Lizis için Sonikasyon: Hücre Bozulması ve Ekstraksiyonu
Hücre parçalanması veya lizis, biyoteknoloji laboratuvarlarında günlük numune hazırlamanın ortak bir parçasıdır. Lizisin amacı, biyolojik molekülleri serbest bırakmak için hücre duvarının parçalarını veya tüm hücreyi bozmaktır. Ultrasonik homojenizatörler başarılı hücre lizisi için yaygın olarak kullanılmaktadır. Sofistike ultrasonicators en büyük avantajı, nazik, ancak yüksek verimli hücre bozulması ve ekstraksiyonu için izin veren yoğunluk ve sıcaklık gibi işlem parametreleri üzerinde hassas kontroldür.
Ultrason kullanarak Hücre Lizisi
Ultrasonik hücre lizisi ve ekstraksiyonu, açık hücreleri kırmak ve yüksek frekanslı ses dalgaları, yani ultrason kullanarak içeriği çıkarmak için kullanılan bir yöntemdir. Sonikasyon, hücre içi materyalin hücre bozulması ve ekstraksiyonu için yerleşik ve güvenilir bir yöntem olarak yaygın olarak kullanılan bir lizis tekniğidir. Ultrasonik lizis, örneğin plazmid, reseptör tahlilleri, proteinler, DNA, RNA vb. Lisat içeren lizat hazırlamak için güvenilir bir tekniktir. Ultrasonik yoğunluk, işlem parametrelerini ayarlayarak seviyelendirilebildiğinden, çok yumuşaktan yoğuna kadar optimal sonikasyon yoğunluğu, belirli uygulama gereksinimlerini karşılamak için her madde ve ortam için ayrı ayrı ayarlanabilir. Lizisin sonraki adımları fraksiyonasyon, organel izolasyonu veya / ve protein ekstraksiyonu ve saflaştırılmasıdır. Ekstrakte edilen materyal (= lizat) ayrılmalı ve proteomik araştırma gibi daha ileri araştırmalara veya uygulamalara tabi tutulmalıdır.
Diğer hücre lizisi ve ekstraksiyon yöntemleriyle karşılaştırıldığında, ultrasonik hücre lizisinin çeşitli avantajları vardır:
- Hız: Ultrasonik hücre lizisi ve ekstraksiyonu, birkaç saniye içinde açık hücreleri kırabilen hızlı bir yöntemdir. Bu, homojenizasyon, donma çözme veya boncuk öğütme gibi diğer yöntemlerden çok daha hızlıdır.
- verimlilik: Ultrasonik hücre lizisi ve ekstraksiyonu, küçük, büyük veya birden fazla numuneyi aynı anda tedavi etmek için kullanılabilir, bu da küçük numunelerin bireysel olarak işlenmesini gerektiren diğer yöntemlerden daha verimli hale getirir.
- Kimyasal içermez: Ultrasonik hücre lizisi ve ekstraksiyonu, sert kimyasalların veya enzimlerin kullanılmasını gerektirmeyen invaziv olmayan bir yöntemdir. Bu, hücre içeriğinin bütünlüğünün korunması gereken uygulamalar için idealdir. Numunelerin istenmeyen kontaminasyonu önlenebilir.
- Yüksek verim: Ultrasonik hücre lizisi ve ekstraksiyonu, DNA, RNA ve proteinler de dahil olmak üzere hücresel içeriklerin yüksek verimini çıkarabilir. Bunun nedeni, yüksek frekanslı ses dalgalarının hücre duvarlarını kırması ve içeriği çevreleyen çözeltiye bırakmasıdır.
- Sıcaklık kontrolü: Gelişmiş ultrasonsiatörler, numunenin hassas sıcaklık kontrolüne izin verir. Hielscher dijital ultrasonik takılabilir sıcaklık sensörü ve sıcaklık izleme yazılımı ile donatılmıştır.
- Tekrarlanabilir: Ultrasonik hücre lizisi protokolleri kolayca çoğaltılabilir ve hatta basit bir doğrusal ölçek büyütme ile farklı daha büyük veya daha küçük numune hacimleriyle eşleştirilebilir.
- Çok yönlü: Ultrasonik hücre lizisi ve ekstraksiyonu, bakteri, maya, mantar, bitki ve memeli hücreleri dahil olmak üzere çok çeşitli hücre tiplerini çıkarmak için kullanılabilir. Ayrıca proteinler, DNA, RNA ve lipitler dahil olmak üzere farklı molekül türlerini çıkarmak için de kullanılabilir.
- Çok sayıda numunenin eşzamanlı hazırlanması: Hielscher Ultrasonics, aynı işlem koşulları altında çok sayıda numuneyi rahatça işlemek için çeşitli çözümler sunar. Bu, numune hazırlama lizis ve ekstraksiyon adımını son derece verimli ve zaman kazandırıcı hale getirir.
- Kullanımı kolay: Ultrasonik hücre lizis ve ekstraksiyon ekipmanının kullanımı kolaydır ve minimum eğitim gerektirir. Ekipman, bertaraf işlemlerinin yeniden satın alınmasına gerek kalmadan tek bir yatırım olduğu için de ekonomiktir. Bu, çok çeşitli araştırmacılar ve laboratuvarlar için çekici kılar.
Genel olarak, ultrasonik hücre lizisi ve ekstraksiyonu, hücresel içeriği çıkarmak için hızlı, verimli, hassas bir şekilde kontrol edilebilir ve çok yönlü bir yöntemdir. Alternatif yöntemlere göre avantajları, onu çok çeşitli araştırma ve endüstriyel uygulamalar için cazip bir seçim haline getirmektedir.
Ultrasonik Hücre Lizisinin Çalışma Prensibi
Ultrasonik hücre lizisi ve ekstraksiyonu, hücreleri bozmak ve içeriklerini çıkarmak için yüksek frekanslı ses dalgaları kullanır. Ses dalgaları, çevreleyen sıvıda basınç değişiklikleri yaratarak, kavitasyon olarak bilinen bir süreçte küçük kabarcıkların oluşmasına ve çökmesine neden olur. Bu kabarcıklar, açık hücreleri kırabilen ve içeriklerini çevreleyen çözeltiye bırakabilen lokalize oldukça yoğun mekanik kuvvetler üretir.
Bir ultrasonicator kullanarak hücre lizisi genellikle aşağıdaki adımları içerir:
- Numune, sıvı tamponlu bir tüp veya kaba yerleştirilir.
- Numuneye ultrasonik bir prob yerleştirilir ve yaklaşık 20-30 kHz'lik yüksek frekanslı ses dalgaları uygulanır.
- Ultrason dalgaları, çevreleyen sıvıda salınıma ve kavitasyona neden olur, açık hücreleri kıran ve içeriklerini serbest bırakan lokalize kuvvetler üretir.
- Numune, herhangi bir hücresel kalıntıyı gidermek için santrifüj edilir veya filtrelenir ve çıkarılan içerikler aşağı akış analizi için toplanır.
Yaygın Lizis Yöntemlerinin Dezavantajları
Laboratuvarlardaki çalışmanız sırasında, geleneksel mekanik veya kimyasal lizis protokollerini kullanarak hücre lizisinin zorluğunu zaten yaşamış olabilirsiniz.
- Mekanik lizis: Harç ve havaneli taşlama veya bir Fransız presi, boncuk değirmeni veya rotor-stator sistemi kullanarak homojenizasyon gibi mekanik lizis yöntemleri genellikle hassas kontrol ve ayar seçeneklerinden yoksundur. Bu, frezeleme ve öğütme kullanımının, numuneye zarar verebilecek ve proteinleri denatüre edebilecek ısı ve kesme kuvvetlerini hızlı bir şekilde üretebileceği anlamına gelir. Ayrıca zaman alıcı olabilirler ve büyük miktarda başlangıç malzemesi gerektirebilirler.
- Kimyasal lizis: Deterjan bazlı lizis gibi kimyasal lizis yöntemleri, lipit çift katmanını bozarak ve proteinleri denatüre ederek numuneye zarar verebilir. Ayrıca birden fazla adım gerektirebilirler ve çıkış yönündeki uygulamalara müdahale eden artık kirleticiler bırakabilirler. Optimum deterjan dozajını bulmak ek bir zorluktur.
- Donma-çözülme döngüleri: Donma-çözülme döngüleri hücre zarlarının yırtılmasına neden olabilir, ancak tekrarlanan döngüler de protein denatürasyonuna ve bozulmasına neden olabilir. Bu yöntem aynı zamanda zaman alıcı olabilen ve genellikle daha düşük verimle sonuçlanan çoklu döngüler gerektirebilir.
- Enzimatik lizis: Enzimatik lizis yöntemleri belirli hücre tiplerine özgü olabilir ve birden fazla adım gerektirir, bu da onları zaman alıcı hale getirir. Ayrıca atık oluştururlar ve numunenin bozulmasını önlemek için dikkatli optimizasyon gerektirirler. Enzimatik lizis kitleri genellikle pahalıdır. Mevcut enzimatik lizis prosedürünüz yetersiz sonuç verirse, hücre bozulmasını yoğunlaştırmak için sinerjik yöntem olarak sonikasyon uygulanabilir.
Geleneksel mekanik ve kimyasal hücre lizis yöntemlerinin aksine, sonication sonication parametreleri üzerinde tam bir kontrol sağlayan hücre parçalanması için çok verimli ve güvenilir bir araçtır. Bu, malzeme salınımı ve ürün saflığı konusunda yüksek seçicilik sağlar. [Bkz. Balasundaram ve ark., 2009]
Tüm hücre tiplerine uygundur ve küçük ve büyük ölçekte kolayca uygulanabilir – her zaman kontrollü koşullar altında. Ultrasonicators temizlemek kolaydır. Bir ultrasonik homojenizatör her zaman yerinde temizlik (CIP) ve yerinde sterilize (SIP) fonksiyonuna sahiptir. Sonotrode, su veya çözücü içinde silinebilen veya yıkanabilen (çalışma ortamına bağlı olarak) büyük bir titanyum boynuzdan oluşur. Ultrasonicators bakımı sağlamlıkları nedeniyle neredeyse ihmal edilebilir.
Ultrasonik Lysis ve Hücre Bozulması
Genel olarak, laboratuardaki örneklerin parçalanması 15 saniye ila 2 dakika arasında sürecektir. Sonikasyon yoğunluğunun genleşme ayarının yanı sıra doğru ekipmanın seçilmesi ile ayarlanması çok kolay olduğundan, hücre yapısına ve parçalanma amacına bağlı olarak hücre zarlarını çok yavaş veya çok aniden kesmek mümkündür ( Örneğin, DNA ekstraksiyonu daha yumuşak bir sonikasyon gerektirir, tam protein ekstraksiyonu, daha yoğun bir ultrason tedavisi gerektirir). İşlem sırasındaki sıcaklık, entegre bir sıcaklık sensörü ile izlenebilmekte ve soğutma (buzdolabı veya soğutma ceketli akış hücreleri) veya darbeli modda sonikasyon ile kolayca kontrol edilebilmektedir. Darbeli mod sonication sırasında, 1-15 saniye süreli kısa sonikasyon patlama döngüleri, daha uzun aralıklı dönemlerde ısı yayılımına ve soğutmaya izin verir.
Tüm ultrason güdümlü süreçleri tamamen tekrarlanabilir ve doğrusal olarak büyütülebilir.
Hücre Lizisi ve Ekstraksiyonu için Ultrasonik Homojenizatörler
Çeşitli ultrasonik cihaz türleri, numune hazırlama hedefinin eşleştirilmesine ve kullanım kolaylığının ve çalışma konforunun sağlanmasına izin verir. Prob tipi ultrasonicators laboratuarda en yaygın cihazlardır. 0,1 mL'den 1000 mL'ye kadar hacimlere sahip küçük ve orta ölçekli numunelerin hazırlanması için en uygun olanlardır. Farklı güç boyutları ve sonotrodlar ultrasonicator örnek hacmine ve en etkili ve verimli sonicating sonuçları için kap uyarlamak için izin verir. Ultrasonik prob cihazı, tek numunelerin hazırlanması gerektiğinde en iyi seçimdir.
Daha fazla numunenin hazırlanması gerekiyorsa, örneğin 8-10 şişe hücre çözeltisi, VialTweeter veya ultrasonik bir cuphorn gibi ultrasonik sistemlerle yoğun bir dolaylı sonikasyon, verimli bir lizis için en uygun homojenizasyon yöntemidir. Birkaç şişe aynı anda, aynı yoğunlukta sonikleştirilir. Bu sadece zaman kazandırmakla kalmaz, aynı zamanda tüm numunelerin aynı şekilde işlenmesini sağlar, bu da numuneler arasındaki sonuçları güvenilir ve karşılaştırılabilir kılar. Ayrıca, dolaylı sonikasyon sırasında ultrasonik sonotrode (ultrasonik prob, boynuz, uç veya parmak olarak da bilinir) daldırılarak çapraz kontaminasyon önlenir. Ayrı ayrı numune boyutuna uygun şişeler kullanıldığından, zaman alıcı temizlik ve kapların boşaltılmasından kaynaklanan numune kaybı ihmal edilir. Multiwell veya mikrotiter plakalarının üniform sonikasyonu için, Hielscher UIP400MTP'yi sunar.
Daha yüksek miktarlar için, örneğin, hücre ekstraktlarının, ticari üretim için, bir akış hücresi reaktörünün sürekli ultrasonik sistemler çok uygundur. işlenmiş malzemenin sürekli ve eşit akış daha sonikasyon temin eder. Ultrasonik ayrışma işleminin tüm parametreleri optimize ve uygulamaya ve özel hücre malzemenin gerekliliklerine ayarlanabilir.
Bakteriyel hücrelerin ultrasonik parçalanması için örnek prosedür:
- Hücre süspansiyonunun hazırlanması: Hücre topakları tamamen (aşağıdaki analiz, örneğin, belirli bir kromatografi yöntemi ile uyumlu için tampon çözeltisi tercih) solüsyonuna bir tampon çözeltisi içinde süspansiyon haline getirilmesi gerekir. Gerekirse lysozymes ve / veya başka katkı maddeleri ekleme, (bunlar ayırma / arıtma araçları ile de uyumlu olması gerekir). / Karıştırın komple süspansiyon elde edilene kadar hafif sonikasyon altında yavaşça çözelti homojenleştirin.
- Ultrasonik lizis: Bir buz banyosu içinde örnek yerleştirin. Hücre bölündükten için, (sizin ultrasonikatör nabzı modunu kullanarak) 60-90 saniye patlamaları de süspansiyon sonikasyon.
- (Ör. 10 dakika 10,000 x g; 4degC da): Ayırma Santrifüj lizatı. dikkatli bir şekilde, hücre peletinin yüzen kısmı ayırın. Üst faz, toplam hücre lizatı olup. yüzer filtrasyonundan sonra, çözünür hücre proteininin bir açıklık sıvı elde edin.
biyoloji ve biyoteknoloji alanlarında ultrasonicators için en yaygın uygulamalar şunlardır:
- Hücre ekstraktı hazırlama
- Maya, bakteri, bitki hücreleri, yumuşak veya sert hücre dokusu, nükleik materyalin bozulması
- Protein Ekstraksiyon
- Hazırlama ve enzimlerin izolasyonu
- antijenleri üretimi
- ve / veya hedeflenen parçalanma DNA ekstraksiyon
- lipozom hazırlama
Aşağıdaki tablo size hücre bozulması ve ekstraksiyonu için ultrasonicators üzerinden bir genel bakış sağlar. Her ultrasonik homojenizatör hakkında daha fazla bilgi edinmek için cihaz türüne tıklayın. İyi eğitimli ve uzun süreli deneyimlerimiz teknik personelimiz, örnekleriniz için en uygun ultrasonicator'ı seçmenize yardımcı olmaktan mutluluk duyacaktır!
|Numune Hacmi||Akış Oranı||Önerilen Cihaz|
|10 şişeye veya tüpe kadar||n.a.||VialTweeter|
|multiwell / mikrotiter plakalar||n.a.||UIP400MTP|
|çoklu tüpler / kaplar||n.a.||CupHorn|
|1 - 500mL||10 - 200mL/min||UP100H|
|10 ila 1000mL||20 ila 200mL/dak||UP200Ht, UP200St|
|10 - 2000mL||20 - 400mL/min||UP400St|
biyoteknoloji, biyomühendislik, mikrobiyoloji, moleküler biyolojisi, biyokimya, immünoloji, bakteriyolojik özellikleri, viroloji, proteomik, genetik, fizyoloji, hücre biyolojisi, hematoloji ve botanik sektörlerinde üzerinden ultrason dallarının çeşitli uygulamalar.
Lizis: Hücre Yapılarının Kırılması
Hücreler, bir fosfo-lipid iki katmanının (Aynı zamanda Protein-lipit çift katmanı hidrofobik lipidler ve gömülü protein molekülleri ile hidrofilik fosfor moleküllerinin oluşturduğu) 'de oluşan bir yarı geçirgen bir plazma membranı ile korunur ve hücre iç kısımları arasında bir set (sitoplazma) oluşturur ve Hücre dışı ortam. Bitki hücreleri ve prokaryotik hücreler hücre duvarı ile çevrilidir. Nedeniyle çok katmanlı selüloz kalın hücre duvarı, bitki hücreleri, hayvan hücreleri daha parçalanır zordur. bu organelleri, çekirdek, mitokondri gibi hücre iç, hücre iskeleti tarafından stabilize edilir.
hücrelerin parçalanması ile, bu ayıklanması ve organeller, proteinler, DNA, mRNA veya başka biyomoleküllerin ayırma amaçlanmıştır.
Geleneksel hücre lizisi yöntemleri ve dezavantajları
deterjanlar veya çözücülerin kullanımı, yüksek basınç uygulaması veya bir bilyalı değirmen veya bir Fransız pres kullanılmasını içerir, mekanik ve kimyasal yöntemler, ayrılabilir hücreleri, lizata için birkaç yöntem vardır. Bu yöntemlerin en sorunlu dezavantajı zor bir şekilde kontrol ve işlem parametrelerinin ayarlanması ve bu şekilde etkisidir.
Aşağıdaki tabloda, yaygın lizis yöntemlerinin ana dezavantajları gösterilmektedir:
Lizis Prosedürü
Liziz hassas bir işlemdir. liziz sırasında hücre zarının koruması, fizyolojik olmayan bir ortamda (pH değerden sapma) ile ekstre edilmiş proteinlerin ancak inaktivasyonu, denatürasyon ve ayrışma önlenmelidir, yok edilir. Bu nedenle, genel liziz bir tampon çözeltisi içinde gerçekleştirilmektedir. Çoğu zorluklar tüm hücre içi materyal ve / veya hedef ürünün denatürasyon bir hedefsiz salınımı ile sonuçlanan kontrolsüz hücre bozulma nedeniyle ortaya.
Edebiyat referansları
- Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
- Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
- Brandy Verhalen, Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.