Western Blot nedir?
Western Blot
(protein immünoblot), protein biyolojisi, immünogenetik, moleküler biyoloji gibi alanlarda protein solüsyonu içerisinde protein saptama ve spesifik proteinlerin tanımlanmasında yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir.
Western blot tekniği, antikor tespitinin özgüllüğü ile jel elektroforezinin rezolüsyonunu bir araya getiren bir yöntemdir.
Western Blot Yöntemi
- Örnek Hazırlama
- Jel elektroforez
- Proteinlerin membrana transferi
- Antikor inkübasyonu
- Görüntüleme ve analiz
Western Blot nasıl uygulanır?
Western blot prosedüründeki ilk adım numuneyi hazırlamaktır. Daha sonra, jel elektroforezi kullanarak bir numunedeki makromoleküller ayırılır. Ardından, ayrılan moleküller, genellikle bir nitroselüloz veya poliviniliden diflorür (PVDF) zarı olan ikinci bir matris üzerine aktarılır veya lekelenir. Daha sonra, antikorların zarın yüzeyine herhangi bir spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için zar bloke edilir.
En yaygın olarak, aktarılan protein daha sonra bir antikor kombinasyonu ile problanır: ilgilenilen proteine özel bir antikor (birincil antikor) ve birincil antikorun konakçı türüne özgü başka bir antikor (ikincil antikor). Genellikle ikincil antikor, uygun bir substrat ile birleştirildiğinde saptanabilir bir sinyal üretecek olan bir enzim ile kompleks oluşturur. Kromojenik substratlar, zar üzerinde gözle görülebilen kolorimetrik değişikliklerle sonuçlanan bir çökelti üretir.
En hassas tespit yöntemleri, antikora konjuge enzim ile reaksiyonun bir yan ürünü olarak ışık üreten bir kemilüminesan substrat kullanır. Işık çıkışı film kullanılarak yakalanabilir. Bununla birlikte, şarj bağlantılı cihaz (CCD) kameralarına dayalı dijital görüntüleme cihazları, kemilüminesan sinyali yakalamak için filme popüler alternatifler haline gelir.
Alternatif olarak, floresan sinyali yakalayabilen bir cihaz kullanılarak tespit gerektiren floresan etiketli antikorlar kullanılabilir. Floresan lekeleme daha yeni bir tekniktir ve çoğullama (tek bir leke üzerinde birden fazla proteini tespit etme) potansiyeli sağladığı için popülaritesi artmaktadır. Hangi sistem kullanılırsa kullanılsın, sinyalin yoğunluğu, zar üzerindeki antijenin bolluğu ile ilişkili olmalıdır.