1 BÖLÜM 8 Numune Alma, Standardizasyon ve Kalibrasyon
2 Bölüm 8. Numune Alma, Standardizasyon ve Kalibrasyon Numune alma: Kimyasal analizlerde en önemli işlemlerden biridir. Eldeki numunenin sadece küçük bir kesri kullanılır. Yani bir kimyasal analiz, bileşimi ile ilgilenilen maddenin sadece küçük bir kısmı üzerinde yapılır. Sonuçların bir değer ifade etmesi için, bu kısmın bileşimi ana maddenin bileşimini mümkün olduğu kadar yansıtmalıdır.Numune alma süreci, analizlenecek malzemeyi doğru temsil eden, az miktarda bir madde alarak başlar.Analitik işlem, bilindiği üzere (bkz. Bölüm 1) çeşitli basamaklardan oluşmaktadır. Hatırlanacağı gibi önce yöntem seçilir. Daha sonra numune alınarak analize başlanır. Numune alma, bir malzemeden (popülasyondan) alınan, miktarı bu popülasyona göre çok az olan fakat popülasyonun bileşimini temsil eden kısmını homojen bir örneğe dönüştürme demektir. Bu yüzden, numune alma bir analizin en zor basamağıdır. Numuneler analizlenir, ancak bileşenler ve derişimler tayin edilir.
3 Kullanılan numune miktarına göre yapılan bir analizi sınıflandırabiliriz: Analiz sınıfı> 0,1 gMakro0,01 - 0,1 gYarımikro0,0001 – 0,01 gMikro< 10-4 gUltramikroBileşen Tipi
4 Analizi yapılacak malzemeden önce bir ham numune alınır Analizi yapılacak malzemeden önce bir ham numune alınır. Daha sonra ham numuneden daha küçük bir kısım seçilir ve homojenleştirilerek laboratuar numunesine dönüştürülür. Ham numunenin ve laboratuar numunesinin bileşimi, analizlenecek malzemenin tamamının ortalama bileşimine çok yakın olmalıdır. Ayrıca laboratuar numunesi, ham numune ile aynı sayıda tanecik içermelidir.Laboratuvar numunesi alma basamaklarıLaboratuvar numunesi, birkaç gramdan birkaç yüz grama kadar değişir. Bu numune, alındığı malzemenin milyarda 10 ile 100’ü arasında olabilir.
6 İstatistiksel bakımdan, popülasyon ortalamasına uyan bir ortalama değer ve popülasyon varyansına uygun bir varyans elde etmek için rasgele numune alınmalıdır.Ham numune, ideal olarak analiz edilecek maddenin toplam kütlesinin küçük bir kopyasıdır ya da tek tek alınmış numune kısımlarının toplamıdır. Aynı zamanda ham numune, sadece kimyasal bileşim bakımından değil, tanecik boyutu dağılımı bakımından da bütünü temsil etmelidir.Ham numunenin homojen olması için analiz edilecek sıvı veya gaz, mümkünse numune almadan önce iyice karıştırılmalıdır. Büyük hacimli çözeltiler durumunda, karıştırma mümkün olmayabilir. Bu durumlarda çözeltinin istenen herhangi bir derinliğinde açılarak dolabilen numune alma şişelerinden yararlanılarak, kabın çeşitli kısımlarından numuneler alınır.Pek çok laboratuar, güvenilirliği ve ucuzluğu için, otomatik numune hazırlama yöntemlerini tercih eder. Otomatik numune hazırlama, analiz süresini kısaltır, sonuçların güvenilirliği ve analiz maliyeti bakımından üstünlük sağlar.
7 Standardizasyon ve Kalibrasyon: Kalibrasyon, analit derişimi ile analitik sinyal (cevap) arasındaki ilişkiyi belirleme işlemidir. Bu ilişki belirlenirken, kimyasal standartlar kullanılır.Örneğin; bir numunede spektroskopik olarak arsenik derişimi bulunurken, önce derişimleri bilinen bir seri arsenik standart çözeltisinin absorbansı alınır (dış standart ile kalibrasyon). Bu şekilde kalibre edildikten sonra, bilinmeyen numunenin absorbansı ölçülür ve söz konusu ölçümün, absorbans skalasında karşılık geldiği derişim bulunur. Dış standart numuneden ayrı olarak hazırlanan standarttır, oysa iç standart numunenin kendisine eklenir.Hemen her analitik yöntem, kimyasal standartlar ile bir ön kalibrasyon gerektirir.Analitik işlemler arasında en doğru sonuç veren kalibrasyon işlemlerinden birisi de titrasyonlardır. Bir titrasyonda analitin miktarı, ayarlı bir reaktif ile eşdeğerlik noktasına kadar titre edilerek bulunur (kimyasal karşılaştırma). Çünkü analit ayarlı titrant ile bilinen stokiyometride bir reaksiyon verir. Kimyasal eşdeğerliğe ulaşmak için gerekli ayarlı çözelti hacminden analit miktarı hesaplanır.Buna karşın, gravimetrik ve bazı kulometrik yöntemler ise kimyasal standartlarla kalibrasyon gerekmeksizin uygulanabilmektedir.
8 Bir hidrokarbon karışımında, Kalibrasyon, bilinen analit derişimine karşı sinyal büyüklüğü (absorbans, pik yüksekliği, pik alanı vb.) okunarak yapılır. Veriler, grafiğe alınarak veya en küçük kareler yönteminde kullanılan doğrusal ilişki gibi uygun bir matematik denklemde yerine konularak, bir kalibrasyon grafiği hazırlanır. Tahmin basamağı denilen ikinci adımda, numune için bulunan sinyal şiddetinden, bilinmeyen analit derişimi bulunur. Bu adımda, kalibrasyon grafiği veya verilere uyan en iyi denklem (y = mx+b) kullanılır. Ayrıca her bir noktanın grafikten dikey sapmasına da kayma denir.Bağımlı değişkenBağımsız değişkenBir hidrokarbon karışımında,kalibrasyon grafiği.
9 (regresyon denklemi) y = mx + b En küçük kareler yöntemi:Bir seri standardın artan derişimleri, tekabül ettikleri sinyallere (absorbans, pik akımı gibi) karşı grafiğe geçirildiğinde, genellikle doğrusal eğriler elde edilir (kalibrasyon eğrileri/doğruları).Ancak bazı verilerin doğrusal eğrilerden saptığı da (belirsiz hatalar sebebiyle) görülür. Bu şekilde elde edilen doğrular ile yapılacak işlemlerin belirsizliklerinin bulunması için regresyon (eğri uydurma) analizi yapılmalıdır.Buna göre ölçülen sinyal büyüklüğü (y) ile standart analit derişimi (x) arasındaki doğrusal olduğu varsayılan ilişkiyi matematiksel olarak regresyon modeli ile bulabiliriz:(regresyon denklemi) y = mx + bSöz konusu modelde, x’deki belirsizlik ihmal edilebilir düzeyde ise, doğrusal en küçük kareler yöntemi ile veri takımına en iyi uyan doğru elde edilebilir. (excel de bulunabilir)
10 Bir doğrunun eğim-başlangıç ordinatı tanımları. En küçük kareler yöntemi ile bulunan doğru, bütün noktaların kaymalarının kareleri toplanınca, en küçük değeri veren doğrudur.Böylece deneysel noktalara en iyi uyan doğru elde edilmiş olur.Bir başka önemli büyüklük olan tayin katsayısı (R2) değeri ise, y’nin gözlenen değişim kesrinin bir ölçüsüdür. Bu değişim, x ve y arasındaki doğrusal ilişki ile açıklanır. R2 değeri 1’e ne kadar yakınsa, doğrusal modelin y’deki değişimi o kadar iyi açıklandığı yorumu yapılır.
11 SORU: Çizelge 8-1’in ilk iki sütunundaki, deneysel verileri kullanarak bir en küçük kareler analizi uygulayınız.SORU: Yukarıdaki örnekte elde edilen kalibrasyon grafiği, bir hidrokarbonlar karışımında izo-oktanın kromatografik tayini için kullanılmıştır. 2,65’lik pik alanı elde edilmiştir. Alan (a) tek bir ölçümün sonucu ve (b) dört ölçümün ortalaması olduğunda, karışımdaki izo-oktanın mol yüzdesini ve standart sapmayı hesaplayınız.
16 Analitik İşlemlerde Hataların Azaltılması İç standart (internal standart, IS) yöntemi: IS, bir analizde bilinen bir miktarda, numuneye, şahit (kör) numuneye ve kalibrasyon standartlarına eşit miktarlarda eklenen, kimyasal ve fiziksel bakımdan analite benzer bir maddedir. Bu durumda, analit sinyalini doğrudan kullanmak yerine, analit sinyalinin referans tür sinyaline oranı kullanılır. Çizilen grafikte y eksenine sinyaller oranı ve x eksenine de standartlardaki analit derişimi işaretlenir. Yani kalibrasyon grafiği, analit sinyalinin iç standart sinyaline oranı, analit derişimine karşı işaretlenerek çizilir. IS uygun olarak seçilmişse, hem sistematik hem de rastgele hataların bazıları giderilebilir. Matriks etkileri de giderilebilir. Aynı zamanda, IS hem numunelere hem standartlara eklendiği zaman, tekrarlanabilir sonuç elde etmek de önemlidir. IS nin numune matriksi içinde kesinlikle bulunmadığını da bilmek gerekir. IS olarak genelde çok az rastlanan ve numunede bulunmadığı bilinen maddeler seçilir. Bu maddeler, analit ile aynı yerde sinyal vermemelidir. Ancak kimyasal özellikleriyle analite benzemelidir. IS, numune ve standardın ana bileşeni ise, numuneyi alma gibi yerlerden kaynaklı hatalar da giderilebilir. Spektroskopik ve kromatografik yöntemlerde sıklıkla iç standart yöntemi kullanılır.
17 Aanalit/Aiç standartÖRNEK: Kandaki sodyum ve potasyum tayinlerinde, lityum iyi bir iç standarttır. Çünkü kimyasal davranışı sodyum ve potasyuma benzemekle beraber kanda bulunmaz.Sodyumun alev emisyonla tayininde, çoğu zaman iç standart olarak lityum katılır. Na ve 1000 ppm Li içeren çözeltiler için aşağıdaki veriler elde edilmiştir.
18 Alev Spektrometri ile iç standart eklenerek yapılan Na tayini: (emisyon şiddeti)ppm Na I (Na) I (Li) I(Na)/I(Li)0,1 0, ,00130,5 0, ,00651 1, ,01415 5,9 91 0,064810 9,5 73 0,1301Standartlara ve bilinmeyene 1000 ppm Li eklenmiştir.? 4,4 95 0,0463(Bilinmeyen)r2= 0,9999r2 = 0,99074,44,4/95=0,04634,633,57
19 Normal kalibrasyon grafiği İç standart kullanılıncaSodyumun alev emisyon tayini için iç standart yöntemini gösteren hesap çizelgesi. İç standart kullanılınca, alttaki kalibrasyon grafiğinde ortaya çıkan iyileşmeye dikkat ediniz.19
20 Derişime (c) karşı sinyal şiddeti (R) grafiği Derişime (c) karşı sinyal şiddeti (R) grafiği. Kalibrasyon grafiğinin eğimine, kalibrasyon duyarlığı (m) denir. Gözlenebilme sınırı (DL), belli bir güvenilirlik seviyesinde ölçülebilen en düşük derişimi ifade eder.