Tüm gram negatif bakteriler, mikroskopta genellikle pembe renkli küçük çubuklar şeklinde görünürler.
Gram negatif bakterilerin tür tespitinde başvurulabilecek 5 yol vardır:
1. Karbonhidrat fermentasyon testi
2. SIM Test (Hidrojen-Sülfit, İndol, Motility (Hareket))
3. Sitrat testi
4. Phenylalanine Deaminase (PA)Testi
5. Ürease Testi
Gram negatif bakteriler genellikle, Mac Conkey Agar’da kültüve edilirler. Bu besiyeri, gram-pozitif bakterileri inhibe etmek amacıyla safra tuzları ve kristal viole içermektedir. Yine agarın içindeki laktoz ve nötral red boyası, pH değişikliğini gösterir. Laktoz pozitif koloniler, kırmızı-pembe görünür.
Karbonhidrat Fermentasyon Testi:
· Genellikle pH indikatörü olarak fenol red içeren bir brot ile yapılır
· Bu brotlar Phenol Red Broth veya Lactose Red Broth olabilir.
· Mikrorganizmanın karbonhidratı fermente etmesi sırasında oluşan gaz çıkışını gözlemleyebilmek için, test tüplerinin içine Durham tüpleri de konulmuş olmalı.
· Mikroorganizmanın laktozu glukoza ve galaktoza çevirebilmesi için beta-galaktosidaz içermesi gereklidir.
· Organizma basit şekerleri fermente ettiğinde, asidik son ürünler ortaya çıkar. Bunlar daha düşük pH değerlerindedirler ve brotun rengini sarıya değiştirirler.
Test sonucunda:
1. Negatif : Kırmızı brot – fermentasyon yok
2. A/G Pozitif: Asit ve Durham tüplerinde gaz çıkışı var ve brotun rengi sarıya dönmüş
3. Asit pozitif: Besiyerinin rengi sarıya dönmüş; fakat gaz çıkışı yok.
SIM Testi:
· Öze ile alınan kültür SIM Agar’a direkt batırma yoluyla inokule edilir.
· SIM Medium, aminoasitleri metabolize edebilen mikroorganizmaların tespitinde kullanılır.
· SIM medium ile 3 ayrı test yapılır
>>> Hidrojen Sülfit (H₂S)
Cystamin ve Metathiamine sülfür içerir. Organizma bunları metabolize edebilirse, hidrojen oluşumu gerçekleşir.§ Agardaki kurşun nitrat hidrojen sülfiti tutar, kurşun sülfit oluşumuna bağlı olarak siyah bir çökelme meydana gelir. Hidrojen sülfit pozitif durumlarda agar, siyah renk alır.
Negatif durumda, besiyeri renginde değişiklik olmaz.
>>>İndol
Aromatik aminoasit triptofan, besiyeri içerisinde bulunmaktadır. Bakteri bu amino grup molekülünü ve indolü kırabilirse, test pozitif sonuç verir.
Bakteri gelişmesini tamamladıktan sonra, Kovac’s ayıracı indol ile reaksiyona girecek ve tüp yüzeyinde parlak kırmızı bir halka oluşturacaktır.
Test negatif ise, kovac’s ayıracı eklendiğinde renkte bir değişiklik olmaz.
>>> Motility (Hareket)
Organizma hareketliyse, ekim hattının dışına taşar ve mediumda bulanıklık oluşturur.
Eğer hareket negatifse, üreme, ekimin yapıldığı hat üzerinde kalır.
Sitrat Testi:
Tüpte yatık agar şeklinde hazırlanmış, yeşil renkli sitrat agarın yüzeyine bakteri ile eğik çizme ekimi yapılır.
Sitrat Agar, bir trikarboksilik asit olan sitrik asit ve Brom Cresol Agar içerir.
Sitrat permeazlı bakteriler sitrik asidi yükseltgeyerek alkalin son ürün oluşumuna yol açarlar. Bu da pH değişikliğine yol açarak, besiyerinin rengini maviye çevirir.
– Test pozitifse, renk maviye döner.
– Test negatifse, besiyeri yeşil kalır.
Phenylalanine Deaminase (PA) Testi:
Bakteri kültürü yatık agar yüzeyine sürülür.
Phenylalanine aromatik bir aminoasittir.
Eğer bakteri phenylalanine deaminase’ı tutarsa, amino grubu uzaklaştırabilir; geriye phenylpyruvic asit kalır.
Testi tamamlamak için, agar yüzeyine %5’lik ferik klorid solusyonu eklenir.
Eğer test pozitifse, agar yüzeyi zeytin yeşiline döner.
Eğer test negatifse, herhangi bir değişiklik olmaz.
Proteus ailesi üyeleri bu teste genellikle pozitif sonuç verirler.
Urease Testi:
Test için kullanılan medium, düşük konsantrasyonda fenol red indikatörü içeren, turuncu renkli Urea Broth’dur.
Normalde zehirli bir madde olan üre, aminoasit metabolizmasının en son ürünüdür. Bazı organizmalar ürease içerebilirler; bu da üreyi, karbondioksit ve ammonia formunda parçalamalarını sağlar. Ammonia su ile reaksiyona girerek ammonium hydroxide oluşturur.
Eğer test pozitifse, ammonium hydroxide oluşumuna bağlı olarak, brot kırmızı renk alır.
Eğer sonuç negatifse, brotun kendi rengi olan turuncu renk değişmez.