-spesifik RNA ekstraksiyonu için diseksiyon sırasında balık kafası (alt çene kaldırılır) durulanır ve ardından RNAlater solüsyonu (Ambion) dalmış.
Acknowledgments
Bu araştırma, Ulusal İnsan Genomu Araştırma Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri İntramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir.
Materials
|Name||Type||Company||Catalog Number||Comments|
|MS222 (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt)||Reagent||Sigma-Aldrich||A5040|
|PBS (Phosphate-buffered Saline, 10X)||Reagent||Mediatech, Inc.||46-013-CM|
|Paraformaldehyde||Reagent||Sigma-Aldrich||P-6148|
|Triton X-100||Reagent||Sigma-Aldrich||T8787|
|Alexa Fluor 488 phalloidin||Reagent||Invitrogen||A12379|
|VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI||Reagent||Vector Laboratories||H-1500|
|Dissection microscope||Microscope||Nikon Instruments||SMZ1000|
|Insect pins||Tool||Fine Science Tools||26000-40|
|Scissors||Tool||Roboz Surgical Instruments Co.||RS-5880|
|Tweezers||Tool||Roboz Surgical Instruments Co.||RS-5045|
|Needle blade||Tool||Sharpoint||78-6810|
|Fluorescent microscope||Microscope||Carl Zeiss, Inc.||Axiovert 200M|
|Dissection pad||Tool||eNasco||SB07840M|
|Zebrafish||Animal||Various||n/a|