We are searching data for your request:
Upon completion, a link will appear to access the found materials.
Islak laboratuarda çalışmıyorum ve yere serme teknikleri hakkında tüm detayları bilmiyorum.
Sorum şu:
lncRNA yıkımı nasıl yapılır?
Örneğin - lncRNA'nız var, yani çekirdekte işlevsel. iRNA kullanarak nakavt yapmak nasıl mümkün olabilir? girişim sadece sitoplazmada olur?
Sorumda biyoloji ile ilgili yanlış anlama varsa özür dilerim.
Memelilerde lncRNA'nın yıkılması, RNAi yoluyla yapılmaz. Bunun yerine, RNA'ya bağlanan antisens DNA oligoları aktarılır. Bu, RNA-DNA duplekslerini bozan RNase H enziminin etkisini tetikler. lncRNA'yı bozar.
GÜNCELLEME: Referans olarak, bunu bir seminerden öğrendim ve çok iyi belgelenmemiş, ancak bazı literatür araştırmasından sonra bu makaleyi alıntı yapmak için buldum:
Her ne kadar biz (Şekil 3A) ve diğerleri (42, 49) NEAT1 lncRNA'yı yıkmak için siRNA kullanmış olsak ve kesinlikle nükleer RNA'ların yıkılması iyi tanımlanmış olsa da (53, 54), NEAT1'in çoğunlukla nükleer olduğu için endişe duymaya devam ettik. RNA (55), RNAi makineleri tarafından çok verimli bir şekilde hedeflenmeyebilir. Ancak nükleer RNA'lar, RNA'yı parçalamak için nükleer RNaz H aktivitesini alan tamamlayıcı antisens (AS) oligodeoksinükleotitleri kullanılarak yetkin bir şekilde hedeflenir (56). Bu nedenle, HIV-1 NL4-3 ile enfekte Jurkat hücrelerinde NEAT1 lncRNA'yı yıkmak için tamamlayıcı AS oligodeoksinükleotitlerini de kullandık (Şekil 4C, sol). AS yaklaşımı NEAT1'i azalttı (Şekil 4C, sol) ve HIV-1 p24 üretimini artırdı (Şekil 4C, sağ), NEAT1'in siRNA aracılı yıkımından elde edilenlerle tutarlı sonuçlar verdi (Şekil 4A ve B).
Nükleer RNAi gerçekleşir… şu makalelere bakın:
http://www.nature.com/nrg/journal/v14/n2/execsumm/nrg3355.html
http://nar.oxfordjournals.org/content/early/2011/11/07/nar.gkr891.full
Ayrıca Ago2'nin lncRNA'lara bağlandığına dair bazı kanıtlar vardır.
Bununla birlikte, örneğin lncRNA'ları yıkmak için başka teknikler de kullanabilirsiniz. ribozimler.
Bu tartışmalıdır, ancak bu alandaki çoğu grup, Ago'nun varlığına rağmen RNAi'nin çekirdekte çalışmadığı sonucuna varmıştır. lncRNA, RNAi ile KD'lendiğinde, genellikle hem çekirdekte hem de sitoplazmada mevcut oldukları gösterilir ve KD'nin çekirdekte değil sitoplazmada meydana geldiği düşünülür. Elbette her zaman olduğu gibi biyolojide de nükleer RNAi'nin bazı hücre tiplerinde veya bazı özel koşullar altında meydana gelmesi mümkündür. RNAseH aracılığıyla hareket eden Gapmer oligonükleotitleri genellikle bir nükleer lncRNA'yı KD için mükemmel bir yoldur, ancak etkinlik tahmin edilemez olduğundan ve RNAi'nin aksine, 6 veya daha fazla farklı oligoyu test etmeye hazırlıklı olmanız gerektiğini ekleyeceğim. antisens oligo tasarımı için genel olarak mevcut algoritmalar.
Uzun Kodlamayan RNA CCAT2'nin Yıkılması, Glioma Hücrelerinde Hücresel Çoğalma, İstila ve Epitelyal Mezenkimal Geçişi Engeller
Bağlantılar: 1: Enfeksiyon Kontrol Departmanı, Taihe Hastanesi, Hubei Tıp Üniversitesi, Shiyan, Hubei Eyaleti, Çin Halk Cumhuriyeti 2: Nöroşirürji Departmanı, Renmin Hastanesi, Hubei Tıp Üniversitesi, Shiyan, Hubei Eyaleti, Çin Halk Cumhuriyeti 3: PET Merkezi Bölümü ve Anesteziyoloji ve Ağrı Enstitüsü, Taihe Hastanesi, Hubei Tıp Üniversitesi, Shiyan, Hubei Eyaleti, Çin Halk Cumhuriyeti
Yayın tarihi: 5 yıl 2017 г.
Bu makale çevrimiçi olarak 17 ноября 2016 г. başlıklı bir Fast Track makalesi olarak: "Uzun kodlamayan RNA CCAT2'nin yıkılması, glioma hücrelerinde hücresel çoğalmayı, istilayı ve EMT'yi engeller".
Eskiden: Kansere Karşı İlaç Tasarımını İçeren Onkoloji Araştırması
Preklinik ve Klinik Kanser Terapötiklerini İçeren Onkoloji Araştırmaları, moleküler biyoloji, hücre biyolojisi, biyokimya, biyofizik, genetik, biyoloji, endokrinoloji ve immünoloji alanlarında kanserin anlaşılmasına katkıda bulunan en yüksek kalitede araştırmaların yanı sıra mekanizma üzerine yapılan çalışmaları yayınlar. kanserojenlerin ve terapötik ajanların etkileri, kanser önleme ve epidemiyoloji ile ilgili raporlar ve etkili yeni terapötik rejimleri tanımlayan klinik deneyler.
Cilt 23'ten itibaren, Klinik Öncesi ve Klinik Kanser Tedavisine Sahip Onkoloji Araştırması, Creative Commons CC BY-NC-ND lisansı koşulları altında Açık Erişim'dir.
Uzun kodlamayan RNA'nın (lncRNA) yıkılması - nasıl yapılır? - Biyoloji
Veritabanlarımızdan seçilen içeriğin makine çevirisini talep ettiniz. Bu işlevsellik yalnızca size kolaylık sağlamak için sağlanmıştır ve hiçbir şekilde insan çevirisinin yerini alması amaçlanmamıştır. Ne BioOne ne de içeriğin sahipleri ve yayıncıları, çeviri özelliğinin işlevselliği veya içeriğin doğruluğu veya eksiksizliği ile ilgili beyanlar ve garantiler dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere, herhangi bir açık veya zımni beyan veya garanti vermez ve açıkça reddederler. çeviriler.
Çeviriler sistemimizde tutulmaz. Bu özelliği ve çevirileri kullanımınız, BioOne web sitesinin Kullanım Hüküm ve Koşullarında yer alan tüm kullanım kısıtlamalarına tabidir.
Uzun kodlamayan RNA CCDC144NL-AS1'in yıkılması, endometriyal stromal hücrelerde endometriozdan göç ve istila fenotiplerini azaltır
Chen Zhang, 1 Wei Wu, 2 Honglan Zhu, 3 Xiaoming Yu, 4 Yinli Zhang, 5 Xue Ye, 1 Hongyan Cheng, 1 Ruiqiong Ma, 1 Heng Cui, 1 Jianjun Luo />https://orcid.org/0000- 0002-5550-9889 , 2,* Jing Guan, 4,* Xiaohong Chang />https://orcid.org/0000-0002-9879-2266 1,**
1 1Jinekolojik Onkoloji Merkezi, Pekin Üniversitesi Halk Hastanesi, Pekin, Çin
2 2Key RNA Biyoloji Laboratuvarı, Biyofizik Enstitüsü, Çin Bilimler Akademisi, Pekin, Çin
3 3Pekin Üniversitesi Halk Hastanesi, Doğum ve Jinekoloji Bölümü, Pekin, Çin
4 4Üreme Tıbbı Merkezi, Pekin Üniversitesi Halk Hastanesi, Pekin, Çin
5 5Pekin Üniversitesi Halk Hastanesi, Patoloji Bölümü, Pekin, Çin
* JL ve JG ortaklaşa bu çalışmayı yönetmiştir ve ortak yazarlar olarak düşünülmelidir.
** Yazışma: Jinekolojik Onkoloji Merkezi, Pekin Üniversitesi Halk Hastanesi, No. 11 Xizhimen Güney Caddesi, Xicheng Bölgesi, Pekin 100044, Çin. Tel: +86-10-88324473 Faks: +86-10-88324472 E-posta: [email protected]
Mevcut olduğunda PDF ve HTML içerir
Bu makale yalnızca aboneler.
Tek tek satışı yoktur.
Endometriozis (EM), multifaktöriyel olduğu tespit edilen gizemli ve karmaşık bir hastalıktır. Son çalışmalar, uzun kodlamayan RNA'ların (lncRNA'lar) EM'nin patogenezinde önemli bir rol oynadığını göstermiştir. Bununla birlikte, EM'deki lncRNA'ların fonksiyonel ve biyolojik mekanizmaları bilinmemektedir. Burada, yumurtalık EM'li hastalardan alınan dört çift ektopik endometriyal (EC) doku ve ötopik endometriyal (EU) dokuların lncRNA ekspresyon profillerini karşılaştırmak için mikrodizi analizleri gerçekleştirdik. Yeni bir lncRNA, CCDC144NL-AS1, potansiyel olarak işlevsel olarak tanımlandı. CCDC144NL-AS1 ekspresyonu, AB ve normal endometriyal (NE) dokulara kıyasla EC dokularında yukarı doğru düzenlenmiştir. EM'li hastaların %86,7'sinde (26/30) EC dokularında ekspresyonu AB dokularından daha yüksekti. Revize edilmiş Amerikan Doğurganlık Derneği (rAFS) evrelerine göre önemli bir artış olmamasına rağmen, evre VI EM vakalarının yaklaşık %60'ı evre II-III vakalarından çok daha yüksek CCDC144NL-AS1 seviyeleri sergiledi. Hücre altı parçalama, CCDC144NL-AS1'in insan EM'den türetilen ölümsüzleştirilmiş endometrial stromal hücre dizisi hEM15A'nın sitoplazmasında ve çekirdeğinde lokalize olduğunu gösterdi. CCDC144NL-AS1 tükenmesi, hEM15A hücrelerinin göçünü ve istilasını bastırdı, ancak hücre yapışması, çoğalması, apoptoz veya hücre döngüsü üzerinde hiçbir etki göstermedi. CCDC144NL-AS1'in yıkılması, negatif kontrol grubu tedavisine kıyasla sitoskeletal filamentli aktin (F-aktin) stres liflerinin dağılımını önemli ölçüde değiştirdi. Western blot analizi, CCDC144NL-AS1'in yıkılmasının vimentin filamentlerinin ve MMP-9'un protein seviyelerini azalttığını, ancak N-kadherin veya β-katenin. Toplu olarak, sonuçlarımız CCDC144NL-AS1'in EM patogenezinde rol oynayabileceğini ve yumurtalık EM'si için yeni bir hedef sağlayabileceğini göstermektedir.
Yüksek lncRNA CCDC144NL-AS1 seviyeleri, vimentin ve MMP-9'u düzenleyerek endometriyal stromal hücrelerde hücre iskeletinin yeniden düzenlenmesine, göçüne ve istilasına katkıda bulunur.
© Yazar(lar) 2018. Society for the Study of Reprodüksiyon adına Oxford University Press tarafından yayınlanmıştır. Her hakkı saklıdır. İzinler için lütfen e-posta gönderin:[email protected]
Chen Zhang , Wei Wu , Honglan Zhu , Xiaoming Yu , Yinli Zhang , Xue Ye , Hongyan Cheng , Ruiqiong Ma , Heng Cui , Jianjun Luo , Jing Guan ve Xiaohong Chang "Uzun kodlamayan RNA'nın yıkılması CCDC144NL-AS1 göçü ve istilayı hafifletir endometriozis kaynaklı endometrial stromal hücrelerde," Biyolojik Üreme 100(4), 939-949, (28 Kasım 2018). https://doi.org/10.1093/biolre/ioy252
Geliş: 25 Ağustos 2018 Kabul: 27 Kasım 2018 Yayınlanma: 28 Kasım 2018
SONUÇLAR VE TARTIŞMA
NS Meyve sineği genom, dokuya ve cinsiyete özgü ifadeyi gösteren çok sayıda lncRNA'yı kodlar (16, 17). Bununla birlikte, bu transkriptlerin çoğunun işlevleri bilinmemektedir. CRISPRi tarafından lncRNA'ların transkripsiyonunun baskılanmasının, analizleri için uygulanan mevcut yöntemlerin sınırlamalarının üstesinden geleceğini düşündük ve dCas9'un endojen lncRNA lokuslarından transkripsiyonu baskılamadaki etkinliğini yeniden değerlendirmeye karar verdik. Meyve sineği hücreler. CRISPR/Cas9 sistemi, gen düzenleme için yaygın olarak kullanılmıştır. Meyve sineği ( 11, 13–14, 18–26). Ancak, CRISPRi bugüne kadar uygulanmadı. Meyve sineği.
CRISPRi'yi uygulamak için Meyve sineği hücrelerde ilk önce, daha önce tarif ettiğimize benzer şekilde, mutant Cas9 proteini ve sgRNA'nın birlikte ekspresyonuna izin veren tek bir transfeksiyon vektörü oluşturduk (14). Bu strateji, iki plazmitin birlikte transfeksiyonundan kaynaklanan deneyler arasındaki değişkenliği ortadan kaldırır. Multisistronik vektör pAc5-STABLE2-neo'dan (12) türetilen transfeksiyon vektörü pGTL-1 (Şekil 1B), transfekte edilmiş hücrelerin verimli bir şekilde seçilmesine izin veren ve stabil hücre hatları oluşturma süresini azaltan Bla R genini içerir (27 ). Ek olarak, GFP'nin varlığı, dönüştürülmüş hücrelerin kolayca izlenmesini sağlar. NLS sekansları ile çevrili ve N-terminalinde FLAG epitopu ile etiketlenmiş nükleaz aktivitesinden (dCas9) yoksun insan kodonu ile optimize edilmiş Cas9 geni, Aktin5C destekçi. Kılavuz RNA'ların optimal ekspresyonu için, U6:3–sgRNA kaseti vektöre yerleştirildi, bu promotör daha yüksek bir CRISPR/Cas9 aracılı gen düzenleme aktivitesine sahiptir. Meyve sineği, yaygın olarak kullanılan U6:2 promotörü ile karşılaştırıldığında ( 13).
Aday gen olarak seçtik roX ( R NA o n X kromozomu), dozaj telafisinde yer alan lncRNA'ları kodlayan Meyve sineği erkekler ( 28). erkeğe özgü roX RNA'lar, roX1 ve roX2Erkeklerde X'e bağlı genlerin 2 kat hiperaktivasyonu için gerekli olan MSL (erkeklere özgü) proteinlerle kompleks oluşturur ve kompleksin X kromozomu üzerinde hedeflenmesini kolaylaştırır. Genetik analiz gösteriyor ki roX1 roX2 çifte mutantlar erkek öldürücüdür ve bu ikisinden biri tarafından kurtarılır. roX1 veya roX2 cDNA, aktivitelerinde fonksiyonel fazlalık olduğunu düşündürür ( 29, 30). Şu anda, fonksiyon kaybı analizi için kullanılan aleller, lokusların veya kompleks kromozomal düzenlemelerin genomik delesyonlarıdır. Ayrıca, transkripsiyon başlatma bölgeleri ve düzenleyici unsurların kimliği belirsizliğini koruyor. Hedeflenen çoklu sgRNA'lar tasarladık. roX1 ve roX2 yer (Şekil 2A ve 3A). etkili susturma olup olmadığını belirlemek için roX RNA'lar iplik özgüllüğüne bağlıdır, hem şablon (rT) hem de şablon olmayan (rNT) iplikçik için tamamlayıcı dizileri ve öngörülen transkripsiyon başlangıç bölgelerinin yakınında seçtik. Test için, kullanarak kararlı hücre çizgileri oluşturduk. Meyve sineği her ikisini de ifade eden klon 8 hücreleri roX RNA'lar ( 31).
NS roX1 ifade, CRISPRi tarafından verimli bir şekilde susturulur. (A) şematik gösterimi Drosophila roX1 konumu ve göreli konumları roX1-sgRNA'ları hedefleme. İki transkripsiyon başlangıç sitesi vardır roX1 izoformlar üreten gen (270 nt ayrı) RA ve RB (FlyBase). RNA polimeraz şablonunu (rT, kırmızı) ve şablon olmayan (rNT, mor) zincirleri hedefleyen sgRNA'lar gösterilmiştir. arasındaki 5' intergenik bölge roX1 RA ve yukarı akış geni yin düz siyah çizgiyle gösterilir. Ok uçları, algılamak için kullanılan primerlerin konumunu işaretler. roX1 RNA (siyah) ve roX1 RA RT-qPCR analizi için izoform (mavi). (B) Klon 8 hücrelerinin kullanıldığı RT-PCR analizi, roX1 RA ve RB transkriptler. İntergenik bölgedeki dizilere özgü primerler, roX1 RA ve roX1 RB PCR amplifikasyonu için izoform kullanıldı. (C, D, E) bolluğun RT-qPCR ölçümü roX1 ve roX2 insan (C, D) veya Meyve sineği (E) dCas9 proteini ve sgRNA'lar (x ekseninde gösterildiği gibi) endojende rT veya rNT DNA zincirine tamamlayıcıdır roX1 yer. Tek sgRNA'yı (C) veya aynı anda iki kılavuz RNA'yı (D, E) ifade eden hücre çizgileri gösterilmektedir. gRNA'lar rNT7, rT8 ve rT9, roX1 transkript, tek başına veya başkalarıyla birlikte. Ancak, rT1+rT3 ve rT4+rNT5 kombinasyonları roX1 RA transkripsiyon başlatma bölgesi, insan dCas9 varlığında sadece çiftler halinde etkilidir ve Meyve sineği sırasıyla dCas9. Y ekseni, RNA'ların aşağıdakilere göre zenginleşmesini gösterir. rp49 transkript ve hedefleme olmayan bir dizi (Ctrl) içeren pGTL-1 ile transfekte edilmiş hücrelere normalize edildi. Veriler, her biri üç kopya halinde gerçekleştirilen iki biyolojik kopyadan gösterilmektedir. Hata çubukları SEM'i gösterir. %, Ctrl ile karşılaştırıldığında yüzde olarak devrilmeyi gösterir.
NS roX1 ifade, CRISPRi tarafından verimli bir şekilde susturulur. (A) şematik gösterimi Drosophila roX1 konumu ve göreli konumları roX1-sgRNA'ları hedefleme. İki transkripsiyon başlangıç sitesi vardır roX1 izoformlar üreten gen (270 nt ayrı) RA ve RB (FlyBase). RNA polimeraz şablonunu (rT, kırmızı) ve şablon olmayan (rNT, mor) zincirleri hedefleyen sgRNA'lar gösterilmiştir. arasındaki 5' intergenik bölge roX1 RA ve yukarı akış geni yin düz siyah çizgiyle gösterilir. Ok uçları, algılamak için kullanılan primerlerin konumunu işaretler. roX1 RNA (siyah) ve roX1 RA RT-qPCR analizi için izoform (mavi). (B) Klon 8 hücrelerinin kullanıldığı RT-PCR analizi, roX1 RA ve RB transkriptler. İntergenik bölgedeki dizilere özgü primerler, roX1 RA ve roX1 RB PCR amplifikasyonu için izoform kullanıldı. (C, D, E) bolluğun RT-qPCR ölçümü roX1 ve roX2 insan (C, D) veya Meyve sineği (E) dCas9 proteini ve sgRNA'lar (x ekseninde gösterildiği gibi) endojende rT veya rNT DNA zincirine tamamlayıcıdır roX1 yer. Tek sgRNA'yı (C) veya aynı anda iki kılavuz RNA'yı (D, E) ifade eden hücre çizgileri gösterilmektedir. gRNA'lar rNT7, rT8 ve rT9, roX1 transkript, tek başına veya başkalarıyla birlikte. Ancak, rT1+rT3 ve rT4+rNT5 kombinasyonları roX1 RA transkripsiyon başlatma bölgesi, insan dCas9 varlığında sadece çiftler halinde etkilidir ve Meyve sineği sırasıyla dCas9. Y ekseni, RNA'ların aşağıdakilere göre zenginleşmesini gösterir. rp49 transkript ve hedefleme olmayan bir dizi (Ctrl) içeren pGTL-1 ile transfekte edilmiş hücrelere normalize edildi. Veriler, her biri üç kopya halinde gerçekleştirilen iki biyolojik kopyadan gösterilmektedir. Hata çubukları SEM'i gösterir. %, Ctrl ile karşılaştırıldığında yüzde olarak devrilmeyi gösterir.
NS roX2 transkript, CRISPRi tarafından verimli bir şekilde aşağı regüle edilir. (A) şematik gösterimi Drosophila roX2 göreli konumlarını gösteren yer roX2 sgRNA'ları hedefleme. Transkripsiyon başlangıç bölgesi, içindeki intron bir okla işaretlenir. roX2 gen düz gri bir çizgi ile gösterilir. arasındaki intergenik bölge roX2 transkripsiyon başlangıç bölgesi ve bitişik gen (cg11695) düz siyah çizgiyle gösterilir. rT ve rNT zincirlerini hedefleyen sgRNA'lar sırasıyla kırmızı ve mor ile gösterilmiştir. Ok uçları, algılamak için kullanılan primerlerin konumunu işaretler. roX2 RT-qPCR analizi için RNA. (B ve C) bolluğun RT-qPCR ölçümü roX1 ve roX2 insan (B) veya Meyve sineği (C) dCas9 proteini ve iki sgRNA (x ekseninde gösterildiği gibi). sgRNA'lar rTb+rTc etkilemezken roX1 veya roX2 insan dCas9 varlığında seviyeler, özellikle demonte olurlar roX2 birlikte ifade eden hücrelerde transkript seviyeleri Meyve sineği dCas9. Y ekseni, RNA'ların aşağıdakilere göre zenginleşmesini gösterir. rp49 transkript ve hedefleme olmayan bir dizi (Ctrl) içeren pGTL-1 ile transfekte edilmiş hücrelere normalize edildi. Veriler, her biri üç kopya halinde gerçekleştirilen iki biyolojik kopyadan gösterilmektedir. Hata çubukları SEM'i gösterir. %, Ctrl ile karşılaştırıldığında yüzde olarak devrilmeyi gösterir.
NS roX2 transkript, CRISPRi tarafından verimli bir şekilde aşağı regüle edilir. (A) şematik gösterimi Drosophila roX2 göreli konumlarını gösteren yer roX2 sgRNA'ları hedefleme. Transkripsiyon başlangıç bölgesi, içindeki intron bir okla işaretlenir. roX2 gen düz gri bir çizgi ile gösterilir. arasındaki intergenik bölge roX2 transkripsiyon başlangıç bölgesi ve bitişik gen (cg11695) düz siyah çizgiyle gösterilir. rT ve rNT zincirlerini hedefleyen sgRNA'lar sırasıyla kırmızı ve mor ile gösterilmiştir. Ok uçları, algılamak için kullanılan primerlerin konumunu işaretler. roX2 RT-qPCR analizi için RNA. (B ve C) bolluğun RT-qPCR ölçümü roX1 ve roX2 insan (B) veya Meyve sineği (C) dCas9 proteini ve iki sgRNA (x ekseninde gösterildiği gibi). sgRNA'lar rTb+rTc etkilemezken roX1 veya roX2 insan dCas9 varlığında seviyeler, özellikle demonte olurlar roX2 birlikte ifade eden hücrelerde transkript seviyeleri Meyve sineği dCas9. Y ekseni, RNA'ların aşağıdakilere göre zenginleşmesini gösterir. rp49 transkript ve hedefleme olmayan bir dizi (Ctrl) içeren pGTL-1 ile transfekte edilmiş hücrelere normalize edildi. Veriler, her biri üç kopya halinde gerçekleştirilen iki biyolojik kopyadan gösterilmektedir. Hata çubukları SEM'i gösterir. %, Ctrl ile karşılaştırıldığında yüzde olarak devrilmeyi gösterir.
İlk olarak, transkripsiyonunu bastırmaya çalıştık. roX1 dCas9 proteini ile tek bir kılavuz RNA'yı birlikte ifade ederek RNA. için FlyBase (http://flybase.org/) gen modeli roX1 daha uzun bir süre ile sonuçlanan iki farklı transkripsiyon başlangıç bölgesini tahmin eder roX1 RA ve daha kısa roX1 RB izoform. Verilerimiz, her iki transkriptin, iki başlatma bölgesini doğrulayan klon 8 hücrelerinde (Şekil 2B) bulunduğunu göstermektedir. Özellikle, roX1 RB kurtarma analizi için transgenik yapılarda tek başına gen bölgesi kullanılmıştır (30). Sonuçlarımız, bitişik dCas9'un işe alınmasının roX1 RB transkripsiyon başlangıcı, her ikisinin de verimli bir şekilde susturulmasına neden oldu RA ve RB izoformlar (Şekil 2C, Ek Şekil S1A). İlginç bir şekilde, şablon olmayan (rNT7) ve şablon (rT8) zincirini hedefleyen sgRNA, insan hücrelerinde gözlemlendiği gibi susturma için DNA şablonu yanlılığının olmadığını gösteren benzer etkiler gösterdi (sırasıyla %95 ve %85). Tutarlı bir şekilde, şablon ipliği hedefleyen ve rNT7 ile kısmen örtüşen rT9, benzer baskılayıcı aktivite gösterir. Düşürme şunlara bağlıdır: roX1 hedefleme dizisi ve önemli ölçüde azaltılmış hücreler olarak spesifiktir. roX1 seviyelerinde eş zamanlı bir azalma göstermedi. roX2 RNA seviyeleri. DCas9'un akış yukarı bölgelerine hedeflenmesi roX1 transkripsiyon başlangıç bölgeleri (TSS), RNA seviyelerini etkileyemedi. Western analizi, dCas9 proteininin bu hücre hatlarında (Ek Şekil S2A) etkili ekspresyonunu gösterdi ve kılavuz RNA dizisinin baskıdaki kritik rolünün altını çizdi. dCas9 protein ekspresyonundaki değişkenlik, bu hücre hattındaki kromozomal pozisyon etkilerinden ve/veya kromozom kopya sayısı değişikliklerinden kaynaklanabilir (31). Birlikte ele alındığında, sonuçlarımız için güçlü sgRNA'ları ortaya çıkarır. roX1 susturma ve dCas9-sgRNA kompleksinin DNA'nın herhangi bir zinciri üzerinde birleştirilmesinin, muhtemelen RNA polimerazın bağlanmasını ve/veya uzamasını önleyerek, lncRNA ekspresyonunu etkili bir şekilde susturabildiğini gösterir.
Önceki bir çalışma, bakterilerde aynı geni hedefleyen iki sgRNA kullanılarak CRISPRi'nin etkinliğinin artırılabileceğini göstermiştir (9). Bunu test etmek için Meyve sineği hücrelerde, U6:1-sgRNA kasetini U6:3 kasetinin hemen yukarısındaki pGTL-1 vektörüne yerleştirdik, böylece pGTL-2 vektörünü oluşturduk (Şekil 1B) bu, U6'nın kontrolü altında ikinci bir sgRNA'nın ifadesine izin verir: Aynı zamanda sağlam bir aktivite gösteren 1 promotör Meyve sineği ( 13). İfade için, dCas9 proteininin verimli bağlanmasına izin vermek için > gt30 bp ayrı yerleştirilmiş sgRNA kombinasyonlarını seçtik. Şekil 2D'de gösterildiği gibi, sgRNA'lar (rNT6+rNT7)'nin yukarısındaki dizileri tamamlayıcı ve onu çevreleyen sgRNA'lar roX1 RB izoformu (rNT7+rT8, rT8+rT9) güçlü bir azalma gösterdi roX1 Transcript. Bu beklenir ve daha önce gözlemlendiği gibi rNT7, rT8 ve rT9 sgRNA'nın etkinliğine atfedilebilir (Şekil 2C), ancak rNT7 ve rT8 şimdi U6:1 promotörünün kontrolü altında ifade edilir. Dikkat çekici bir şekilde, etkili bir susturma gözlemliyoruz. roX1 hedefleyen sgRNA'lar tarafından RNA roX1 RA transkripsiyon bölgesi. Bireysel olarak etkisiz olmasına rağmen, şablon ipliği (rT1+rT3) veya hem şablon hem de şablon olmayan ipliği (rT4+rNT5) hedefleyen sgRNA kombinasyonları, roX1 RNA seviyeleri (sırasıyla %50 ve %90). DCas9 seviyeleri ile transkripsiyon inhibisyonu arasında güçlü bir korelasyon gözlemlemedik (Ek Şekil S2B). Toplu olarak, bu sonuçlar, transkripsiyonel başlangıç bölgelerinde çoklu dCas9 proteininin bağlanmasının, transkripsiyonel susturmanın etkinliğini artırabileceğini göstermektedir.
Daha sonra, dCas9 proteininin kodon optimizasyonunun CRISPRi'nin kombinatoryal aktivitesini geliştirip geliştiremeyeceğini belirledik. NS Meyve sineği kodon için optimize edilmiş Cas9 son zamanlarda canlıda Bununla birlikte, gen düzenleme, proteinin güçlü, her yerde bulunan Gal4 sürücüleri ile ekspresyonu, henüz bilinmeyen nedenlerle önemli ölçüde öldürücülüğe yol açtı (13). Katalitik olarak inaktif ürettik Meyve sineği Cas9, nükleaz aktivitesi için gerekli amino asitleri (D10A ve H841A) mutasyona uğratarak ve pGTL-2 vektöründe insan dCas9'unu ikame ederek. Şekil 2E'de gösterildiği gibi, sgRNA'ların birlikte ekspresyonu ve Meyve sineği dCas9, sgRNA'ların susturma aktivitesini, insan dCas9 proteini (rNT6+rNT7, rNT7+rT8 ve rT8+rT9) ile gözlemlenene benzer ölçüde özetler. Batı analizi verimli çeviri gösterdi Meyve sineği dCas9 proteini (Ek Şekil S2B). Hücre çizgileri, şunu düşündüren herhangi bir açık fenotip göstermedi. Meyve sineği dCas9 ekspresyonu toksik değildir ve protein, gen ekspresyonunu susturmada aktiftir. Bununla birlikte, insan dCas9'u ile karşılaştırıldığında, çarpıcı bir azalma gözlemledik (%97 için Meyve sineği insan dCas9) için %50'ye karşı dCas9 roX1 RA ve RB 5' bölgesini hedef alan sgRNA'lara sahip RNA roX1 RA TSS (rT1+rT3) (Şekil 2E, Ek Şekil S1B). Bu kılavuz RNA kombinasyonunun gelişmiş etkileri, bireysel olarak etkisiz olmasına rağmen, hücredeki gereksiz düzenleyici elemanların hedeflenmesinden kaynaklanıyor olabilir. roX1 intergenik bölge. Ayrıca rT4+rNT5 ifade eden hücrelerin ∼%40 azalma gösterdiğini de kaydettik. roX2 RNA seviyeleri (Şekil 2E) - Gapdh ve CTPsyn RNA seviyeleri benzer şekilde etkilenmediğinden bu, hedef dışı bir etki nedeniyle olası değildir (Ek Şekil S3A). Daha da önemlisi, DNA dizilimi, hücrenin susturma etkisinin Meyve sineği Endojen lokuslardaki dCas9-sgRNA kompleksi, DNA dizisindeki değişiklikleri içermez (Ek Şekil S4).
Dan beri roX1 sgRNA'ları hedeflemek, gen susturmada kombinatoryal bir etki gösterdi ve varlığında güçlüydü. Meyve sineği dCas9'u iptal etmek için benzer bir stratejinin kullanılıp kullanılamayacağını test ettik. roX2 transkripsiyon. Analiz için, çevresinde üç hedefleme dizisi seçtik. roX2 RA TSS, hem şablon olmayan (rNTa) hem de şablon (rTb ve rTc) ipliklerini tamamlayıcıdır (Şekil 3A). sgRNA'ların insan dCas9'u ile birlikte ekspresyonu, roX2 transkript düzeyi önemli ölçüde (Şekil 3B). Bununla birlikte, aynı sgRNA kombinasyonları ile birlikte eksprese edildiğinde Meyve sineği dCas9, önemli bir azalma (%90 devrilme) gözlemledik. roX2 transkripsiyon başlangıç bölgesini çevreleyen sgRNA'lardaki transkript (rTb+rTc, Şekil 3C). Önemli olan, roX1 transkript, aynı hücre dizisinde etkilenmedi, bu da nakavtın özgüllüğünü gösterdi. Tutarlı bir şekilde, Gapdh ve CTPsyn RNA seviyeleri de değişmeden kalır (Ek Şekil S3B). Özellikle, dCas9 protein seviyeleri, baskılama derecesine karşılık gelmiyordu (Ek Şekil S2C). Bu veriler, daha önceki gözlemlerimizle birlikte roX1, gelişmiş aktiviteyi destekler Meyve sineği dCas9, CRISPRi aracılığıyla transkripsiyon baskısına aracılık etmede.
Bugüne kadar, CRISPRi hiçbir çok hücreli organizmada uygulanmadı. CRISPRi'nin transkripsiyonunu baskılamadaki etkinliğini belirlemek için roX RNA'lar canlıdaifade eden iki transgenik sinek ürettik. Meyve sineği Yapısal olarak aktif promotörler altında dCas9 ve sgRNA'lar. Analiz için, karşılık gelen regülasyonu azaltmada güçlü aktivite gösteren kılavuz RNA'ları seçtik. roX içindeki genler Meyve sineği hücre hattı – rT8+rT9 hedefe roX1 ve rTb+rTc için roX2. Transgenez için, pAct5c-Cas9 vektörü ( 13) pGTL-3 vektörü oluşturmak için – Cas9 geni ile değiştirildi Meyve sineği dCas9 ve U6:1-sgRNA-U6:3-sgRNA kasetleri, mini beyaz gen ve Act5c destekleyici (Şekil 4A). Bu vektör, siteye özel kararlı entegrasyona izin verir. Meyve sineği genom, böylece transgen ekspresyonundaki pozisyon etkisini ve değişkenliği ortadan kaldırır. Gerçekten de, dCas9-roX1 ve dCas9-roX2 sinek çizgileri, benzer seviyeleri verimli bir şekilde ifade eder. Meyve sineği protein (Ek Şekil S2D) ve bu transgenlerin ekspresyonunun toksik olmadığını gösteren canlı idi. RT-qPCR, güçlü ve spesifik bir azalma gösterdi. roX1 ve roX2 Hücre hattındaki analizlerimizle tutarlı olan RNA seviyeleri (Şekil 4B) ve böylece Meyve sineği dCas9 canlıda. Düşürme muhtemelen hafife alınmış olabilir aktin5c bazı yetişkin dokularında eksprese edilmez (32) ve germ hattından çıkarılır. Dikkat çekici bir şekilde, dişilerle karşılaştırıldığında, birlikte ifade eden erkeklerin yaşayabilirliğinde ciddi bir azalma gözlemledik. roX1 ve roX2 RNA'ları yönlendirin (%7,6 dCas9-roX1/dCas9-roX2 erkeklere karşı %52.1 vahşi tip erkekler, Şekil 4C). Kaçan erkekler doğurgandır ve belirgin bir fenotipik kusur göstermezler. Bu, güçlü bir işlev kaybı ile tutarlıdır. roX (33). Böylece, işe alımın sona erdiği sonucuna varıyoruz. Meyve sineği dCas9'da roX1 ve roX2 lokus, transkripsiyonu baskılayarak onların ifadesini bozar ve bu da erkeklerin ölümüne neden olur.
yıkmak roX1 ve roX2 RNA'lar canlıda. (A) şematik gösterimi Meyve sineği transgenez vektörleri pGTL-3. Baskın seçim işaretçisi mini beyaz kontrolünde çift kılavuzlu RNA eksprese eden kaset takip eder. U6:1 ve U6:3 promotörler ifadesi sırasında Meyve sineği dCas9, yapısal olarak aktif promotör tarafından kontrol edilir aktin5c. dCas9'daki mutasyona uğramış amino asit kalıntıları (D10 > A ve H841 > A) kırmızı yıldızlarla (*) işaretlenmiştir. N = NLS dizisi, F = FLAG epitopu, pA = poliadenilasyon. (B) güçlü bir tükenme gösteren RT-qPCR analizi roX1 ve roX2 Karşılık gelen kılavuz RNA'ları (x ekseninde gösterilmiştir) ifade eden sinek çizgilerinin erkeklerindeki RNA'lar. Y ekseni, RNA'ların aşağıdakilere göre zenginleşmesini gösterir. rp49 transkript ve vahşi tipe normalize edildi (y,w) erkekler. Veriler, her biri üç kopya halinde gerçekleştirilen iki biyolojik kopyadan gösterilmektedir. Hata çubukları SEM'i gösterir. %, vahşi tiple karşılaştırıldığında yüzde olarak devrilmeyi gösterir. (C) Aynı anda ifade eden erkek soyda ciddi bir azalmayı gösteren tablo roX1 ve roX2 RNA'ları yönlendirin (rT8+rT9-Act:dCas9/rTb+rTc-Act:dCas9). Erkek hayatta kalma yüzdesi, aynı melezde geri kazanılan aynı genotipin toplam döl sayısına dayalı olarak hesaplanır. NS y,w suş vahşi tip olarak kullanılmıştır.
yıkmak roX1 ve roX2 RNA'lar canlıda. (A) şematik gösterimi Meyve sineği transgenez vektörleri pGTL-3. Baskın seçim işaretçisi mini beyaz kontrolünde çift kılavuzlu RNA eksprese eden kaset takip eder. U6:1 ve U6:3 promotörleri ifade ederken Meyve sineği dCas9, yapısal olarak aktif promotör tarafından kontrol edilir aktin5c. dCas9'daki mutasyona uğramış amino asit kalıntıları (D10 > A ve H841 > A) kırmızı yıldızlarla (*) işaretlenmiştir. N = NLS dizisi, F = FLAG epitopu, pA = poliadenilasyon. (B) güçlü bir tükenme gösteren RT-qPCR analizi roX1 ve roX2 Karşılık gelen kılavuz RNA'ları (x ekseninde gösterilmiştir) ifade eden sinek çizgilerinin erkeklerindeki RNA'lar. Y ekseni, RNA'ların aşağıdakilere göre zenginleşmesini gösterir. rp49 transkript ve vahşi tipe normalize edildi (y,w) erkekler. Veriler, her biri üç kopya halinde gerçekleştirilen iki biyolojik kopyadan gösterilmektedir. Hata çubukları SEM'i gösterir. %, vahşi tiple karşılaştırıldığında yüzde olarak devrilmeyi gösterir. (C) Aynı anda ifade eden erkek soyda ciddi bir azalmayı gösteren tablo roX1 ve roX2 RNA'ları yönlendirin (rT8+rT9-Act:dCas9/rTb+rTc-Act:dCas9). Erkek hayatta kalma yüzdesi, aynı melezde geri kazanılan aynı genotipin toplam döl sayısına dayalı olarak hesaplanır. NS y,w suş vahşi tip olarak kullanılmıştır.
Bu raporda, lncRNA genlerini incelemek için etkili bir fonksiyon kaybı yaklaşımını tanımlıyoruz. Meyve sineği efektör alanlarının dCas9'a füzyonunu gerektirmeyen minimal bir CRISPRi sistemi ile. Bu basit yöntemi kullanarak, yüksek düzeyde yıkım elde ettik. roX içindeki endojen lokusları hedefleyerek RNA'lar (50 kata kadar) Meyve sineği hücreler. Stratejimiz, lncRNA fonksiyonunu değerlendirmek için kullanılan genetik yaklaşımların önceki sınırlamalarının üstesinden gelir - DNA'da değişiklik yapmaz ve kromatin susturma komplekslerinin ektopik alımını ortadan kaldırır. Sonuçlarımız, genlerin transkripsiyon başlangıç bölgesini çevreleyen çoklu sgRNA'ların hedeflenmesinin, CRISPRi'nin yok etme gücünü geliştirdiğini göstermektedir. Bu bağlamda, esnek PAM tanıma özelliklerine ve gelişmiş özgüllüğe sahip tasarlanmış Cas9 proteinlerinin son gelişimi, hedef dışı etkileri en aza indirirken hedeflenebilir dizilerin seçimini artırmalıdır (34, 35). Kılavuz RNA aktivitesinin tahmin edilmesi zor olduğundan ve lncRNA'ların promotör ve transkripsiyon düzenleyici elemanlarının karakterizasyonu eksik kaldığından, analiz için güçlü kılavuzlar seçmek için çoklu kılavuz RNA'ları test etmenizi öneririz. Transfeksiyon vektörümüzün ve hücre bazlı tahlilimizin tasarımı, birkaç sgRNA'nın etkinliğinin, kullanımlarından önce hızlı bir şekilde değerlendirilmesini sağlar. canlıda ölçeklendirmeden gen ekspresyonunun susturulmasına kadar uzanan çalışmaların yanı sıra promotör ve/veya geliştirici haritalama deneyleri. Bu strateji, geleneksel yıkma yaklaşımlarıyla birlikte, metazoa boyunca lncRNA'ların işlevsel ve mekanik keşfine izin vermeli ve böylece genomun 'karanlık maddesini' oluşturan bu esrarengiz transkriptlere ışık tutmalıdır.
Fillip Port ve Simon Bullock'a plazmit hediyesi için, NIH tarafından desteklenen Drosophila Genomics Resource Center hücre hattı için 2P40OD010949-10A1, veri analizi konusunda yardım için Yong Huang, makalenin eleştirel okuması için Stuart Grice ve Liu üyeleri için teşekkür ederiz. yararlı tartışmalar için laboratuvar. Ayrıca transgenik sinek hatlarının üretilmesi için Cambridge Üniversitesi Genetik Bölümü Sinek Tesisi'ne teşekkür ederiz.
Madde
İşlevsel uzun kodlamayan RNA'ların (lncRNA'lar) keşfi, çoğu RNA'nın proteinleri kodladığı paradigmaya meydan okudu. LncRNA'lar, daha önce transkripsiyonel gürültü olduğu varsayılan, >200 nt uzunluğunda bol miktarda RNA sınıfıdır. Bu lncRNA'ların bazılarının gen ekspresyonunda çeşitli düzenleyici rollere sahip olduğu, nükleer organizasyonu şekillendirmek için yapısal bileşenler olarak hizmet edebileceği ve hatta diğer RNA'lar veya proteinler 1-3 için tuzak görevi görebileceği artık yaygın olarak kabul edilmektedir. On binlerce lncRNA transkripti kataloglanmış olsa da, lncRNA'ların çoğunun biyolojik işlevi hala bir sır olarak kalıyor. Yakın zamanda keşfedilen bu RNA sınıfının üyelerinin bireysel işlevselliğini belirlemek, gelişim biyolojisi, evrim ve genetik hastalığın daha iyi anlaşılması için önemlidir.
Proteinlere benzer şekilde, bireysel lncRNA'lar, işlevleri için kritik olan spesifik hücre altı dağılımlarına sahiptir 4 . Bazı lncRNA'lar çekirdekte zenginleştirilmiştir ve transkripsiyon ve RNA işleme gibi nükleer süreçlerin düzenlenmesinde rol oynar. Diğer lncRNA'lar, protein lokalizasyonunu etkileyebilecekleri veya mRNA stabilitesini ve translasyonunu modüle edebilecekleri sitoplazmada zenginleştirilmiştir. Bazı lncRNA'lar çekirdek ve sitoplazma arasında daha eşit olarak dağılır. Bir lncRNA'nın birincil rezervuarının konumu, o türün ekspresyon seviyelerini düşürme yeteneğini etkileyebilir.
lncRNA'ları devre dışı bırakmak veya devre dışı bırakmak için yaygın olarak kullanılan üç strateji şunlardır: RNA etkileşimi (RNAi) ile RNA'nın bozunması, RNA'nın RNase H aktive antisens oligonükleotidler (ASO'lar) tarafından bozunması veya CRISPR/ kullanarak DNA düzeyinde büyük silme/değişiklik. Cas9 genom düzenleme yöntemleri (Şekil 1). Bu araçların her birinin kendi avantajları ve dezavantajları vardır ve başarı, lncRNA'nın hücre altı lokalizasyonundan ve içinde bulunduğu transkripsiyonel ortamdan etkilenebilir.
Şekil 1: lncRNA'ları devre dışı bırakmak veya devre dışı bırakmak için kullanılan üç yaygın yöntemin şeması. RNA interferansı (RNAi), hedeflenen RNA'yı spesifik olarak degrade etmek için bir siRNA içeren multi-protein RNAi ile indüklenen susturma kompleksini (RISC) kullanır. Antisens oligonükleotitler (ASO'lar) hedeflenen RNA'larına bağlanır ve RNA'yı bir RNA/DNA heterodupleksinde parçalayan bir enzim olan endojen RNase H1'i kullanır. CRISPR-Cas9 genom düzenlemesi, Cas9 proteini ile kompleks oluşturan tracrRNA'ya hibritlenen hedefe özgü bir crRNA kullanarak genomik düzeyde değişiklikler yapar.
RNAi, mRNA'ları 5 bastırmak için çok proteinli RNAi kaynaklı susturma kompleksi (RISC) kullanan yaygın olarak kullanılan bir demonte tekniğidir. İnsan RISC yükleme kompleksi (RLC), daha uzun dsRNA'ların olgun siRNA'lara işlenmesinden ve bu siRNA'ların Ago2'ye yüklenmesinden sorumlu üç proteinden (Dicer, TRBP ve Ago2) oluşur. Daha önce RNAi aracılı mRNA bozulmasının sitoplazmada 6 meydana geldiği gösterilmiştir. Bir dizi fraksiyonasyon ve birlikte immünopresipitasyon deneyinde, Stalder ve ark. daha spesifik olarak, kanonik RISC yüklemesinin, daha sonra hedeflenen mRNA'sı ve Ago2 aracılı mRNA bölünmesiyle bağlanmasının, esas olarak mRNA'ların proteinlere 7 çevrildiği kaba endoplazmik retikulumda meydana geldiğini gösterir. RNase H aracılı antisens RNA yıkımı, DNA replikasyonu ve onarımında işlev gördüğü düşünülen çekirdekte en bol bulunan endojen RNase H1 enziminden yararlanır 8-11 . Alternatif olarak, sterik bloke edici ASO'lar, olgun lncRNA transkriptlerinin birikimini azaltmak veya hedef RNA 12,13'ün bozulmasını tetiklemeden anahtar fonksiyonel alanlara erişimi engellemek için ekleme bağlantılarını bloke etmek için kullanılabilir. Sterik bloke edici ASO'lar, 2'-modifiye riboz veya morfolino omurgaları gibi RNase H1 bölünmesini desteklemeyen kimyasal olarak modifiye edilmiş kalıntılardan yapılır. Hem RNAi hem de RNase H-aktif ASO'lar, lncRNA'yı parçalamak için doğal olarak mevcut efektör moleküllere güvenir. Buna karşılık, CRISPR/Cas9 genom düzenleme yöntemleri, hedef site 15,16'da veya çevresinde çift sarmallı DNA kırılmaları oluşturduğu siteye özgü bir kılavuz RNA tarafından genomdaki istenen bölgelere hedeflenebilen bir bakteriyel endonükleaz enzimine dayanır. Hücresel onarım makinesi, genomda küçük "yaralar" bırakarak çift zincirli kırıkları iyileştirir veya hatta büyük DNA bloklarını silmek ve böylece lncRNA'yı genomik düzeyde ortadan kaldırmak için kullanılabilir. CRISPR/Cas9 yöntemleri, tam uzunluktaki lncRNA'ların üretimini önleyecek transkripsiyonel sonlandırıcılar gibi hedef lokuslara yeni diziler eklemek için de kullanılabilir. İlgilenilen lncRNA'nın doğasını anlamak, optimal nakavt tekniğinin seçilmesine daha iyi yardımcı olabilir.
Kapsamlı bir mRNA yıkım deneyimi geçmişiyle, lncRNA'ları bastırmak için aynı reaktif repertuarının uygulanmasının kolayca gerçekleştirileceğini umduk. Bununla birlikte, bazı lncRNA'ların bastırılmasının zor olduğunu bulduk ve sonunda RNAi tabanlı yöntemlerin (küçük enterferans yapan RNA'lar, siRNA'lar veya Dicer substrat RNA'ları, DsiRNA'lar) nükleer lokalize lncRNA hedeflerine karşı daha az etkili olduğuna dair bir korelasyon gibi görünen şeyi fark ettik. RNase H ağırlıklı olarak çekirdekte bulunduğundan, bu nükleer lncRNA'ların RNase-H aracılı antisens yıkımı kullanılarak daha kolay bastırılabileceğini varsaydık. Tersine, çoğunlukla sitoplazmik bir süreç olan RNAi'nin, lncRNA'ların sitoplazmik popülasyonlarını hedeflerken daha etkili olabileceğini düşündük. Bu olasılığı test etmek için, hücre kültüründe ASO'ların (20mer DNA-PS, 20mer 2'OMe-PS boşluk bırakıcıları veya 16mer LNA-PS boşluk bırakıcıları (Exiqon) etkinliğini karşılaştıran sistematik bir çalışma yapıldı; burada PS = fosforotiyoat bağlantıları, LNA = kilitli nükleik asit ve 2'OMe = 2'-0-Metil RNA) veya RNAi (DsiRNA'lar, siRNA veya Silencer® Select siRNA'lar (Thermo Fisher Scientific)) değişken lokalizasyon desenleri 17 ile yedi lncRNA'ya karşı. Nükleer lncRNA'lar (MALAT1 ve NEAT1), sitoplazmik lncRNA'lar (DANCR ve OIP5-AS1) veya çift lokalize lncRNA'lar (TUG1, CasC7 ve HOTAIR), ASO'lar (18 site/hedef) veya RNAi (28 site/hedef) tarafından hedeflendi. GC içeriği ve hedef erişilebilirlik gibi parametrelere bağlı olarak siteler arasında çok çeşitli etkinlik olduğundan, siteler optimize edilmiş tasarım algoritmaları (RNAi) kullanılarak veya olasılığı en üst düzeye çıkarmak için iyi tanımlanmış katı şirket içi tasarım kriterleri (ASO'lar) kullanılarak seçildi. iki yıkım stratejisi arasında oldukça aktif sitelerin karşılaştırılması. Sonuçlar hipotezimizle tutarlıydı: ASO'lar kullanıldığında nükleer lncRNA'lar daha kolay yıkılırken, sitoplazmik hedefler RNAi kullanıldığında daha kolay yıkıldı (Şekil 2). Çeşitli ASO kimyasal modifikasyon stratejilerinin gücü karşılaştırıldığında, DNA-PS ve 2'OMe-PS ASO'ların farklı siteler arasında çok benzer yıkım modellerine sahip olmasına rağmen, 2'OMe-PS boşluk yapıcılarının sürekli olarak daha güçlü olduğu bulundu. 2'OMe bazları ASO'nun hedefe bağlanma afinitesini arttırdığı için bu bekleniyordu. 2'OMe-PS boşluk bırakıcı ve LNA-PS boşluk bırakıcı ASO'lar tipik olarak 10 nM dozda benzer etki göstermiştir, ancak LNA-PS boşluk bırakıcılar genellikle daha düşük dozlarda daha güçlüydü. Test edilen çeşitli RNAi reaktiflerinden herhangi biri arasında aktivite açısından genel bir fark yoktu. Bu çalışmada devrilme süresi ele alınmamıştır 3-7 gün süren bastırma tipik olarak hücre kültüründe görülür (burada hücre bölünmesinden kaynaklanan seyreltme, ASO'ların veya siRNA'ların konsantrasyonunu azaltarak sınırlanabilir), oysa birkaç hafta veya hatta bir ay boyunca devrilme olabilir. bölünmeyen hücrelerde görülür canlıda 18,19. Bu çalışma sadece hücre kültüründe lncRNA yıkımını incelerken, farklı reaktif sınıfları arasında benzer nispi aktiviteler beklenebilir. canlıda uygun teslimat araçları kullanılmışsa. İçin canlıda kullanım, çıplak IV enjeksiyon (herhangi bir uygulama yardımı olmadan) 20 ile tatbik edilirse, kısa LNA-PS boşlukları için açık bir performans avantajı tahmin edilecektir. Lipid nanopartikül (LNP) veya konjuge ligand (kolesterol veya bir antikor gibi) gibi bir dağıtım aracının kullanılması, ASO'ların verilmesini iyileştirebilir ve in vivo 18,19,21,22 herhangi bir RNAi reaktifinin kullanımı için gerekli olacaktır.
Şimdiye kadar, lncRNA'nın ağırlıklı olarak nükleer mi yoksa sitoplazmik mi olduğuna bağlı olarak, hedeflerini bastırmak için her iki demonte tekniğinin "göreceli kolaylığı" hakkında yorum yaptık. Verilere daha yakından bakıldığında, ASO'ların sitoplazmik RNA'ları parçalamada da etkili olduğu görülmektedir (Şekil 2). ASO'lar yalnızca nükleer olarak tutulan RNA'ları hedefleme konusunda doğuştan gelen yeteneğe sahip olmakla kalmaz, aynı zamanda sitoplazmik dışa aktarmadan önce yeni oluşan RNA'ları da bozabilir. Ayrıca, ASO'lar tarafından mRNA bozunmasının hız sınırlayıcı adımını inceleyen yeni bir çalışma, RNase H1'in sitoplazmada 23 düşük seviyelerde de mevcut olduğunu buldu. ASO aracılı mRNA bozunması çekirdekte daha hızlı gerçekleşirken, sitoplazmada daha yavaş bir oranda meydana geldi. Bu, lncRNA'nın lokalizasyonu bilinmiyorsa, ASO yıkımının (RNAi'nin aksine) seçilmesinin en iyi başarı şansına sahip olacağını göstermektedir. İlginç bir şekilde, çalışmamız, çift lokalize lncRNA'ları hedeflerken, ASO'ları ve siRNA'ları bir araya getirerek gelişmiş yıkımın sağlanabileceğini gösterdi. ASO'nun nükleer lncRNA popülasyonunu en hızlı şekilde bozabileceği ve siRNA'nın sitoplazmik lncRNA popülasyonunu en hızlı şekilde bozabileceği düşünüldüğünde, bu öngörülebilirdi.
Şekil 2: Yöntem etkinliğini lncRNA hücre altı lokalizasyonu ile karşılaştıran lncRNA yıkım sonuçlarına genel bakış (17). Antisens oligonükleotidleri (LNA-PS boşluk bırakıcıları, 2'OMe-PS boşluk bırakıcıları veya DNA-PS) veya RNAi reaktifleri (siRNA'lar, DsiRNA'lar veya Silencer® Select siRNA'lar), 10 nM dozda 24 saat boyunca Lipofectamine® 2000 ile HeLa hücrelerine transfekte edildi. ASO'lar = antisens oligonükleotitler PS = fosforotiyoat bağlantıları.
Bazı lncRNA'lar, ASO'lar veya RNAi tarafından yıkılmaya karşı dirençli olacaktır. Bu, lncRNA'nın hücre altı lokalizasyonuna RNase H veya RNAi makinesi tarafından erişilemiyorsa meydana gelebilir. Ayrıca, lncRNA'nın aşırı protein bağlanması veya diğer hücresel nükleik asitlere hibritlenmesi nedeniyle yüksek düzeyde yapılandırılmış veya bloke olması durumunda da ortaya çıkabilir. Çok çeşitli ASO'ları ve RNAi reaktiflerini, bir protein süngeri olarak işlev gören bir lncRNA olan NRON'a karşı test ettik ve yüksek düzeyde yıkım elde edemedik (yayınlanmamış sonuçlar). Bu durumlarda, CRISPR/Cas9 genom düzenleme gibi bir tekniğin kullanılması gerekli olabilir. Bir lncRNA'yı devre dışı bırakmak için bir genom düzenleme aracı kullanmak önemsiz değildir, çünkü hedeflenen lncRNA'da küçük bir indel yapmak büyük olasılıkla transkripsiyonu bozmaz, çerçeve dışı indel olayları tarafından kolayca bozulan hiçbir "açık okuma çerçevesi" yoktur. Yeni eklenen indelleri içeren kopyalanmış lncRNA'lar, fenotipik analizi gizleyen fonksiyonel alanları ve/veya bağlanma bölgelerini hala tutabilir. Birkaç strateji, lncRNA'ları devre dışı bırakmak için CRISPR/Cas9 genom düzenlemesini başarıyla kullandı. Bir strateji, DNA'yı iki spesifik konumda aynı anda kırmak için çift kılavuz RNA'ları kullanır ve lncRNA'yı kodlayan genomik lokusların büyük bir parçasını çıkarır. Bu teknik için kavram kanıtı, 475 bp (lnRNA-21A) ila 5.6 kb (UCA1) 24 arasında değişen büyük parçaları kaldırarak lncRNA-21A, UCA1 ve AK023948'i başarıyla devre dışı bıraktı. İkinci bir strateji, bir RNA destabilize edici elemanı (bir poli(A) sinyali, bir miRNA bağlanma bölgesi, bir kendi kendini parçalayan ribozim, vb.) genomik diziye yerleştirmek için CRISPR/Cas9'u kullanır ve lncRNA transkript devri/degradasyonunda artışa neden olur. Başlangıçta çinko parmak nükleazları ile bu stratejiyi kullanarak, Gutschner ve diğerleri, transkripsiyonel başlangıç bölgesinin yukarı akışındaki bir poli(A) sinyalini entegre ederek bir MALAT1 nakavt modeli geliştirdiler ve MALAT1 seviyelerinde >1000 kat azalma sağladılar 25,26. CRISPR/Cas9 teknolojisinin ortaya çıkışı bu yaklaşımı büyük ölçüde basitleştirdi. CRISPR inhibisyonu (CRISPRi), RNA polimeraz fonksiyonunu bloke etmek için katalitik olarak aktif olmayan (ölü) bir Cas9 (dCas9) proteini kullanan veya daha yüksek transkripsiyonel baskı isteniyorsa, dCas9'u bir transkripsiyonel baskılayıcı (KRAB gibi) ile birleştiren bir tekniktir. . Gilbert ve arkadaşları, dCas9-KRAB kullanarak altı farklı lncRNA'yı hedefleyerek 5/6 lncRNA'lar 27 için >%80 yıkım elde etti. Özellikle, CRISPRi yöntemlerinin etkin kullanımı, geliştirici/destekleyici öğelerin konumunun bilinmesini ve ayrıca bu düzenleyici öğelerin yalnızca lncRNA'nın ifadesini kontrol edip etmediğini veya aynı zamanda diğer (kodlayıcı) transkriptlerin ifadesine katkıda bulunup bulunmadığını gerektirir. Herhangi bir CRISPR yöntemi kullanılarak, örtüşen, karşıt diziden kopyalanan veya farklı izoformlara daha fazla işlenen transkriptler de yanlışlıkla devre dışı bırakılabilir ve bu da veri yorumlamasını karıştırabilir. Aslında, Goyal ve arkadaşları yakın zamanda, çalışmalarında analiz edilen 15.929 lncRNA'nın %62'sinin, çift yönlü veya dahili promotörler içermesi nedeniyle CRISPR/Cas9 genom düzenlemesi için zayıf hedefler olduğunu, dolayısıyla bunların nakavtlarının potansiyel olarak komşu genleri etkileyebileceğini göstermiştir. Yazarlar bu analizden birkaç örnek seçtiler ve diğer genlerle örtüşen lokuslara sahip lncRNA'ları nakavt etmek için CRISPRi kullanmanın gerçekten de komşu genlerini etkilediğini gösterdiler. Buna karşılık, bu aynı lncRNA hedeflerinin RNAi veya ASO yıkımı, hedeflenen transkript 28'e özeldi.
Gen ekspresyonunu baskılayan tüm tekniklerin, hedeflenen hedefe sekans homolojisine sahip ilgili genlerin, hedeflenen nükleik asitlerle çapraz hibridizasyon yoluyla baskılandığı, hedef dışı etkiler (OTE'ler) riski vardır. ASO'ların özgüllüğü yalnızca Watson-Crick nükleik asit hibridizasyonuna dayanır ve OTE'lerin biyoinformatik analizle tahmin edilmesi, özellikle yüksek afiniteli kısa ASO'lar 29 kullanıldığında, bu reaktiflerin tek baz özgüllüğü gösterebileceği diğer yöntemlere göre daha kolaydır. RNAi yöntemleri tek-baz özgüllüğü gösterebilse de, bu yöntemlerin miRNA yollarıyla karışma nedeniyle daha yüksek şüphelenilmeyen OTE riski vardır, burada 6-7 baz "tohum bölgesi" kısa bir baskılamanın özgüllüğünü tanımlar ve birçok kişiyi etkileme riskine yol açar. ilgisiz genler 30 . Bununla birlikte, bu OTE yolunun büyük bir öğesi, tanımı gereği lncRNA işlevini doğrudan etkileyemeyen translasyonel baskılamadan türemiştir. CRISPR yöntemleri de aynı şekilde OTE riski taşır. Doğrudan ribonükleoprotein (RNP) gen düzenleme yöntemlerinin kullanımı (yalnızca Cas9 proteini ve kılavuz RNA'ların DNA'sız bir formatta kullanıldığı yerlerde), Cas9'un plazmit bazlı aşırı ekspresyonunu kullanan ve RNA'ları yönlendiren yöntemlerden çok daha düşük OTE profilleri gösterir, bu da OTE riski 31 . Ayrıca, hedef dışı sitelerde 32 hareket etme riskini önemli ölçüde azaltan Cas9 mutantları geliştirilmiştir. Bu nedenle, geliştirilmiş "yeni nesil CRISPR yöntemlerinin" kullanılması, OTE'nin sonuçları etkileme riskini azaltabilir. Ek bir endişe olarak, bir hücrenin DNA'sını kalıcı olarak değiştiren CRISPR yöntemleri, genellikle bir hücredeki her bir kromozomda veya bir popülasyondaki hücreler arasında farklı mutasyonların oluşmasına neden olur. Bu tür genom düzenleme deneylerinden kesin sonuçlara varılmadan önce, çalışma için klonal olarak saf hücre dizilerini izole etmek gerekli olabilir.
Binlerce lncRNA'nın keşfi ve hücresel süreçlerdeki belirsiz rolleri, bireysel işlevlerini belirlemeye yardımcı olmak için güvenilir yıkım tekniklerine olan ihtiyacı artırdı. En iyi sonuçları verme olasılığı en yüksek olan yok etme yöntemini seçebilmek, zamandan ve paradan tasarruf sağlar ve lncRNA araştırmasını daha da ilerletir. Burada, lncRNA lokalizasyonuna, lncRNA transkriptinin enzimlere erişilebilirliğine (in) ve içinde bulundukları transkripsiyonel manzaraya bağlı olarak kullanılabilecek tekniklerin bir repertuarını tanımladık.
Uzun Kodlamayan RNA AFAP1-AS1'in Yok Edilmesi In Vitro ve In Vivo I/R'ye Yanıtta Kardiyomiyositlerin Canlılığını Destekledi ve Ölümünü Bastırdı
Uzun kodlamayan RNA (lncRNA), miyokard enfarktüsünün (MI) gelişiminde çok önemli bir rol oynar. Bu çalışmanın amacı, lncRNA aktin filamenti ile ilişkili protein 1 antisens RNA 1'in (AFAP1-AS1) hücre döngüsü, proliferasyon ve apoptoz üzerindeki etkilerini araştırmaktı. RT-qPCR, sıçan I/R modelinde AFAP1-AS1, miR-512-3p ve retikülon 3'ün (RTN3) ekspresyon seviyelerini saptamak için kullanıldı. Simüle edilmiş MI ortamı oluşturuldu. AFAP1-AS1 susturma veya RTN3 susturma ile MI sonrası kardiyomiyosit canlılığı ve hücre döngüsü/apoptozdaki değişiklikleri tespit etmek için MTT tahlili ve akış sitometrisi kullanıldı. Kardiyomiyositlerde miR-512-3p ve AFAP1-AS1 ve RTN3'ün hedefleme ilişkisi, ikili lusiferaz raportör testi ile doğrulandı. AFAP1-AS1 ve RTN3'ün ekspresyon seviyeleri, bir sıçan LAD ligasyonu (veya MI) ligasyonu modelinde önemli ölçüde yukarı doğru düzenlenirken, miR-512-3p'nin ekspresyon seviyesi önemli ölçüde azaltıldı. Aşırı eksprese edilen AFAP1-AS1 ve RTN3, kardiyomiyosit apoptozunu destekledi ve kardiyomiyosit proliferasyonunu inhibe etti. MiR-512-3p, AFAP1-AS1'in doğrudan hedefiydi ve RTN3, miR-512-3p'nin doğrudan hedefiydi. AFAP1-AS1, miR-512-3p'yi hedefleyerek MI'nın ilerlemesini destekledi. AFAP1-AS1, miR-512-3p/RTN3 eksenini modüle ederek MI ilerlemesini destekledi. AFAP1-AS1, MI için potansiyel bir tedavi hedefi olabilir.
AFAP1-AS1'in in vivo MI hasarını düzenlemedeki rolü. (A) AFAP1-AS1'in in vivo MI yaralanmasındaki etkisi. (B) in vivo MI yaralanmasında RTN3'ün mRNA seviyesi. (C) İn vivo MI yaralanmasında RTN3'ün protein seviyesi. (D) MI model grubunda miR-512-3p'nin etkisi. (E) TUNEL testi. *P < 0.05, **P < 0.01, sahte gruba karşı #P < 0.05, ##P < 0.01 vs MI grubu
PU.1 AS lncRNA'nın yıkılması, PU.1 mRNA translasyonunu güçlendirerek adipogenezi inhibe eder
Yazışma: Wei-Jun Pang, Doktora, Hayvan Yağ Biriktirme ve Kas Geliştirme Laboratuvarı, Hayvan Bilimi ve Teknolojisi Koleji, Kuzeybatı A&F Üniversitesi, 22 Xinong Yolu, Yangling, Shaanxi Eyaleti 712100, Çin.
Çocuk Beslenmesi Araştırma Merkezi, Baylor Tıp Fakültesi, Houston, Teksas, 77030
Hayvansal Yağ Biriktirme ve Kas Geliştirme Laboratuvarı, Hayvan Bilimi ve Teknolojisi Koleji, Northwest A&F Üniversitesi, Yangling 712100, Çin
Hayvansal Yağ Biriktirme ve Kas Geliştirme Laboratuvarı, Hayvan Bilimi ve Teknolojisi Koleji, Northwest A&F Üniversitesi, Yangling 712100, Çin
Hayvansal Yağ Biriktirme ve Kas Geliştirme Laboratuvarı, Hayvan Bilimi ve Teknolojisi Koleji, Northwest A&F Üniversitesi, Yangling 712100, Çin
Çocuk Beslenmesi Araştırma Merkezi, Baylor Tıp Fakültesi, Houston, Teksas, 77030
Yazışma: Wei-Jun Pang, Doktora, Hayvan Yağ Biriktirme ve Kas Geliştirme Laboratuvarı, Hayvan Bilimi ve Teknolojisi Koleji, Kuzeybatı A&F Üniversitesi, 22 Xinong Yolu, Yangling, Shaanxi Eyaleti 712100, Çin.
Çocuk Beslenmesi Araştırma Merkezi, Baylor Tıp Fakültesi, Houston, Teksas, 77030
ÖZ
PU.1, miyelo-lenfoid farklılaşmasında rol oynayan bir Ets ailesi transkripsiyon faktörüdür. PU.1'in adiposit soyunda da ifade edildiğini daha önce göstermiştik. Ancak, preadipositlerdeki PU.1 mRNA ve protein ekspresyon seviyeleri, olgun adipositlerdeki seviyelerle eşleşmez. PU.1 mRNA düzeyi preadipositlerde daha yüksektir, buna karşın proteini adipositlerde eksprese edilir, ancak preadipositlerde bulunmaz. Altta yatan mekanizma belirsizliğini koruyor. Burada, miR-155 yıkımının veya aşırı ekspresyonunun, preadipositler veya adipositlerdeki PU.1 mRNA ve protein seviyeleri üzerinde hiçbir etkisi olmadığını bulduk. MiR-155, adipogenezi PU.1 aracılığıyla değil, miR-155'in bir başka hedefi olan C/EBPβ aracılığıyla düzenler. Ayrıca PU.1 mRNA ve antisens uzun kodlamayan RNA'nın (AS lncRNA) ekspresyon seviyelerini de kontrol ettik. İlginç bir şekilde, PU.1 mRNA seviyesi ile karşılaştırıldığında, PU.1 AS lncRNA seviyesi preadipositlerde çok daha yüksektir, oysa adipositlerde bunun tersidir. Ayrıca PU.1 AS lncRNA'nın bir mRNA/AS lncRNA bileşiği oluşturan mRNA'sına bağlandığını keşfettik. PU.1 AS'nin siRNA tarafından yıkılması, adipogenezi inhibe eder ve hem preadipositlerde hem de adipositlerde PU.1 protein ekspresyonunu destekler. Ayrıca, PU.1 AS'nin baskılanması, adiponektin ekspresyonunu ve salgılanmasını azaltır. Ayrıca retroviral aracılı PU.1 AS yıkımının adipogenez üzerindeki etkisinin, siRNA tarafından PU.1 AS yıkımının etkisi ile tutarlı olduğunu bulduk. Birlikte ele alındığında, sonuçlarımız PU.1 AS lncRNA'nın, preadipositlerde mRNA/AS lncRNA dupleksini oluşturmak için PU.1 mRNA'ya bağlanma yoluyla PU.1 mRNA translasyonunu önleyerek adipogenezi desteklediğini göstermektedir. J. Hücre. Biyokimya. 114: 2500–2512, 2013. © 2013 Wiley Periodicals, Inc.
Ek destekleyici bilgiler, bu makalenin yayıncının web sitesindeki çevrimiçi versiyonunda bulunabilir.
|Dosya adı||Açıklama|
|jcb24595-sm-0001-SupFig-S1.tif14.7 MB||Şekil S1. A: Tahmin edilen miRNA'lar, TargetScan Sürüm 6.2'yi kullanarak PU.1 mRNA'yı hedefler. B: PU.1 mRNA ve miRNA-155 arasında tahmin edilen sonuçsal eşleşmenin istatistik bilgisi.|
|jcb24595-sm-0002-SupFig-S2.tif11,6 MB||Şekil S2. A: Tahmin edilen miRNA'lar, TargetScan Sürüm 6.2'yi kullanarak C/EBPβ mRNA'yı hedefler. B: C/EBPβ mRNA ve miRNA-155 arasındaki tahmini sonuç eşleşmesinin istatistik bilgisi.|
|jcb24595-sm-0003-SupFig-S3.tif3.1 MB||Şekil S3. Preadiposit farklılaşması sırasında adiponektinin zamana bağlı ifadesi.|
Lütfen dikkat: Yayıncı, yazarlar tarafından sağlanan herhangi bir destekleyici bilginin içeriğinden veya işlevinden sorumlu değildir. Herhangi bir sorgu (eksik içerik dışında) makale için ilgili yazara yönlendirilmelidir.
Nöronal gelişimi kontrol eden gen düzenleyici ağlar
27.6.3 lncRNA—işlev kanıtı
Uzun kodlamayan RNA'lar (lncRNA'lar), intergenik DNA'dan kaynaklanan, 200 nükleotitten uzun fakat çoğu mRNA'dan daha kısa olan ve genellikle düşük seviyelerde eksprese edilen bir transkript türüdür. Bu transkriptlerin proteinleri kodladığına dair bir kanıt yoktur ve lncRNA'ların çoğunluğu, protein kodlayan genlere kıyasla doğal seçilim tarafından nispeten kısıtlanmamış görünmektedir (Perry ve Ulitsky, 2016 Ramos ve diğerleri, 2016). Genomun çoğunluğunun kopyalandığı gözlemi, bu kopyaların işlevselliğini sorgulamaktadır (Birney ve diğerleri, 2007). Bununla birlikte, yaklaşık 1000 lncRNA, insanlarda orta ila yüksek düzeyde eksprese edilir ve işlevsel olduklarını güçlü bir şekilde gösteren evrimsel kısıtlama belirtileri gösterir (Hezroni ve diğerleri, 2015).Ayrıca, dokuya özgü ifadeye sahip lncRNA'ların yaklaşık %40'ı beyinden geldiğinden ve bunlar en farklı şekilde ifade edilen lncRNA'lar arasında olduğundan, bu işlevin beyin gelişimi için önemli olabileceğine dair ipuçları vardır (Derrien ve diğerleri, 2012). Ek olarak, lncRNA, beyin gelişimi ve nöral progenitörlerin farklılaşması sırasında beyin bölgesine özgü bir şekilde dinamik olarak eksprese edilir (Aprea ve diğerleri, 2013 Mercer ve diğerleri, 2008 Ramos ve diğerleri, 2013).
LncRNA'ların etki mekanizmaları için önerilen üç genel kategori vardır: transkripsiyon kaynaklı baskılama, cis-, ve transetkili lncRNA'lar (Şekil 27.4B, C). Genomun kopyalanan bölgelerinin son kısımları, muhtemelen genin ekspresyonuna veya işlevine müdahale edecek olan gen promotörünün akış aşağısındaki ektopik transkripsiyonu azaltmak için, baskı için genellikle H3K36me3 ile işaretlenir. Bu şekilde, bir promotörle örtüşen bir lncRNA, o promotörün baskılanmasıyla sonuçlanabilir (Carrozza ve diğerleri, 2005 Fang ve diğerleri, 2010 Wagner ve Carpenter, 2012). Bu durumda, lncRNA'nın kendisinin değil, lokusun transkripsiyonu işlevsel olarak önemlidir. Bununla birlikte, lncRNA'lar için birincil etki mekanizması, ya transkripsiyon bölgesinde ya da DNA'nın yakın bölgelerinde faktör bağlamada görünmektedir (Kotake ve diğerleri, 2011 Monnier ve diğerleri, 2013 Nagano ve diğerleri, 2008 Wang ve diğerleri, 2011 Yang ve diğerleri, 2014 Yap ve diğerleri, 2010). Bir faktörü bağlamak, onu hedef yerine getirebilir (Sigova ve diğerleri, 2015) veya onu uzaklaştırabilir (Krawczyk ve Emerson, 2014). Ek olarak cis etkileri, lncRNA'ların hareket etmesi önerilmiştir. trans kromatin değiştirici proteinleri, TF'lere benzer şekilde spesifik hedef dizilere almak için (Koziol ve Rinn, 2010), ancak dizi tanımanın moleküler mekanizması bilinmemektedir ve tipik olarak düşük bolluktaki lncRNA'ların lokuslar üzerinde verimli bir şekilde etki edip edemeyeceği konusunda tartışmalar vardır. trans stokiyometrik kaygılardan dolayı (Perry ve Ulitsky, 2016). Trans-etkili lncRNA'lar nükleer yapının korunmasında (Batista ve Chang, 2013) ve sitoplazmada çevirinin düzenlenmesinde daha önemli rollere sahip olabilir (Lee ve Bartolomei, 2013 Memczak ve diğerleri, 2013 Tichon ve diğerleri, 2016).
Mekanizmadan bağımsız olarak, belirli lncRNA'ların beyin gelişiminde hayati bir rol oynadığı ve nörogelişimsel hastalıkların etiyolojisine katkıda bulunduğu görülmektedir. tehlike nöral kök hücrelerde ve yetişkin beyninde eksprese edilen temel bir lncRNA'dır. tehlike KO fareleri, nöral progenitör farklılaşması için önemli olan hücre döngüsü genlerinin yanlış düzenlenmesini sergiler ve bu farelerin yarısı doğumdan 2-20 gün sonra ölür (Goff ve diğerleri, 2015 Sauvageau ve diğerleri, 2013). Ancak, ifadesi sox2, en yakın gen tehlike ve kritik bir pluripotens faktörü etkilenmez (Sauvageau ve diğerleri, 2013). Evf2 arasında bulunan bir lncRNA'dır. Dlx5 ve Dlx6 genler, ön beyinde internöron gelişimi için önemli olan iki TF ve Evf2 transkript, kısmen metilasyonunu modüle ederek bu TF'lerin ekspresyonunu düzenler. Dlx5/6 arttırıcı (Berghoff ve diğerleri, 2013 Bond ve diğerleri, 2009). Evf2 KO fareleri, doğumdan kısa bir süre sonra hipokampusta GABAerjik nöronların sayısını ve yetişkinlerde sinaptik inhibisyonda kalıcı eksikliklere sahiptir (Bond ve diğerleri, 2009). LncND nezle primatlarında (eski dünya maymunları, maymunları ve insanlar) radyal glia proliferasyonu ve farklılaşmasında yer alan bir miRNA'nın eylemini bağlayan ve rekabetçi bir şekilde inhibe eden 16 miRNA yanıt elemanı kazanmış bir lncRNA'dır (Rani ve diğerleri, 2016). Bu miRNA'nın hareketini inhibe ederek nöral progenitör havuzunun genişlemesine yol açması, muhtemelen bu primatlarda serebral korteksin genişlemesinin bir nedenidir. Son olarak, lncRNA'ların SCZ, gelişimsel gecikme ve ASD'ye dahil olduğuna dair çok sayıda çalışmadan elde edilen kanıtlar vardır (Barry ve diğerleri, 2014 Meng ve diğerleri, 2018 Millar ve diğerleri, 2004 Talkowski ve diğerleri, 2012 Ziats ve Rennert, 2014).
Sonuçlar
Pamukta lncRNA973'ün tanımlanması
Önceki çalışmamız, daha ileri analizler için seçilen tuzla ilgili bir lncRNA, lncRNA973 [31] ile ilgiliydi. Gh_D04G0659 ve Gh_D04G0660 genleri arasında bir sens intergenik lncRNA olarak tanımlandı. RNA Pol II'den kopyalanmış gibi görünüyor ve poliadenillenmiş bir 3' uç içeriyor. İntronları ve ekzonları olan lncRNA973'ün yapısını (Şekil 1a) mRNA'ya benzer şekilde analiz ettik. Ek olarak, lncRNA973, D genomundaki kromozom 4'ün duyu zincirinde yer alır ve iki transkripti vardır (lncRNA973 X1 ve lncRNA973 X2). Karşılık gelen genomik bölge
3,2 Kb, lncRNA973 ile X1 ve lncRNA973 X2 sırasıyla 2134 bp ve 2888 bp uzunluğundadır. Ayrıca, lncRNA973 X2 lncRNA973'ten daha uzun bir eksonu vardı X1 bu nedenle, lncRNA973 ifadesini tespit etmek için primerler X2 bu ekson için tasarlandı, primerler onları lncRNA973'ten ayırt etmek için bu ekson konumunda tasarlandı X1. lncRNA973'ün ifade seviyeleri X1 ve X2 gövdede, kökte ve kotiledonda kantitatif gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) ve lncRNA973'ün ekspresyon seviyeleri kullanılarak analiz edildi. X1 köklerde ve kotiledonlarda nispeten daha yüksekken, lncRNA973'ünkiler X2 bu dokularda nispeten daha düşüktü (Şekil 1b). Ek olarak, farklı zaman noktalarında (0, 1, 3, 6, 12 ve 24 saat) NaCl (250 mmol/L) ile muamele edilmiş gerçek pamuk yapraklarında lncRNA973'ün iki transkriptinin ekspresyon seviyelerini de saptadık. lncRNA 973'ün ifadesi X1 lncRNA973 ifadesi 6 ve 24 saatte zirveye ulaşırken X2 farklı zaman noktalarında düşüktü (Şekil 1c). Böylece, lncRNA973'ü seçtik X1 daha fazla çalışma için. Ayrıca dizi koruma analizi yapılmıştır. Diğer birçok lncRNA gibi, lncRNA973'ün diğer bitkilerde homologları yoktur. lncRNA973'ün kökenini araştırmak için, diğer türlerdeki evrimini ve homolojisini analiz ettik ve onun esas olarak köken aldığı yeni bir gen olduğunu bulduk. G.raimondii. Onun dizi hizalaması G. hirsutum A genomunun 4. kromozomunda, evrimsel kökeniyle tutarlı olan hiçbir homolog bölge ortaya çıkmadı.
lncRNA973'ün özellikleri. a. Bir kromozomda lncRNA973'ün konumunun şematik diyagramı. Sarı kutular lncRNA973'ün eksonunu gösterir. P1 ve P2, lncRNA973'ün ekspresyon seviyesini saptamak için qRT-PCR için kullanılan primerleri gösterdi X1 ve lncRNA973 X2, sırasıyla. B. qPCR ile belirlenen pamuk sapı, kök ve kotiledondaki lncRNA973 transkriptlerinin ekspresyon seviyeleri. C. lncRNA973'ün ifade seviyeleri X1 ve X2 qPCR ile belirlenen farklı zaman noktalarında 250 mM NaCl ile muamele edilmiş pamuk gerçek yapraklarda. lncRNA973 ekspresyon seviyesi şu şekilde normalleştirildi: GhUBQ7 ifade seviyesi. Sap ve NaCl-0 h'deki lncRNA973'ün nispi ekspresyon seviyelerine sırasıyla 1 değeri atanmıştır. Hata çubukları, her biri üç kopya halinde ölçülen üç biyolojik kopyanın ±SD'sini gösterir. Farklı harflerle işaretlenmiş örnekler, P < 0.05. NS. lncRNA973'ün kodlama potansiyelinin analizi. Kodlama potansiyel puanları, CPC programı kullanılarak oluşturulmuştur. PHO2 ve GhActin kodlama örnekleri olarak verilmiştir, SOĞUK HAVA ve Xist kodlamayan örnekleri temsil eder
Bir biyoinformatik analizi (http://cpc.cbi.pku.edu.cn/), lncRNA973'ün kodlama kapasitesi olmadığını ortaya çıkardı (Şekil 1d). ORF Finder çevrimiçi aracı, lncRNA973 üzerinde beş ORF'yi tahmin etmek için kullanıldı X1 (Ek dosya 1: Şekil S1a), 29 ila 107 amino asit aralığındadır. Ayrıca, büyük protein ailelerinin ve alan veritabanlarının (sırasıyla Pfam ve SMART) homoloji araştırmalarına göre, peptitlerin herhangi biriyle eşleşen hiçbir fonksiyonel alan bulunmadı.
LncRNA973'ün hücre altı lokalizasyonu
lncRNA'ların işlevi, hücre altı lokalizasyonları ile ilişkilidir [32]. lncRNA973'ün hücre altı lokalizasyonunu araştırmak için, lncRNA973'e özel çift uçlu DIG etiketli bir prob kullanılarak köklerde floresan in situ hibridizasyon gerçekleştirilmiştir. lncRNA973'ün hücre altı lokalizasyonunu doğrulamak için, çekirdekler DAPI ve bir temizlik mRNA'sı ile boyandı (GhUBQ7) pozitif kontrol olarak kullanıldı. lncRNA973 için ve GhUBQ7 problar, pamuk genomunda bir dizi özgüllük analizi yapıldı ve hibridizasyon için spesifik problar seçildi. lncRNA973'ün floresan sinyali, esas olarak DIG etiketli prob ile hibridize edilmiş kök hücre çekirdeklerinde görülebilir ve ayrıca sitoplazmada zayıf sinyallerdi (Şekil 2). Pozitif kontrolün floresan sinyali GhUBQ7 çekirdek ve sitoplazmada görülebilir. Ayrıca sırasıyla sitoplazma ve çekirdeklerden RNA'yı izole ettik ve saflaştırdık ve RT-PCR için kullandık. U6 esas olarak çekirdeklerde ifade edildi, tRNA ise esas olarak sitoplazmada. Böylece, çekirdek ve sitoplazmanın ayrılması belirgindi. RT-PCR sonucu, lncRNA973'ün çekirdeklerde oldukça zengin olduğunu gösterdi (Ek dosya 1: Şekil S1b). Bu veriler, lncRNA973 transkriptlerinin esas olarak çekirdeklerde lokalize olduğunu ve sitoplazmada küçük bir sinyale sahip olduğunu gösterdi.
lncRNA973'ün hücre altı lokalizasyonu. DIG etiketli antisens lncRNA973 probları ile floresan in situ hibridizasyon, 10 günlük pamuk köklerinde gerçekleştirilmiştir. Bir temizlik mRNA'sı (GhUBQ7) pozitif kontrol olarak kullanıldı. Bar = 20 μm
LncRNA973'ün aşırı ekspresyonu, tuz stresi tepkilerini arttırır. Arabidopsis
Bitkilerin tuz stresine tepkilerinde lncRNA973'ün rolünü belirlemek için, ubiquitin protein promotörünü içeren aşırı ekspresyon vektörü olan lncRNA973 transkriptinin tam uzunluğu klonlandı (Ek dosya 2: Şekil S2a). Ubi oluşturuldu (Ek dosya 2: Şekil S2b) ve ardından Agrobacterium tumefaciens (GV3101)-aracılı vahşi tip transformasyonu (WT) Arabidopsis (Col-0 ekotipi) yapıldı. Beş bağımsız transgenik çizgi elde edildi ve üç aşırı ekspresyon (OX-) (OX-lncRNA973–2, OX-lncRNA973–3 ve OX-lncRNA973–5) daha ileri çalışmalar için seçildi (Ek dosya 2: Şekil S2c). Transgenik çizgiler, tedavi edilmediğinde kontrolden fenotipik olarak farklı değildi. Transgenikte lncRNA973 transkript ifadesini kontrol etmek için gerçek zamanlı PCR yapıldı. Arabidopsis. Transgenik bitkilerde lncRNA973'ün ekspresyon seviyeleri, WT'dekinden önemli ölçüde daha yüksekti (Ek dosya 2: Şekil S2d). Transgenik bitkilerin tuz stresi, vahşi tip (WT) ve transgenik tepkileri düzenleme yeteneklerini araştırmak Arabidopsis tohumlar (OX-lncRNA973) 0 mM, 100 mM ve 150 mM NaCl ile desteklenmiş katı 1/2 MS ortamı üzerine yerleştirildi. Daha sonra 1 ila 7 gün arasında farklı tuz konsantrasyonları ile muamele edilen tohumların çimlenme oranları ve tohum çimlenme sonrası fenotipleri belirlendi. OX-lncRNA973 çizgileri, normal (0 mM) koşullar altında hiçbir anormal fenotip göstermedi. Normal (0 mM) koşullar altında büyütülen OX-lncRNA973 hatlarının çimlenme oranları, WT'ninkiyle karşılaştırıldığında hiçbir anormal fenotiple sonuçlanmadı (Şekil 3a). 100 mM NaCl ile muameleden 3 gün sonra, OX-lncRNA973 hatlarının tohum çimlenme oranları %55 ila %60 olmuştur ve WT'ninkinden daha yüksektir. 7 günlük tuz uygulamasında, OX-lncRNA973 hatlarının ortalama tohum çimlenme oranı
WT'den daha yüksek olan %95 (
%80) (Şekil 3b). Ek olarak, WT ve OX-lncRNA973 hatlarının taze ağırlıkları, kök uzunlukları ve kotiledon yeşillenmesi, NaCl-muamele koşulları altında değişti. 100-150 mM NaCl'ye maruz kalma, OX-lncRNA973 fidelerinde kotiledon yeşillenmesini de inhibe etti, ancak etki WT'den daha az şiddetliydi (Şekil 3c). OX-lncRNA973 fideleri, kontrolden daha büyük taze ağırlıklara sahipti (Şekil 3c). Kök uzaması, 100-150 mM NaCl ile önemli ölçüde inhibe edilirken, OX-lncRNA973 fideleri, kök büyümesinin gösterdiği gibi tuz stresine karşı daha yüksek tolerans seviyelerine sahipti (Şekil 3e-f). Ek olarak, OX-lncRNA973 bitkilerinin tuzluluk stresine toleransını tartışmak için çeşitli fizyolojik göstergeleri inceledik, örneğin malondialdehit (MDA), prolin (Pro), klorofil içeriği ve katalaz (CAT) aktivitesi. Normal büyüme koşulları altında, klorofil, MDA ve Pro içerikleri ve WT ve OX-lncRNA973 hatlarındaki CAT aktivitesi benzerdi. Bununla birlikte, 200 mM NaCl ile muameleden sonra, toplam klorofil içeriği azaldı ve WT bitkilerinin klorofil içeriği, OX-lncRNA973 bitkilerinden daha fazla azaldı (Şekil 3g). MDA ve prolin içerikleri hem WT hem de OX-lncRNA973 bitkilerinde yükselmiştir ve WT bitkileri OX-lncRNA973 bitkilerinden daha fazla artmıştır (Şekil 3h-i). WT bitkilerinin CAT aktivitesi, NaCl ile muameleden sonra inhibe edildi ve OX-lncRNA973 bitkilerinin CAT aktivitesi daha yüksekti (Şekil 3j). Bu nedenle, WT ve OX-lncRNA973 bitkilerinin fenotipik analizi ve fizyolojik göstergeleri, OX-lncRNA973 bitkilerinin kontrol bitkilerinden daha fazla tuz stresine toleranslı olduğunu gösterdi.
Aşırı ifade eden lncRNA973 çizgileri, tuz stresine karşı daha toleranslıdır. a-B. Tohumlar, 0 ve 100 mM NaCl içeren ½ MS ortamında çimlendirildi. Çimlenme oranları bir hafta boyunca ölçülmüştür. C-e. 0-150 mM NaCl ile 7 günlük fidelerin birincil kökünün kotiledon yeşillendirmesi, taze ağırlıkları ve uzaması. F. 0-150 mM NaCl'ye maruz kalan 7 günlük fidelerin birincil kök büyümesinin fenotipi. G-ben. Tuz stresi altındaki yapraklardaki toplam klorofil, MDA ve Pro içerikleri. J. Tuz ve sahte ile muameleden sonra katalaz (CAT) aktiviteleri. Mock, su arıtma ile. NaCl: 200 mM NaCl işlemi. Dikey çubuklar, üç kopya ile ortalamanın ±SD'sini temsil eder. Yıldız işaretleri, transgenik bitkiler ve WT arasında ortalama değerlerin önemli ölçüde farklı olduğunu gösterir (P < 0.05)
Susturma lncRNA973, tuz stresine karşı duyarlılığa yol açar
Tuz stresine karşı pamuk direncinde lncRNA973'ün olası rollerini daha fazla araştırmak için, lncRNA973'ü G. hirsutum Gen fonksiyonlarının analizi için sıklıkla kullanılan virüs kaynaklı gen susturma (VIGS) kullanan 'SN91-11'. lncRNA973'ün VIGS dizileri ve KLOROPLASTOS ALTERADOS 1 (CLA1) genleri bağımsız olarak bir TRV2 vektörüne klonlandı (Şekil 4a), TRV2:lncRNA973 ve TRV2'yi üretti:CLA1, sırasıyla. TRV2:CLA1 ve boş TRV2 vektörü (TRV2) sırasıyla pozitif ve negatif kontroller olarak kullanıldı. Yaklaşık 490 bp lncRNA973 fragmanı ve 465 bp CLA1 VIGS sisteminde kullanılmıştır. İnfiltrasyondan yaklaşık 2 hafta sonra, işaretleyici gen TRV2:CLA1-içeren bitkiler gerçek yapraklarında albino fenotipi göstermeye başladılar (Şekil 4c). TRV2:lncRNA973-(VIGS) ve TRV2 içeren (boş vektör) pamuk bitkilerinde lncRNA973'ün ekspresyon seviyeleri, qRT-PCR kullanılarak değerlendirildi. Şekil 4b'de gösterildiği gibi, VIGS bitkilerinde lncRNA973'ün büyük ölçüde azaltılmış ifadesi, bunun başarıyla yıkıldığını göstermiştir. Genomdaki lncRNA973-bitişik gen Gh_D04G0660'ın ifadesi önemli ölçüde etkilenmedi (Ek dosya 3: Şekil S3). Tuz stresi tedavisi için iki VIGS tesisi ve bir TRV2 (boş kontrol) tesisi seçtik. Bitkiler 250 mM NaCl ile sulandı ve tuz muamelesinden 3 gün sonra, VIGS bitkileri kontrol bitkilerinden daha şiddetli solma ve yaprak dökülmesi fenotipleri gösterdi ve VIGS bitkilerinin susuz kalmış sapları ciddi şekilde kahverengiyken TRV2'nin gövdeleri bitkiler hala yeşildi (Şekil 4c). Bu nedenle, VIGS hatları tuz stresi koşullarına aşırı duyarlıydı.
Virüs kaynaklı gen susturma (VIGS) yöntemi kullanılarak lncRNA973'ün tuz stresine karşı fonksiyonel olarak tanımlanması. a. TRV2'nin yapımı:GhCLA1 ve lncRNA973 VIGS vektörleri. NOS, direnç seçimi olarak kullanılır. B. TRV2:lncRNA973 ve kontrol bitkilerinin (TRV2:00) yapraklarındaki nispi lncRNA973 transkript seviyeleri. GhUBQ7 iç kontrol olarak kullanılmıştır. Her çubuk değeri, üç bağımsız deneyin ortalama ± SD'sini temsil eder. C. 3 boyutlu tuz muamelesinde susturulmuş lncRNA973 bitkilerinin fenotipleri, solma fenotipi, etiolize yapraklar. Mock: Aynı miktarda su dökmek anlamına gelir. İçsel olanın susturulması Kloroplastos alterados 1 (CLA1) pamukta TRV aracılı VIGS ile pozitif kontrol olarak kullanıldı. 10 günlük pamuk fidanları (G. hirsutum L., özgeçmiş SN91–11) iki kotiledonlu TRV2 ile infiltre edildi:CLA1, ve bitkiler yaklaşık 2 hafta sonra gerçek yapraklarında bir albino fenotipi sergilemeye başladılar. d-f. Tuz stresi altındaki yapraklarda MDA, bağıl su ve Pro içerikleri. g-i. Tuzla muameleden sonra ROS süpürücü enzimlerin aktiviteleri: G: katalaz (CAT), H: süperoksit dismutaz (SOD), ben: sırasıyla peroksidaz (POD). j-l. TRV2:00 ve TRV2:lncRNA973 bitkilerinde su ve NaCl koşullarında sodyum (Na + ) ve potasyum (K + ) birikimi ve K + /Na + oranı. Mock, su arıtma ile. NaCl: 250 mM NaCl işlemi. *, P < 0.05 ve **, P < 0.01 tarafından Student’s T-Test uygulanmamış (Sahte) veya tuz uygulanmış TRV2 fideleri ile karşılaştırıldığında. Veri temsili ortalama ± SD
Ek olarak, VIGS pamuğunun tuzluluk stresine toleransını incelemek için MDA, Pro içeriği, bağıl su içeriği, ROS tutucu enzim aktivitesi ve Na + ve K + içerikleri gibi bazı fizyolojik göstergeleri inceledik. Normal büyüme koşulları altında VIGS ve TRV2 bitkileri arasında fizyolojik göstergelerde hiçbir farklılık yoktu. Oksidatif stresin bir göstergesi olan MDA içeriği, VIGS tesislerinde, tuz stresi koşulları altında TRV2 tesislerinden önemli ölçüde daha yüksekti (Şekil 4d). Pro ve bağıl su içeriği iki önemli stres direnci göstergesidir. Tuzla muamele edilmiş TRV2 ve VIGS tesislerinde Pro birikimi arttı, ancak birikim VIGS tesislerinde daha önemliydi (Şekil 4e). VIGS bitkilerindeki nispi su içerikleri, tuz stresi koşulları altında TRV2 bitkilerindekinden önemli ölçüde daha düşüktü, bu da VIGS bitkilerindeki su kaybının daha fazla olduğunu gösterir, bu da fenotiple tutarlıdır (Şekil 4f).
Süperoksit dismutaz (SOD), peroksidaz (POD) ve katalaz (CAT) gibi ROS süpürücü enzimlerin aktiviteleri, sıkıntıya verilen stres tepkilerinde önemli roller oynar. Tuzla muamele edilen hem TRV2 hem de VIGS bitkilerinde ROS süpürücü enzimlerin aktiviteleri azaldı, ancak VIGS pamuğu TRV2 bitkilerine kıyasla daha önemli düşüşler sergiledi (Şekil 4g). Fazla Na+ bitkiler için toksikken, K+ tuz stresi koşulları altında Na+'ya karşıttır [33]. Normal koşullar altında TRV2 ve VIGS bitkilerinde Na+ ve K+ konsantrasyonlarında hiçbir farklılık yoktu. Bununla birlikte, tuz stresine maruz kaldığında, VIGS bitkileri daha fazla Na+ biriktirdi, tersine TRV2 bitkilerinde Na+ konsantrasyonu VIGS bitkilerine kıyasla daha düşüktü (Şekil 4h).VIGS tesislerinde daha düşük K+ seviyeleri ve TRV2 tesislerinde daha yüksek seviyeler belirlendi (Şekil 4i). Na + ve K + seviyeleri arasındaki dengesizlik, VIGS tesislerinde K + /Na + oranında bir azalmaya yol açtı (Şekil 4j). Ek olarak, aynı büyüme döneminde WT pamuk fidelerinin klorofil, MDA, prolin içeriği ve CAT aktivitesini enjekte edilmiş VIGS vektörü olmadan da tespit ettik (Ek dosya 4: Şekil S4) ve fizyolojik göstergelerin önemli ölçüde farklı olmadığını bulduk. WT pamuk fideleri ve TRV2 bitkileri, böylece viral vektörün etkisi hariç tutulur. Bu sonuçlar, pamukta lncRNA973'ün susturulmasının MDA ve Pro içeriğini arttırdığını, bağıl su içeriğini ve ROS süpürücü enzim aktivitelerini azalttığını göstermiştir. Ek olarak, K + ihracatını ve dahili Na + akışını destekleyerek, K + ve Na + içeriklerinde bir dengesizliğe ve VIGS tesislerinin tuz toleransının azalmasına neden oldu. Böylece, lncRNA973 devrilme bitkileri tuz stresine duyarlıydı ve lncRNA973'ün bazı ilgili fizyolojik göstergelerin birikimini düzenleyerek tuz stresine yanıt verebileceğini ortaya koydu.
LncRNA973, pamukta tuz stresi yanıtında yer alan genlerin ekspresyonunu düzenler
Önceki transkriptom verilerine dayanarak, lncRNA973 ve kodlama genleri arasındaki ortak ifade ilişkisi ve bağlanma serbest enerjisi, transkripsiyon faktörlerini ve stresle ilgili genleri içeren ortak ifade genlerini tahmin etmek için RNAplex tarafından hesaplandı (Ek dosya 6: Tablo S1). lncRNA973'ün potansiyel fonksiyonlarını analiz etmek için, analiz için lncRNA973 ile 0.95'in üzerinde ortak ifade katsayılarına sahip protein kodlayan genleri seçtik. Bitki tuz stresi tepkileri için kritik olan bilinen genlerin ekspresyonunu daha da doğrulamak için, TRV2 ve VIGS tuz stresi fidelerinin yapraklarından ve işlenmemiş fidelerin yapraklarından toplam RNA ekstrakte edildi ve ardından gerçek zamanlı PCR ile analiz edildi. İki NADPH oksidaz geni olan respiratuar patlama oksidazları B (ROBHB) ve D (ROBHD)'nin ekspresyon seviyeleri, tuzla muamele edilmiş VIGS bitkilerinde sırasıyla %30 ve %50'den fazla azalmıştır, ancak işlenmemiş bitkilerde ekspresyon seviyelerinde önemli bir değişiklik olmamıştır. bitkiler (Şekil 5a, b). uyarılmış ifadesi Δ 1 -PİROLİN-5-KARBOKSİLAT SENTETAZ (P5CS) tuz stresi koşulları altında Pro [34] birikimini teşvik edebilir. ifadesi P5CSTRV2 hatları ile karşılaştırıldığında tuzla muamele edilmiş VIGS bitkilerinde iki kat arttı (Şekil 5c). Bu sonuçlar, Pro fizyolojik indeks sonuçlarıyla tutarlıydı. Tuz stresine yanıt olarak sodyum-potasyum iyonu ile ilgili genleri de değerlendirdik. Sodyum hidrojen eşanjörü 7 (NHX7), plazma zarı boyunca Na + gibi katyonlar için protonların elektronötral değişiminde etki eden tuz direncinde rol oynayan bir vakuolar Na + /H + antiporterini kodlar [35]. NHX7 VIGS bitkilerinde, tuz stresi koşulları altında TRV2 bitkilerinden daha fazla ifade edildi (Şekil 5d). DEHİDRASYONA DUYARLI 22 (RD22), tuz stresi tepkileriyle ilişkili absisik asit (ABA) sinyali tarafından aktive edilir [36]. Ekspresyonu ayrıca tuzla muamele edilmiş VIGS bitkilerinde de azalmıştır (Şekil 5e). Ek olarak, ROS ile ilgili genlerin ekspresyon seviyelerini analiz ettik, SOD, POD ve KEDİ. Bunların ekspresyon seviyeleri, tuz stresine maruz kalan VIGS bitkilerinde önemli ölçüde inhibe edildi, ancak kontrol bitkilerinde arttı (Şekil 5f-h). Bu arada, bu genlerin homolog genlerinin WT ve OX-lncRNA973–2/5'deki ekspresyon seviyelerini inceledik. Arabidopsis bitkiler. İşlenmemiş koşullar altında, OX-lncRNA973 bitkilerinde bu tuz stresi ile ilgili genlerin ekspresyon seviyeleri, WT'dekilere benzerdi. Arabidopsis (Ek dosya 5: Şekil S5), bunun dışında POD'da geni, önemli ölçüde yukarı regüle edilmiş ekspresyon gösterdi. Bununla birlikte, bu genlerin ekspresyonu, tuz stresinden sonra hem WT hem de OX-lncRNA973 bitkilerinde arttı. NS atRBOHB, AtRBOHD, AtPOD, AtCAT, atRD22, atRD29A, ve atRD29B (Ek dosya 5: Şekil S5a, b, f-j) OX-lncRNA973 bitkilerindeki ekspresyon seviyeleri, tuz muamelesinden sonra WT'ninkinden önemli ölçüde daha yüksekti, özellikle, POD'da, atRD29A, ve atRD29B. ifadesi AtP5CS1 ve NHX7'de OX-lncRNA973 bitkilerinde, WT'ninkinden daha düşüktü (Ek dosya 5: Şekil S5c-d). Bu veriler, lncRNA973'ün, tuz stresi tepkilerinde yer alan genlerin ekspresyonunu modüle ederek tuz stresine karşı bitki toleransını düzenleyebileceğini gösterdi.
Tuzla muamele edilmiş pamuk fidelerinde seçilen genlerin nispi ekspresyon seviyeleri. RNA, VIGS ve TRV2 pamuk fidesi yapraklarından ekstrakte edildi ve gen ekspresyon seviyeleri, RT-qPCR ile ölçüldü. GhUBQ7 gen. Göreceli ifade seviyeleri için gösterilir a. RBOHB, B. RBOHD, C. P5CS, NS. NHX7, e. RD22, F. SOD, G. KEDİ, H. POD, ben. MYB5, J. WRKY46, k. NAC29, ben. ERF62. Sahte, tuz muamelesi olmadan, NaCl: 250 mM NaCl muamelesi. *, P < 0.05 ve **, P < 0.01 tarafından Student’s T-Test uygulanmamış (Sahte) veya tuz uygulanmış TRV2 fideleri ile karşılaştırıldığında. Veri temsili ortalama ± SD
Ek olarak, transkripsiyon faktörleri lncRNA973'ün düzenlenmesinde rol oynayabilir. Bu transkripsiyon faktörleri, MYB5, WRKY46, NAC29 ve etilene duyarlı 62 (ERF62) transkripsiyon faktörlerini içerir. Transkripsiyon faktörleri ve lncRNA973 arasındaki ortak ifade katsayıları genellikle 0.99'dan büyüktü ve bu, aralarındaki olası düzenleyici ilişkileri gösterir. RT-qPCR, bu transkripsiyon faktörlerinin tuzla muamele edilmiş ve edilmemiş bitkilerde ifadesini tespit etmek için kullanıldı. MYB5 ve WRKY46'nın ekspresyon seviyeleri, VIGS bitkilerinde, tuz stresi koşulları altında kontrol bitkilerinden daha düşüktü (Şekil 5i-j). NAC29 ve ERF62, muamele edilmemiş bitkilere kıyasla tuzla muamele edilmiş bitkilerde yüksek oranda ifade edilmiştir (Şekil 5k-1). Benzer şekilde, OX-lncRNA973 bitkilerinde ve WT'de bu transkripsiyon faktörlerinin homolog genlerinin ekspresyon seviyelerini de inceledik ve AtERF ve AtMYB5 transkripsiyon faktörlerinin tedaviden önce ve sonra önemli ölçüde değişmediğini bulduk (Ek dosya 5: Şekil S5k-l) . AtWRKY46'nın ifadesi, normal büyüyen OX-lncRNA973 bitkilerinde arttı ve tuz muamelesinden sonra OX-lncRNA973 bitkilerinde açıkça yukarı regüle edildi (Ek dosya 5: Şekil S5 m). Normal büyüyen bitkilerde AtNAC3'ün ifadesi değişmedi. WT ile karşılaştırıldığında, OX-lncRNA973 bitkilerinde NAC3'ün ifadesi, tuz muamelesinden sonra önemli ölçüde indüklendi ve ifade, WT'ninkinden önemli ölçüde daha yüksekti (Ek dosya 5: Şekil S5n). Bu nedenle, lncRNA973, çoklu genleri ve çoklu karmaşık mekanizmaları düzenleyerek tuz stresine yanıt veriyor gibi görünmektedir.
LncRNA973, miR399'u ve hedef PHO2 ifadesini etkiler
Daha önce, lncRNA973'ün miR399 ile düzenleyici bir etkiye sahip olabileceğini tahmin etmiştik [31]. lncRNA973 ve miR399'un etkileşim bölgesi ikinci eksonda bulunur (Şekil 6a). Burada, lncRNA973'ün miR399 üzerindeki düzenleyici etkisini daha fazla belirlemek için, OX-lncRNA973'te miR399 ve hedef gen PHO2 ifadesi tespit edildi. Arabidopsis ve sırasıyla TRV2:lncRNA973 pamuk bitkileri. Nakavt lncRNA973 pamuk fide köklerinde ghr-miR399 ifadesini tespit ettik. lncRNA973'ün devreden çıkarma verimliliği %60 veya daha fazla olduğunda, ghr-miR399 ekspresyon seviyesi önemli ölçüde artarken, hedefi GhPHO2 ekspresyonu önemli ölçüde engellendi. Ve demonte verimliliği %60'tan az olduğunda, ghr-miR399 ve GhPHO2 ekspresyon seviyeleri önemli ölçüde etkilenmedi (Şekil 6b). Bununla birlikte, lncRNA973'ün aşırı ekspresyonu, ath-miR399'un ekspresyonunu önemli ölçüde engellemedi ve ekspresyonu da, atPHO2 OX-lncRNA973'te önemli ölçüde değişiklik Arabidopsis bitkiler (Şekil 6c). Böylece, lncRNA973, ghr-miR399 ve hedef geninin ekspresyonunu düzenler. GhPHO2 pamukta aralarında bir ilişki bulunmazken Arabidopsis.
VIGS ve aşırı ekspresyon fidelerinde miRNA399 ve lncRNA973'ün nispi ekspresyon seviyeleri. a. ghr-miR399 ve lncRNA973 transkripti arasındaki etkileşim bölgesinin şematik diyagramı. B. lncRNA973, ghr-miR399 ve ekspresyon seviyeleri GhPHO2 TRV2:00 ve TRV2:lncRNA973 pamuk fidesi köklerinde. C. lncRNA973, ath-miR399 ve ekspresyon seviyeleri atPHO2 WT ve OX-lncRNA973 bitkilerinde. *, P < 0.05 ve **, P < 0.01 tarafından Student’s T-TRV2 tesisleriyle karşılaştırıldığında test. Veri temsili ortalama ± SD
Tanıtım
Cilt kanserinin en agresif formu olan melanomun dünya çapındaki insidansı son yıllarda hızla artmıştır. Amerika Birleşik Devletleri'ndeki yeni melanom vakalarının sayısının 2016 sonunda 10.130 ölümle 76.380'e ulaşması bekleniyor [1]. Primer melanom (PM) ameliyatla tedavi edilebilir. Ancak erken teşhis edilip cerrahi olarak çıkarılmazsa melanomun metastaz yapma olasılığı yüksektir. Bu nedenle, hem tümörijenezi hem de metastazı yönlendiren mekanizmaların tanımlanmasına ve yeni ve etkili melanom tedavi stratejilerinin geliştirilmesine acilen ihtiyaç duyulmaktadır.
Uzunluğu 200 nükleotidi aşan uzun kodlamayan RNA'lar (lncRNA'lar), proteinleri kodlamayan haberci RNA (mRNA) benzeri transkriptlerdir [2, 3]. İnsan karsinogenezinde çok önemli roller oynayan daha küçük mikroRNA'ların aksine, lncRNA biyolojik işlevlerine ilişkin anlayışımız emekleme aşamasındadır. İlk fonksiyonel lncRNA, XIST, 1990'ların başında keşfedildi XIST, dozaj eşitleme yoluyla X-kromozomundan gen ekspresyonunu inaktive eder [4, 5]. Birden fazla rapor, lncRNA'ların embriyonik kök hücre pluripotensi [6], epigenetik gen regülasyonu [7], DNA hasar yanıtı [8] ve kromatin yeniden şekillenmesi [9] dahil olmak üzere karmaşık ve çeşitli işlevleri düzenlediğini göstermiştir. Ayrıca, lncRNA'lar hücre döngüsü, proliferasyon, apoptoz ve istila dahil olmak üzere geniş kapsamlı hücresel süreçlere katılır [10].
Yeni nesil dizilemenin ortaya çıkmasıyla birlikte, büyük projeler, glioblastoma [13], yumurtalık kanseri [14], hepatoselüler karsinom [15], mide kanseri [11, 12] dahil olmak üzere karsinogenez ve kanser gelişiminde rol oynayan çoklu lncRNA'ları tanımladı [11, 12]. 16] ve kolorektal kanser (CRC) [17] bu bilgi, tanısal ve terapötik lncRNA uygulamaları için ilgi çekici olanaklar önerir. Bununla birlikte, melanom tümörijenezi ve metastazındaki lncRNA fonksiyonları hakkında çok az şey bilinmektedir. Birden fazla çalışma, melanomda lncRNA'lar için çeşitli işlevler tanımlamıştır. SPRY4-IT1'in yukarı regülasyonu, melanomda önemli bir rol oynayabilir ve insanlarda yararlı bir erken biyobelirteç olabilir [18, 19]. Tang et al. [20], PM'lere kıyasla lenf nodu metastazlarında HOTAIR'in aşırı ekspresyonunu ve hücre motilitesi ve invazyonda aktif bir rol olduğunu göstermiştir, bu da HOTAIR'ı malign melanom tedavisi için potansiyel bir hedef olarak vurgulamaktadır. Uzun bir intergenik kodlamayan RNA, CASC15, melanom ilerlemesi ile ilişkilidir ve fenotip değiştirmenin düzenlenmesinde rol oynar [21]. Başka bir lncRNA, SLNCR1, androjen reseptörüne ve beyne özgü homeobox protein 3a'ya bağlanarak melanom istilasını destekler [22]. Bununla birlikte, lncRNA'ların düşük özgüllükleri ve duyarlılıkları, tek bir hedefin melanomdaki lncRNA mekanizmalarını tam olarak gösterme olasılığının düşük olduğunu göstermektedir. Melanom tümörijenezi ve metastaz sırasında lncRNA'ların potansiyel rolleri henüz tam olarak araştırılmamıştır.
Çalışmamıza, Gene Expression Omnibus (GEO) veri tabanından daha önce yayınlanmış melanom gen ekspresyon profillerini analiz ederek başladık ve önemli lncRNA'ları tanımlamak için lncRNA profili çıkardık. Tanımlanan lncRNA profilleri daha sonra başka bir bağımsız doğrulama seti kullanılarak doğrulandı. Ardından bir Gen Ontolojisi (GO) analizi, Kyoto Genler ve Genler Ansiklopedisi (KEGG) yol analizi ve lncRNA-mRNA ortak ifade ağ analizi yapıldı. TCGA veri tabanına dayalı hayatta kalma analizi yaptık. Bulgularımız, melanom ilerlemesi ve metastazı ile ilişkili olası lncRNA ve mRNA ekspresyon profillerini ortaya çıkarabilir ve melanomun moleküler patogenezi hakkında yeni bilgiler sağlayabilir.
Uzun kodlamayan RNA PCA3'ün epitelyal yumurtalık karsinomu tümörijenezi ve ilerlemesindeki rolü
Hedefler: Yumurtalık karsinomu, kadınlarda en yüksek tümör insidansından biridir ve epitelyal yumurtalık karsinomunun (EOC) oluşumu, gelişimi ve prognozu açık bir çalışma alanı olmaya devam etmektedir. Uzun kodlayıcı olmayan RNA'ların (lncRNA'lar) epitelyal yumurtalık kanserindeki rolü, gelişmekte olan bir araştırma alanıdır.
Malzemeler ve yöntemler: LncRNA PCA3 ekspresyonu, EOC ve normal yumurtalık dokularında RT-PCR ile belirlendi. Hücre proliferasyonu, göçü, istilası ve ilgili moleküllerin ekspresyonu dahil olmak üzere tümör ilerlemesinin ve saldırganlığının göstergesi olan fenotipler, küçük enterferans yapan RNA (siRNA) ile transfeksiyon yoluyla lncRNA PCA3'ün yıkılmasının ardından EOC hücresinde analiz edildi.
Sonuçlar: Epitelyal yumurtalık kanseri dokularında lncRNA PCA3 ekspresyonu, normal yumurtalık dokusundan daha yüksekti. EOC hücrelerinde lncRNA PCA3'ün siRNA transfeksiyonu ile yıkılmasının, hücre çoğalmasını, göçünü ve istilasını önemli ölçüde baskıladığını keşfettik. Biyoinformatik tahminler ve çift lusiferaz raportör deneyleri, PCA3'ün 3'UTR'sinin miR-106b-5p için potansiyel bağlanma bölgelerine sahip olduğunu gösterir. lncRNA PCA3'ün siRNA tarafından devrilmesi, yukarı regüle edilmiş miR-106b ekspresyonu ile sonuçlandı. Ek olarak, PCA3'ün yıkılması, miR-106b tarafından düzenlenen Ras homolog gen ailesi üyesi C (RhoC), Bcl/xl, P70 ribozomal S6 kinaz (P70S6K) ve Matrix metallopeptidaz 2'nin (MMP2) protein ekspresyonunu da azalttı.
Sonuçlar: Araştırma sonuçları, lncRNA PCA3'ün, miR-106b tarafından düzenlenen gen ekspresyonunu bozarak EOC tümör oluşumunu koordine edebileceğini göstermektedir. PCA3, epitelyal yumurtalık karsinomunun klinik bakımında tahmin için yeni ve önemli bir tanısal biyobelirteç ve değerli bir belirteç olabilir.
Anahtar Kelimeler: Epitelyal yumurtalık karsinomu LncRNA PCA3 İlerleme Tümorijenezi.