Summary
Su sütunu çapı 0.22μm ve 2.7μm arasında değişen mikrobiyal biyokütle Bu video belgeleri büyük hacimli filtrasyon (≥ 20 L).
Cite this ArticleCopy Citation | Download Citations
Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large Volume (20L+) Filtration of Coastal Seawater Samples. J. Vis. Exp. (28), e1161, doi:10.3791/1161 (2009).
Translate text to:
Please note that all translations are automatically generated.
Abstract
İş akışı downstream mikrobiyal topluluk için kıyı deniz sularında, besin ve iz gaz analizleri toplanması ile başlar. Bu yöntem için Saanich'dan Giriş HMS John Strickland işletim güverte, örnekler toplandı. Su sütunu çapı 0.22μm ve 2.7μm arasında değişen mikrobiyal biyokütle Bu video belgeleri büyük hacimli filtrasyon (≥ 20 L). İki 20L örnekleri dört dönen başkanları ile donatılmış tek bir pompa ünitesi kullanılarak aynı anda filtre edilebilir. Filtreleme alanında uzun yolculuklar yapılabilir, ya da hemen günübirlik geziler için döndükten sonra. Her bir sterivex filtre ünitesi üzerinden geçen su miktarını kaydetmek için önemlidir. Örnekleme gezileri arasında biyofilm oluşumunu önlemek için tüm filtrasyon ekipmanları seyreltik HCl ve deiyonize su ile durulanır ve kullanımdan hemen sonra otoklava olmalıdır. Bu işlem yaklaşık 5 saat artı temizlik için ek bir saat sürer.
Protocol
- Filtrasyon aparatı ayarlayın
- Filtrasyon cihazı kurmak için ön filtre konut içine bir not GF / D filtre yerleştirmek için cımbız kullanın. Gevşek el konut sıkın. Genel bir kural olarak, aşırı sıkmayın ya da birim pompa başladığında kaçağına sebep olur.
- Dokunmadan dikkatlice damacana iç boru içine sokarak otoklavlanmış kap ve ekli boru ile damacana kapağı değiştirin. Gerekirse, damacana tüp kılavuzu için cımbız kullanın.
- Peristaltik pompa ile dış boru geçirin.
- Ön filtre, hem de harici tüpler (yani her 2 adet damacana) sonuna kadar konut takın. Pense ile bağlantı sıkın.
- Deniz suyu filtre
- Deniz suyu filtreleme başlamak için, pompa açmak ve 1 akış hızını ayarlamak. Bu doğru yönde su pompalanan sağlamak için izleyin.
- 500 ml su ön filtre ünitesi ve 1 L Beher içine serbestçe dolaşmasına izin verin.
- Pompa kapatın ve ön filtre kurulum ücretsiz sonunda erkek luer uydurma bir Sterivex filtre takmak. Ön filtreyi konut rahatça el ile sıkın.
- , Ön filtre konut ve ön filtre konut ve damacana yol açan tüp arasındaki bağlantıyı izleyin. Sızıntıları varsa, pompa kapatmak ve gevşetin ve buna bağlı olarak ön filtre konut sıkın. Pompa geri çevirin.
- 4 L şişeler süzüntü toplayın. Bir kez onlar temiz bir damacana içine şişeler, boş dolu. Her filtre geçerek hacmi not ettiğinizden emin olun. Toplanan süzüntü, virüs filtrasyon gibi, ileri işlenmiş olabilir.
- Bidonlarda su kalana kadar filtreleme devam edin. 4-5 saat / 20 L damacana arasında Olağan filtrasyon kez aralık, ancak, bu su içinde biyokütle miktarı önemli ölçüde bağlıdır.
- Filtrasyon işlemi tamamlandıktan sonra, pompayı kapatın ve Sterivex filtreler kesmek.
- Filtrelerin Depolama
- Filtrelerin saklamak için, ilk defa 30-60 ml şırınga ile kalan suyu dışarı atmak.
- Bir pipet kullanarak, daha sonra ek reaktifler filtre alanı yaklaşık 200 ül tutarak, filtre 1.8ml lizis tamponu ekleyin.
- Parafilm küçük bir parça ile alt ve üst Sterivex filtrenin Seal, ve tarih ve örnek tanımlama filtreleri etiket.
- Bir ön-etiketli 50 ml şahin tüp filtreler Mağaza -80 ° C
- Konut filtreleri çıkarın ve 2 ml lizis tamponu içeren etiketli 50 ml Falcon tüp içine yerleştirin. Bu Mağaza -80 ° C
- Temizleme
- Son temizliği için, 0,1 M HCl içeren bir balona damacana içindeki hortum
- Orijinal damacana 4L balonuna yol tüp Doğrudan.
- Pompa açın ve orijinal damacana çalışma akışını toplamak, 3 çalışmasını.
- Son olarak, boru otoklava su ile durulayın.
Temsilcisi Sonuçlar: Elde edilen sonuç, iki Sterivix filtreler 0.22μm ve 2.7μm boyut aralığı içinde yaklaşık 10 litre deniz suyundan mikrobiyal biyokütle içeren her oluşur. Bu lizis tamponu saklanır ve DNA ekstraksiyonu için hazırdır. Buna ek olarak, bu yordamı toplar ve GF / D ön filtre, 2.7 mm daha fazla biyokütle yoğunlaşmaktadır. Bu da lizis tamponu saklanır ve DNA ekstraksiyonu için hazırdır. Ek işleme adımlar atıldığı takdirde, flow-through 0.22 mcM de viral bir kısmını toplamak için aşağı konsantre olabilir.
Discussion
Tezgahları ve pompalar, aksi takdirde ekipman paslanmasına neden olur tuzlu su herhangi bir kalıcı izlerini kaldırmak için kullanımdan sonra nemli bir havlu ile temizlemek için şarttır. Işlem basit olmasına rağmen, zaman gereksinimi süzülen örnek biyokütle ya da enkaz konsantrasyonuna bağlı olarak geniş olabilir.
Acknowledgments
Yenilik, British Columbia Bilgi Kalkınma Fonu ve Ulusal Bilimler ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) Kanada Kanada Vakfı Biz, kıyı ve açık okyanus sularında düşük oksijen bölgelerde devam eden çalışmalar destek için teşekkür etmek istiyorum. DAW NSERC, Killam ve TULA vakıf Mikrobiyal Çeşitlilik ve Evrim finanse Merkezi burs tarafından desteklenmiştir.
Materials
|Name||Type||Company||Catalog Number||Comments|
|Peristaltic pump||Masterflex (Cole Palmer)||77913-20, 77200-62, 77200-04|
|Tygon LFL tubing||Masterflex (Cole Palmer)||06429-24||For filtration apparatus|
|Hose clamps||Cole-Parmer||0683204||For filtration apparatus|
|1/4” x 3/16” pipe adaptors||Cole-Parmer||31702-20||For filtration apparatus|
|Polypropylene prefilter housing||ADVANTEC||501200||For filtration apparatus|
|Metal luer fitting (Hose end to Male luer lock)||Cole-Parmer||31507-27||For filtration apparatus|
|2“ Magnets||For filtration apparatus|
|3 port carboy caps||For filtration apparatus|
|GV 0.22 μm STERIVIX filters||EMD Millipore||SVGV01R5|
|47 mm diameter 2.7 μm GF/D filters||Whatman, GE Healthcare||1823047|
|Lysis buffer||Reagent||0.75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3)|
|0.1 % HCl||Reagent||For post-filtration rinse|
|Autoclaved water||Reagent||For post-filtration rinse|