15.9: DNA İzolasyonu
Hücrelerden alınan DNA, moleküler klonlama gibi birçok biyoteknoloji ve araştırma uygulaması için gereklidir. Hücrelerden DNA çıkarmak ve arındırmak için, araştırmacılar çeşitli DNA ekstraksiyon yöntemleri kullanırlar. Farklı protokollerin özellikleri farklılık gösterse de bazı genel kavramlar DNA ekstraksiyon işleminin temelini oluşturur.
Süreç
İlk olarak, DNA’nın solüsyon içine geçmesi için hücrelerin lizisi (yani parçalanması, açılması) gerekir. Hücreler, hücrelerin lizisi için güç kullanan veya öğüten homojenizatör, sonikatör veya çırpıcı gibi ekipmanlar kullanılarak fiziksel olarak parçalanabilir. Genellikle, deterjan gibi maddeler kimyasal lipid bazlı hücre zarlarını bozmak için lizis sırasında eklenir ve çekirdek ve hücreden DNA serbestlenmesine yardım eder. Santrifüjdeki dönme kuvveti hücre kalıntılarını dibe çökeltir ve hücresel malzemeler içeren lizat daha fazla işlem için toplanır.
DNA daha sonra RNA ve proteinler gibi diğer hücresel moleküllerden ayrılmalıdır. Bu nedenle, RNaz ve Proteinaz K gibi enzimler genellikle sırasıyla RNA ve proteinleri çökeltmek için lizis sırasında veya sonrasında ortama eklenir. Ayrıca, fenol ve kloroform gibi organik çözücüler genellikle DNA’yı proteinden ayırmak için kullanılır. Tipik olarak, örnek fenol-kloroform ile karıştırılır ve daha sonra tüpteki sulu ve organik bileşenleri ayırmak için santrifüj edilir. Üstteki DNA içeren sulu faz, organik fazda proteini geride bırakarak pipetlenebilir.
DNA'yı stabilize etmek ve çözelti dışına çıkmasına yardımcı olmak için DNA ekstraksiyonu sırasında genellikle tuzlar eklenir. Standart bir DNA presipitasyon yöntemi, numuneye etanol veya izopropanol gibi soğuk alkol eklemektir. Bu, DNA'nın tüpteki sıvının içinde beyaz, bulutlu bir çökeltme oluşturmasına neden olur.
Örnek daha sonra bir santrifüjde döndürülür ve DNA çökeltisinin tüpün dibinde bir pelet olarak toplanmasına neden oldu. Pelet, sıvının çıkarılması, alkolde yıkanması ve tekrar döndürmeyle yıkanır. Son yıkamadan sonra, pelet bir tamponda yeniden askıya alınır ve böylece biyoteknolojide çalışılmaya veya kullanılmaya hazır sulu bir SAF DNA çözeltisi oluşturulmuş olur.