YTÜ Çevre Mühendisliği Bölümü Çevre Mikrobiyolojisi 1 Laboratuarı ÇEVREMİZDEKİ MİKROORGANİZMALAR VE KATI VASATTA (STANDART PLATE AGAR) TESPİTLERİ 1. ÇEVREMİZDEKİ MİKROORGANİZMALAR Bakteri ve diğer mikroorganizmaların varlığını Antony van Leenwenhook (1632 - 1723) 1676 da keşfetmiştir. Louis Pasteur, 1857 ile 1876 yılları arasında yaptığı çalışmalar ile de fermantasyon olayının canlı organizmalar tarafından meydana getirildiğini kanıtlamıştır. İnsanoğlu 5000 yıldan beri süt içtiği halde, sütün mayalanması konusunda ancak 19. asırda bazı bilimsel ilerlemeler kaydedilmiştir. 1860 yılında L. Pasteur mayalanmanın sırlarını açığa çıkarmıştır. L. Pasteur ve R. Koch, mikroskop yardımı ile birçok patojenik mikroorganizmaların varlığını gün ışığına çıkarmışlardır. Ölümlere neden olan Koleranın önüne de bu aydınlanma aşamasından sonra geçilmiştir. Pasteur bir çalışmasında da 60°C dolayında sütü, bira ve şarabı birkaç dakika ısıttığında hastalık yapıcı bakterilerin (patojen mikroorganizmaların) öldüğünü buna karşılık besin değerini kaybetmediğini saptamıştır. Robert Koch (1843 - 1910), bakteri üretmek ve saf kültür olarak elde etmek için yöntemler geliştirmiştir ve 1876 yılında ise Bacillus anthracis'i bulmuş ve ilk defa bir mikroorganizmanın hastalık nedeni olabildiğini ispatlamıştır. 1882'de de Tuberkel bacillus (Mycobacterium tuberculosis), 1883 'de de kolera mikrobununu (Vibrio comma) bulmuştur. Çevremizdeki mikroorganizmaları 4 genel grupta inceleyebilir. Bunlar; bakteriler, protozoalar, mantarlar ve alglerdir. Bakteriler Bakterilerin çoğunun çapı bir milimetrenin binde birinden daha büyük değildir. Bu nedenle de burada ölçüm birimleri olarak mikrometre veya nanometre kullanılır (1 mm=10-3 mm) ve (1nm=10-6 mm). Şekillerine göre bakteriler dört grubta toplanabilir: 1. Bilya şeklinde ve küresel olanlar (*Koklar) 2. Silindirik ve düz olanlar, çubuksular (Bacıllus, Pseudomonas) 3. Kıvrımlı çubuksular, virgül şeklinde olanlar (Vibriolar) 4. Vida şeklinde olanlar (Spiraller) *Koklar; diplokok, streptokok ve stafilokoklar olarak ayrılmaktadır. Saprofit ( zararsız ) Olan Bakteriler: 1. Koliform Bakteriler a) Escherichia sp. b) Citrobacter sp. c) Klebsiella sp. d) Enterobacter sp. 2. Proteus sp. 3. Pseudomonas sp. 4. Alcaligenes sp. Patojen Olan Bakteriler: 1. Salmonella sp. 2. Shigella sp. Mantarımsı Bakteriyal Koloniler Bakterilerin koloni oluşumu, bir nevi fiziksel kümeleşme olayıdır. Burada büyüme mekanizması başlangıçta eksponansiyel, daha sonraları ortamın özelliklerine bağlı olarak karmaşık bir hal almaktadır. Arıtma sistemlerinin kenar yüzeylerinde görülür. En çok Damlatmalı filtrelerde, havuzların kenar yüzeylerinde ve bilhassa kanalizasyon borularının kenarlarında rastanır. İki boyutlu olarak hareketli bir biçimde çoğalma söz konusudur. Bu tür koloniler, sümüksü, müsülajlı bir yapı gösterirler. Bakteriyal kolonilere benzerler. Ancak mantarımsı bakteriyal koloniler ile bakteriyal koloniler aralarındaki fark, mantarımsı bakteriyal kolonilerinin amorf yapı özelliği göstermelerinden dolayı hareket etmeleri ve hücreler arası bağlantıya sahip olmalarıdır. Şekil: 10,000 kez büyütülmüş bir Escherichia coli bakteri kolonisi Koliform Bakteri Grubu Bu organizmalar patojen olmayıp suda mevcut olmaları dışkı ile bir kirlenmeyi ve buna bağlı olarak potansiyel bir tehlikeyi işaret eder. Tifo, dizanteri, kolera gibi hastalıklar bir bağırsak enfeksiyonu olduğundan, koliform bakterilerinin herhangi bir suda bulunması, yukarıdaki hastalıklara sebep olan bakterilerin o suda var olacağı ihtimalini gösterir. Yani bu bakteriler böylesi bir tehlikenin indikatörüdürler. Bu sebepten bunların suda olmayışları patojen bakterilerin olmayışının bir göstergesidir. Dışkının 1 gramında 105 - 106 civarında bakteri mevcuttur ve bunların % 95 'i koliform grubu bakteriler teşkil etmektedir. Sularda koliform bakterilerinin aranmasının sebebi; bunların patojen olan bakterilere oranla daha kolay daha ucuz ve daha kısa sürede tesbit edilebilmeleridir. Koliform grubunu oluşturan bakteriler; tamamı aerobik veya fakültatif anaerobik olan, gram-negatif, spor oluşturmayan, çomak şeklinde, laktozdan 35 0C’de 48 saat içerisinde gaz ve asit oluşturan bakteriler olarak tarif edilir. Koliform grubu bakterilerin önemli bir türü olan Escherichia coli, 2-4 µm boyunda 0,4-0,7 µm eninde, düz, uçları yuvarlak çomak biçiminde bakterilerdir. Haraketleri tifo basiline (Salmonella typhi ) göre daha yavaştır. Escheria coli fakültatif anaeroptur. Optimal üremesi 35 0C’dir. Normal besiyerinde kolay ve bol ürerler. Sıvı besiyerinde homojen olarak ürerler ve kültürleri feçes (dışkı) kokusundadır. Koliform bakterilerin asıl kaynağını insan ve hayvanların ( sıcak kanlı hayvanların ) dışkıları oluşturmaktadır. Dolayısıyla, yerleşim merkezlerindeki; kanalizasyon suları ile bunlarla kirletilmiş olan sıvı atıklar ve katı atık sızıntı suları önemli koliform kaynaklarıdır. Protozoalar Şekil: Paramecium sp. (terliksi) Şekil: Amip, Terliksi, Kamçılı Protozoa ya da bir hücreliler; genellikle mikroskobik, bir hücreli ve ökaryotik canlıları içeren bir Protista alt alemidir. Tek hücreli olmalarına rağmen, çok hücrelilerde görülen yaşamsal işlevlerin birçoğunu yapabilirler. Bu nedenle eski zamanlarda vücut maddesi hücrelere ayrılmamış hayvanlar olarak kabul edilmiş ve "Hücresizler" adıyla anılmıştır. Sitoplazmalarında bulunan özelleşmiş yapılara "organel" denilmekte, hareket, sindirim, boşaltım gibi hayatsal faaliyetlerini bunlarla sağlamaktadırlar. Çoğu bir çekirdekli, (Monoenergid), bir kısmı da her zaman çok çekirdek taşıyan (Polienergid) canlılardır. Bazıları ise yaşamlarının belli bir kısmıda çok çekirdek taşırlar. Organel olarak; çekirdek, endoplazmik retikulum, ribozom, golgi aygıtı, mitokondri, lizozom, peroksizom, mikrotubuluslar ve filamentler bulundurular. Hareket organelleri olarak yalancı ayaklar, kamçılar, siller, sirler ve tentaküller görülür. Beslenme şekillerinde ototrof, saprozoyik, parazitik, kommensal, miksotrof ya da heterotrof beslenme görülür. Boşaltımda en belirgin özelliklerinden biri; ritmik olarak şişen ve küçülen vurgan (kontraktil) kofulların bulunmasıdır. Birçok denizel türde ve parazitlerde bu vurgan kofullar görülmez. Çoğalmalarında; eşeysiz olarak; boyuna bölünme, çoğa bölünme, enine bölünme, zırh oluşturduktan sonra ikiye bölünme, hücre dışı tomurcuk oluşturma ve hücre içi tomurcuk oluşturma görülür. Eşeyli çoğalmalarında; kaynaşma (hologami), merogami ve konjugasyon görülür. Tek olarak ya da koloni şeklinde yaşayan tek hücreli canlılardır. Bugüne kadar 60.000 kadar türü tanımlanmış ve bunların yaklaşık 1/4'ü parazit olarak bilinir. Mantarlar Şekil: Mantarlar Mantarlar kök, gövde, yaprak, çiçek ve klorofile sahip olmayan ökaryotik, heterotrofik çok hücreli organizmalardır. Klorofilin bulunmaması nedeniyle fotosentez olayına rastlanamaz. Çok hücreli ve büyük olmaları, üreme tarzları, yaşam siklusları, çekirdek etrafında bir zarın bulunması, çok kromozoma sahip olması, nukleolus içermeleri ve hücre içi organellerin (mitokondrium, golgi aparatı, endoplasmik retikulum, vesikül, vakuol, vs) bulunmaları gibi nedenlerle prokaryotiklerden ayrılırlar. Mantarlar doğada (kara ve sularda) çok yaygın bir yaşam spektrumu gösterirler. Büyük bir çoğunluğu saprofitik bir yaşantıya sahip olup kendilerine gerekli gıda maddelerini cansız materyallerden ve basit organiklerden temin ederler. Bir kısım mantarlar da, insan ve hayvanların yanı sıra, bitki, balık, kerevit, algler, insektler vs. canlılar üzerinde parazitik, sembiyotik veya komensal bir yaşam içinde bulunurlar. Şimdiye dek 110000' den fazla mantar türü (bunun 30000' den fazlası Basidiomycetes, 30000 den fazlası Deuteromycetes, 30000 den fazlası Ascomycetes sınıflarına aittir) saptanmış olup bazılarının da karakterleri henüz tam olarak aydınlatılamamıştır. Çok doğaldır ki bu kadar fazla ve aynı zamanda çeşitlilik gösteren türlerin bütün özelliklerini ayrıntıları ile saptamak, açıklamak oldukça güç, zaman alıcı olup bazılarının biyokimyasal, sitolojik, fizyolojik ve genetik özellikleri de hala tam bir açıklığa kavuşturulamamıştır. Mantar Koloniler Mantar kolonileri tamamıyla misel şeklinde dallanma gösteren ve büyüme yönleri tek bir yöne doğru olan koloni şeklidir. Bu tür koloniler genellikle koenotik hücre tipine sahiptirler. Mantar kolonileri dallı bir yapı gösterirler ve çok hücreli bölünme tipine sahiptirler. Mantar kolonileri özellikle düşük pH ve nütrient eksikliğine sahip atıksuların arıtıldığı arıtma sistemlerinde büyüyüp gelişebiliyorlar. Biyolojik arıtma sistemlerinde çökelme problemine neden oldukları için bulunmaları istenmez. Mantar kolonilerini oluşturan hücrelerde birbirine bağımlı yaşama şekli mevcuttur. Algler Şekil: Algler Algler, gerek yapısal olarak gerekse dış görünüşleri bakımından oldukça farklı görünümdedirler. Yapısal olarak; eukaryotik (gelişmiş hücre tipi) ve prokaryotik (basit yapılı hücre tipi) olmak üzere iki büyük gruba ayrılırlar. Buna göre Mavi-Yeşil algler göstermiş oldukları hücre organizasyonları bakımından prokaryot hücre özelliği taşımaktadırlar. Algler su ortamında primer üretici canlılardır. Yapılarındaki pigmentleri sayesinde Karbondioksit ve suyu, ışığın etkisi ile karbonhidratlara çevirirler böylece su ortamındaki besin değerinin ve çözünmüş oksijen oranının artmasını sağlarlar. Sonuçta kendi gelişimlerini sağlayarak besin zincirinin ilk halkasını oluştururlar. Bu şekilde üretime olan katkıları ve üst basamaktaki canlılarla olan ilişkileri açısından önem taşımaktadırlar. Alglerin üretimleri çevresel faktörlerle sınırlanmıştır. Bunlar ışık, sıcaklık ve besindir. Bu sınırlayıcı faktörler iyileştirilirse, üretim düzeyi artar. Üretim artışının belli bir düzeyi aşmasının doğal bir sonucu olarak da çevresel denge bozulur ve bu gelişeme eutrofikasyon adı verilir. Eutrofikasyonun sonuçlarından birisi de aşırı alg patlamalarının görülmesidir. Bunun anlamı, fitoplankton (alglerin serbest yüzen formları) populasyonlarının suyun rengini, kokusunu ve ekolojik dengesini bozacak yeterli yoğunluğa ulaşmasıdır. Bunun yanı sıra alglerin aşırı gelişmesi, sucul ortamdaki bir çok canlı için toksik etkilere neden olduğu için ölümler görülebilmektedir. Örneğin, Dinoflagellatlardan Gymnodinium ve Gonyanlax'a ait türler aşırı çoğalma sonucu, hayvanların sinir sistemlerini etkileyen, yüksek oranda suda çözünebilen toksik madde üretirler. Diğer patlamalara ise Mavi-Yeşil alglerden Microcystis, Anabaena, Nostoc, Aphanizomenon, Gloeotrichia ve Oscillatoria, Chrysophyte'den Prymnesium parvum neden olmaktadır. Çevremizdeki Mikroorganizmaların Tespiti Deney 1 Gerekli Malzemeler Katı besiyeri (Standart Plate Agar) Distile su Otoklav Steril baget veya ekübuyyon çubuğu Steril petri kutuları İsporto Ocağı Etil alkol İnkübatör Koloni Sayacı Mikroskop Deneyin Yapılışı Standart plate agar katı besiyeri hazırlanır (22.5 g/l). 2 saat içerisinde otoklavda steril edilir (120 ºC sıcaklık,1 atm basınçta 15 dk). Steril olarak hazırlanmış katı besiyerleri otoklavdan çıktığında sıvı haldedir ve bu şekilde steril petri kutularına ispirto ocağı çevresinde aseptik şartlarda dökülerek soğutulur. Daha sonra incelenecek ortamda petri kutusunun kapağı açılarak 10 dakika beklenir (tuvaletler, kantinler, yemekhane, derslikler ve laburatuvarlar çevresel ortam olarak seçilebilir). Daha sonra kapak kapatılır. Steril baget veya ekübuyyon çubuğu steril su ile ıslanır ve incelenecek yüzeye sürülerek numune alınır, Petri kutusundaki katı vasat üzerine ekim yapılarak kapak kapatılır. Ekim yapılan petri kutuları etiketlenip ters olarak etüve konarak, 20±2 0C sıcaklıkta inkübasyona tabi tutulur. 24 ve 48 saat sonra oluşan koloniler gözlenir. Sonuçlar Oluşan koloniler sayılır. Mikroskopta koloni tipi ve renk farklılıklarından, türler tespit edilir. Deney 2 Prokaryotik organizmalardan Mavi-Yeşil Alglerin mikroskobik incelenmesi ve morfolojik yapılarını kabaca gözlemlenmesi. Gerekli Malzemeler Mavi-yeşil alg kültürü Steril 1 ml lik pipet Lam ve Lamel Mikroskop Deneyin Yapılışı Temiz bir lam alınır. Üzerine steril 1 ml lik pipet yardımıyla bir damla Mavi-yeşil alg kültürü konur. Numunenin üzerine lamel kapatılır. Mikroskopta 10x olarak, düşük büyütmeli objektiften başlayarak incelenir. Sonuçlar Mikroskopta Mavi-yeşil alg hücreleri taşıdıkları renk pigmentleri vasıtasıyla morfolojik olarak teşhis edilir. Deney 3 Ökaryotik organizmalardan Alglerin, Protozoaların ve Mantarların mikroskobik incelenmesi ve morfolojik yapılarını kabaca gözlenmek. Gerekli Malzemeler Alg, Protoza ve Mantar Kültürleri Steril 1 ml lik pipet Lam ve Lamel Mikroskop Deneyin Yapılışı Temiz bir lam alınır. Üzerine steril 1 ml lik pipet yardımıyla incelenecek kültürden bir damla konur. Numunenin üzerine lamel kapatılır. Mikroskopta 10x olarak, düşük büyütmeli objektiften başlayarak incelenir. Sonuçlar Mikroskopta; • • • Alg hücreleri taşıdıkları renk pigmentleri vasıtasıyla tek hücreli veya çok hücreli ipliksi olarak morfolojik olarak teşhis edilir. Protoza türleri, terliksi hayvan, paramesium, amipler ve çan hayvancığı morfolojik olarak gözlenir. Mantar hücrelerinden maya hücreleri gözlenir.