DNA (deoksiribonükleik asit)
DNA, canlı hücrelerde genetik bilginin saklandığı tek kromozomal komponenttir. DNA’da saklı olan genetik bilgi, replikasyon suretiyle kalıtılabilmekte ve transkripsiyon olayı ile RNA’ya aktarıldıktan sonra translasyon olayı ile protein haline çevrilebilmektedir.
DNA’nın yapısı hakkında en önemli ipucu Erwin Chargaff ve meslektaşlarının 1940 sonlarındaki çalışmalarında bulundu. Erwin Chargaff ve meslektaşları, DNA’daki dört nükleotid bazının, farklı organizmaların DNA’larında farklı oranlarda bulunduğunu ve bazı bazların miktarları arasında ilişkiler olduğunu buldular ki bu çalışmaların sonuçları, Chargaff kuralları diye bilinir: 1) DNA’nın baz kompozisyonu genellikle türden türe değişir. 2) Aynı türlerin farklı dokularından izole edilen DNA örnekleri aynı baz kompozisyonuna sahiptirler. 3) Belli bir türdeki DNA’nın baz kompozisyonu yaş, beslenme durumu ve çevre değişimi ile değişmez. 4) Türler ne olursa olsun bütün DNA’larda adenin (A) kalıntılarının sayısı timin (T) kalıntılarının sayısına eşittir ve guanin (G) kalıntılarının sayısı sitozin (C ) kalıntılarının sayısına eşittir (A = T ve G = C). Buna göre pürin kalıntılarının toplamı pirimidin kalıntılarının toplamına eşittir (A+G = T+C). Adenin ve guanin, DNA’larda en sık rastlanan pürinlerdir; sitozin ve timin, insan ve diğer tür DNA’larda en sık rastlanan pirimidinlerdir. A+T/G+C oranı türe göre değişir ki insan ve hayvan DNA’larında A ve T çoktur, bakteri ve virüs DNA’larında G ve C çoktur.
Rosalind Franklin ve Maurice Wilkins, DNA’nın yapısını aydınlatmak ve DNA kristallerini analiz etmek için güçlü X-ışını difraksiyon metodu kullandılar ve 1950’lerde DNA’nın karakteristik bir X-ışını difraksiyon örneği oluşturduğunu buldular:
Bu örnekten DNA moleküllerinin uzun eksenleri boyunca biri 0,34 nm ikincisi 3,4 nm olan iki devirli heliks olduğu sonucuna varıldı. Örneğin aynı zamanda molekülün iki kol içerdiğini göstermesi yapıyı belirtmek için çok önemliydi.
1953’te James Watson ve Francis Crick, mevcut verilerin hepsini açıklayan üç boyutlu DNA yapısı modeli ileri sürdüler. Bu modele göre DNA, sağa dönen çift heliks (ikili sarmal) oluşturmak üzere aynı eksen etrafında iki helezon şeklinde DNA zincir kangalından (polinükleotid zinciri) oluşmuştur. Art arda gelen deoksiriboz ve negatif yüklü fosfat gruplarının oluşturduğu hidrofilik iskelet, ikili sarmalın çevre suyuna bakan dış tarafındadır. Her iki kolun pirimidin ve pürin bazları, hidrofobik ve neredeyse düzlemsel halka yapılarıyla heliksin uzun eksenine dik ve birbirine çok yakın olarak ikili sarmalın iç tarafında üst üste gelirler. Kollar arasındaki uzaysal ilişki, iki kol arasında büyük oluk ve küçük oluklar meydana getirir:
DNA ikili sarmalında bir koldaki her bir baz, diğer kolun bir bazına hidrojen bağlarıyla bağlanmak suretiyle aynı düzlemde baz çifti oluştururlar. Bazlar arasında hidrojen bağı oluşmasını sağlayan gruplar, amino ve karbonil gruplarıdır. James Watson ve Francis Crick, yapı içinde Chargaff kuralları için bir mantık sağlayan en uygun baz çiftlerinin A = T ve G º C baz çiftleri olduğunu buldular:


C º G T = A
Bu tür baz eşleşmesi, çift zincirli DNA ve RNA yapısında görülmektedir. Bazların bu şekilde spesifik eşlenmesi, bir zincirde bulunan genetik bilginin yeni sentez edilen nükleik asit zincirinde yer almasını sağlamaktadır.
DNA’nın farklı yapısal formları
DNA, belirgin olarak fleksibl bir moleküldür; şeker-fosfat iskeletindeki bağların bir bölümü etrafında hatırı sayılır rotasyon mümkündür ve termal dalgalanma, yapıda bükülme, gerilme ve çift oluşumunun bozulmasına neden olabilir.
B-form DNA olarak tanımlanan yapı (Watson-Crick tarafından tanımlanan yapı), fizyolojik şartlar altında DNA molekülü için en stabil yapıdır ve bu nedenle DNA’nın özelliklerinin herhangi birinin incelenmesi için standart referans noktasıdır. B-form DNA’dan başka A- ve Z-form DNA’lar da vardır:
A-form DNA, nispeten susuz birçok çözeltide saptanır; belli bir DNA molekülü için B-form DNA’dan daha kısa ve daha geniştir.
Z-form DNA, B-form DNA’dan daha farklıdır; en belirgin farklılık, sola dönen helezon şekli ve iskeletinin zikzak görünümüdür.
Bazı DNA’lar olağan dışı yapılar gösterirler. Olağan dışı bir DNA yapısı H-DNA olarak bilinir ki bunun alışılmamış özelliği, bir üçlü heliks oluşturmak için DNA’nın üç kolunun eşleşmesi ve birbirine dolaşmasıdır:
H-DNA üçlü heliksinin üç kolundan ikisi pirimidin içerir; üçüncüsü pürin içerir.
Nükleik asitlerde de proteinlerdeki gibi primer, sekonder ve tersiyer yapı tanımlanır. Nükleik asitlerin primer yapısı, kovalent yapı ve nükleotid dizisidir. Nükleotidler, 3I,5I-fosfodiester bağları (fosforil bağı) vasıtasıyla birbirine bağlanmışlardır. Molekülün bir ucu 5I, diğer ucu 3I dür.
Nükleik asitlerin sekonder yapısı, nükleik asitteki nükleotidlerin bazısı veya hepsi vasıtasıyla oluşan düzenli ve stabil ikili sarmal yapıdır. Sekonder yapıda, aynı veya farklı iki DNA zinciri arasında hidrojen bağları oluşmuştur; Chargaff kuralına uyacak biçimde, adenin (A) daima timin (T) ile, guanin (G) ise daima sitozin (C) ile eş oluşturmuştur. Adenin ile timin ve guanin ile sitozin, komplementer bazlar olarak adlandırılırlar. Sekonder yapıda dikkati çeken diğer bir özellik, A ile T arasında
2, G ile C arasında ise 3 adet hidrojen bağı olmasıdır. X ışınları difraksiyonu ile gösterilen bu özellik, bazların kimyasal yapılarında içerdikleri amino ve oksijen gruplarının gösterdikleri farklı elektronegatiflik güçlerine bağlıdır. Pentid (ribotid) zincirleri molekülün iki yanında yerleşmiştir; bazlar ise bu zincire dik olarak içe doğru uzanmışlardır. Pentid veya ribotid, pentoz ile fosforik asidin birbirine ester bağı ile bağlanması sonucu oluşan birimdir. Polinükleotid zincirlerinin yönü birbirine zıttır; birisi 3I®5I yönünde iken diğeri 5I®3I yönündedir. Watson Crick’e göre; her DNA molekülünün ribotidlerden oluşmuş birer bel kemiği vardır. Bu bel kemiğinden iç eksene yönelik bazlar hidrojen köprüleri oluşturmuştur. İkili sarmalda her kıvrım uzunluğu 3,4 nmdir (34 Ao) ve her kıvrımda 10 nükleotid yer alır; nükleotidler arası uzaklık 0,34 nmdir (3,4 Ao). İkili sarmalın dönüşlerinde 12 Ao genişliğinde büyük oluk ve 6 Ao genişliğinde küçük oluk oluşur ki bu olukların, DNA fonksiyonu için gerekli bazı protein faktörleri bağladığı gösterilmiştir; molekülün dışı, fosfat gruplarından dolayı negatif yüklüdür, bu nedenle katyonik proteinler ile sarılmıştır.
Nükleik asitlerin sekonder yapısı, bakteriyel nükleoid ve ökaryotik kromatinin kompleks katlanmalarla oluşturdukları büyük kromozomlar şeklindeki yapıdır.
Kromatin
Bölünme evresinde olmayan ökaryotik hücrelerde nükleustan izole edilen kromozomal materyal kromatin olarak tanımlanır. Kromatin, biçimlenmemiştir ve çekirdeğin her tarafına dağılmıştır. Hücre bölünmeye hazırlanırken kromatin yoğunlaşır ve kendiliğinden türe özel sayıda kromozomlar halinde belirir.
Kromatin, izole edilmiş ve analiz edilmiştir; yaklaşık olarak eşit miktarlarda protein ve DNA ile az miktarda RNA içeren liflerden oluşmuştur. Kromatindeki DNA, histon denen proteinlerle çok sıkı olarak ilişkilidir. Kromatin, nükleaz, DNA-polimeraz ve RNA-polimeraz gibi histon olmayan proteinler de içerir ki bu proteinlerin bazısı gen ifadesini yani DNA’dan özel RNA’lar ve sonra protein sentezini düzenlerler.
Histonlar, bütün ökaryotik hücrelerin kromatininde bulunurlar; 11000-21000 arasında molekül ağırlığına sahiptirler; arjinin ve lizin bazik amino asitlerinden zengindirler. Histonlar, molekül ağırlıkları ve amino asit kompozisyonu bakımından farklı beş büyük sınıfa ayrılırlar:
Histonlardaki bazı amino asit yan zincirleri, asetilasyon, metilasyon, fosforilasyon ve ADP-ribozilasyon vasıtasıyla enzimatik olarak modifiye edilebilmektedirler. Bu nedenle histonların her biri farklı formlarda bulunabilirler. Histon moleküllerindeki modifikasyonlar, molekülün net elektrik yükünü, şeklini ve başka özelliklerini değiştirir. Bu değişikliklerin fonksiyonel önemi iyi bilinmemektedir; kromatin yapı ve fonksiyonunda, replikasyon ve transkripsiyonda önemli olabilirler. İnaktif kromatin, heterokromatin olarak bilinir; aktif kromatin ise ökromatin olarak bilinir ki DNAz’a duyarlıdır.
Kromatindeki temel kurucu üniteler nükleozomlardır. Bir nükleozom, H2A, H2B, H3 ve H4’ün ikişer kopyası olan sekiz histon molekülünden oluşmuş bir histon göbek ve histon göbeğe sarılmış yaklaşık 146 baz çifti içeren DNA bölümünden yapılmıştır:
Nükleozomlar, DNA boyunca ipe dizilmiş boncuklar gibi görünürler; H1 histon, nükleozomlar arasındaki bağlayıcı DNA bölümüne bağlanır:
Kromozomlar ve genler
Bir çok hücreli organizmanın her hücresi genellikle aynı genetik materyal içerir. Hücresel genleri içeren DNA molekülleri, hücrelerdeki en büyük makromoleküllerdir ki bunlar, hücrenin bölünme evresinde, kompleks katlanmalarla kromozom denen yapılar haline gelirler:
Çoğu bakteri ve virüsler bir tek kromozoma sahiptirler. Ökaryotlar genellikle birçok kromozoma sahiptirler ki insan somatik hücrelerinde 46, tavukta 78, tavşanda 44, sıçanda 42, farede 40, kedide 38 kromozom bulunur.
Bir kromozom, özel genlerin binlercesini içerir ve genlere ek olarak hücre bölünmesinde kromozomların kız hücrelere ayrılması ve paketlenmesine yardım eden özel fonksiyonlu diziler içerir. 1950’lerde gerçekleştirilen ölçümler, en büyük DNA’ların yaklaşık 15000 baz çiftine eşdeğer 106 veya daha az molekül ağırlığına sahip olduğunu gösterdi. Daha sonra doğal DNA’ların izolasyonu için gelişmiş metotlarla DNA’nın molekül ağırlığının çok daha yüksek olduğu bulundu.
Bir hücrenin bütün farklı kromozomları üzerindeki bütün genlerin ve genler arası DNA bölümlerinin toplamı, sellüler genom olarak tanımlanır. İnsanlarda 23 çift kromozomda 7x109 baz çifti, 3 milyon gen çifti olduğu hesaplanmaktadır. Genomda bulunan DNA zincirleri, üç gruba ayrılabilirler:
Genler, kromozomların, örneğin göz rengi gibi tek bir karakter veya fenotipi (görünen özellik) belirleyen veya etkileyen bölümleri olarak tanımlanırlar. Genin bu tanımından başka, ilk kez 1940’da George Beadle ve Edward Tatum tarafından önerilen bir moleküler tanımlaması da vardır. Moleküler tanımlamaya göre bir gen, bir enzimi belirleyen veya şifreleyen bir genetik materyal segmentidir. Bir gen-bir enzim hipotezi olarak bilinen bu kavram daha sonraları bir gen-bir protein şeklinde genişletildi. Bir genin bugünkü biyokimyasal tanımlaması biraz daha doğrudur; birçok protein birçok polipeptit zincire sahip ve farklı polipeptit zincirleri farklı genler tarafından şifrelendiğinden gen-protein ilişkisi bir gen-bir polipeptit şeklinde tanımlanır. Bir protein molekülüne ait alt ünitenin yapısını şifreleyen genetik ifadenin en küçük ünitesi olarak davranan genetik birim, sistron olarak tanımlanmaktadır. Bazı genler tRNA ve rRNA gibi farklı RNA türlerini şifrelerler. Enzim olmayan polipeptidleri veya RNA’ları şifreleyen genler, yapısal genler olarak bilinir. DNA, aynı zamanda düzenleyici fonksiyona sahip segment veya diziler de içerir ki bu düzenleyici diziler, yapısal genlerin başlangıcını veya sonunu gösterebilirler; yapısal genlerin transkripsiyonunu açma veya kapamaya katılabilirler; replikasyon veya rekombinasyonun başlama noktası olarak fonksiyon görebilirler.
Transkripsiyon, bir DNA kalıbından bir mRNA molekülünün sentezlenmesi ve böylece protein sentezi için DNA’da saklanmış olan genetik bilginin mRNA’ya kopyalanması olayıdır. Replikasyon, bir DNA molekülünün doğru kopyasının yapılması olayıdır. Rekombinasyon, bir DNA molekülündeki nükleotid dizisinin bir bölümünün bir başka DNA molekülüne aktarılması olayıdır.
İnsanlarda 23 çift kromozomda 7x109 baz çifti, 3 milyon gen çiftine karşılık 30.000-100.000 protein olduğu hesaplanmaktadır. O halde birçok ökaryotik hücre geninin nükleotid dizisi, polipeptit ürünün amino asit dizisi için kodlayıcı olmayan bir veya daha fazla sayıda DNA segmenti içerir. DNA’da kodlayıcı segmentler ekson olarak adlandırılırlar, kodlayıcı olmayan segmentler ise intron olarak adlandırılırlar:
Ekstrakromozomal DNA’lar
Viral DNA molekülleri küçüktürler ve bazı vürüslerde bulunan DNA tek kolludur.
Bakteriler, kromozom ve ekstrakromozomal DNA içerirler. Bakterilerin birçok türünde ekstrakromozomal DNA, sitozolde serbest olarak bulunan bir veya daha fazla sayıda, küçük, sirküler DNA molekülüdür; bu ekstrakromozomal element, plazmid olarak adlandırılır.
Ökaryotik hücreler, prokaryotlardan daha fazla DNA içerirler; en basit ökaryotlardan biri olan özel bir maya hücresi, bir E.coli hücresinden dört misli daha fazla DNA içerir; bir insan hücresindeki bütün DNA’ların toplam uzunluğu yaklaşık 2 metredir. Ökaryotik hücrelerin nükleuslarındaki DNA’ya ek olarak, baz dizisi nükleer DNA’dan farklı, çok küçük miktarlarda DNA mitokondriler içinde bulunur. Mitokondriyal DNA, nükleer kromozomlara göre çok küçük bir moleküldür; mitokonrial tRNA’lar ve rRNA’lar ile birkaç mitokondriyal proteini kodlar.
Fotosentetik hücrelerin kloroplastları da DNA içerir.
DNA’nın kimyasal özellikleri
1) Çift heliks yapılı DNA, denatüre edilebilir ve denatüre olan DNA renatüre olabilir.
İzole edilmiş doğal DNA çözeltileri, pH=7 ve oda sıcaklığında yüksek derecede visközdürler. Böyle bir çözelti ekstrem pH değerine veya 80-90oC üzerinde sıcaklığa getirildiğinde viskozitesi azalır; ekstrem pH ve yüksek sıcaklık, globuler proteinlerin denatürasyonuna neden olurken çift heliksli DNA’nın denatürasyon ile erimesine neden olur.
DNA’nın denatürasyon ile erimesi, eşleşmiş bazlar arasındaki hidrojen bağlarının ve istiflenmiş bazlar arasındaki hidrofobik etkileşimlerin bozulmasının sonucudur. DNA’nın denatürasyonu sırasında kovalent olmayan bağlar yıkılır; sonuçta çift heliks, iki kol oluşturmak üzere açılır ve bu iki kol, molekülün tam uzunluğu veya uzunluğun bir kısmı boyunca tamamen birbirinden ayrılır. Renatürasyon sırasında ise denatürasyondaki olaylar zıt yönde yürür:
2) Farklı türlere ait DNA’lar hibridler (melezler) oluşturabilirler.
İnsan hücrelerinden izole edilen çift heliksli DNA’lar ile fare hücrelerinden izole edilen çift heliksli DNA’lar ısıtma suretiyle tam olarak denatüre edildikten sonra karıştırılır ve 65oC’de uzun süre tutulursa DNA’nın çoğu renatüre olur. Karışımdaki DNA’ların renatürasyonu sırasında, fare DNA kollarının çoğu fare çift heliks DNA’sı oluşturmak üzere tamamlayıcı fare DNA kolları ile birleşir; insan DNA kollarının çoğu insan çift heliks DNA’sı oluşturmak üzere tamamlayıcı insan DNA kolları ile birleşir. Ancak bazı fare DNA kolları, hibrid çift heliksler vermek üzere insan DNA kolları ile birleşebilirler:
3) DNA, nonenzimatik transformasyona uğrayabilir.
Nükleik asitleri oluşturan nükleotidlerdeki pirimidinlerin ve pürinlerin bir kısmı, kovalent yapılarını değiştiren reaksiyonlara maruz kalırlar. Bu reaksiyonlar, genellikle çok yavaş fakat fizyolojik olarak önemlidirler; çünkü hücreler, genetik bilgideki değişikliklere çok az tolerans gösterirler.
DNA’nın yapısında genetik bilginin kodlandığı yerde meydana gelen kalıcı değişiklikler, mutasyonlar olarak tanımlanırlar ki bir çok kanıt, yaşlanma ve kanser oluşumu ile mutasyonların birikimi arasında özel bir bağ olduğunu düşündürür.
Mutasyonlar, bazı bazların spontan deaminasyonu, baz ve pentoz arasındaki glikozil bağlarının hidrolizi, belli radyasyon tipleri vasıtasıyla gerçekleşen başka reaksiyonlar, endüstriyel artıklar olarak çevreyi kirleten kimyasal maddelerin etkisi ile meydana gelirler. Yiyeceklerde, suda veya havada bulunan birçok karsinojenik bileşik, kanser yapıcı etkilerini, DNA’daki bazları modifiye etmek suretiyle gösterirler.
Birkaç baz, deaminasyon ile spontan olarak halka dışındaki amino gruplarını kaybedebilir ve başka baza değişebilirler:
DNA’lardaki bir başka önemli reaksiyon, baz ve pentoz arasındaki glikozil bağlarının hidrolizidir ki bu, pürinlerde pirimidinlerdekinden çok daha hızlı meydana gelir. DNA’nın pH’ı 3 olan bir ortamda inkübasyonu, pürin bazlarının selektif çıkarılmasına (depürinasyon) ve apürinik asit denen bir türevin oluşmasına neden olur:
200-400 nm dalga boyuna sahip UV ışınları, bakteri ve insan deri hücrelerinin DNA’sında pirimidin dimerlerinin oluşumuna ve başka kimyasal değişikliklere neden olabilir; X-ışınları ve g-ışınları gibi iyonize edici ışınlar, nükleik asitlerin kovalent iskeletinde kıvrılmalar, bazların halka açılması ve parçalanmasına neden olabilir:
Endüstriyel aktivite ürünleri olarak çevreye katılan reaktif kimyasal maddeler DNA hasarı oluşturabilir. DNA hasarı oluşturan reaktif kimyasal maddelerin deamine edici ajanlar, alkilleyici ajanlar ve DNA’daki normal bazları taklit edebilen bileşikler olmak üzere üç büyük sınıfı vardır:


Deamine edici ajanlar


Alkilleyici ajanlar
Baz analogları
DNA hasarı oluşturan reaktif kimyasal maddeler kendiliğinden hasar oluşturmayabilir, fakat hücreler tarafından zararlı formlara metabolize edilebilirler. Örneğin sodyum nitrit, sodyum nitrat ve nitrozaminler, deamine edici nitröz asit (HNO2) prekürsörleridirler. Nitröz asit de sitozini urasile ve adenini hipoksantine değiştirir.
DNA’da mutajenik yani mutasyon oluşturan değişikliklerin en önemli kaynağı, oksidatif hasardır. Hidrojen peroksit, hidroksil radikalleri, süperoksit radikalleri gibi uyarılmış oksijen türleri, radyasyona maruz kalındığında veya bir aerobik metabolizma yan ürünü olarak artarlar. Hücreler, bu reaktif türleri yıkmak için katalaz, ve süperoksit dismutaz gibi enzimleri kapsayan bir savunma sistemine sahiptirler. Bu oksidanların bir bölümü sellüler savunma sistemini geçerler ve DNA’yı hasarlayan bir grup kompleks reaksiyona katılırlar.
4) DNA moleküllerindeki belli nükleotid bazları, sıklıkla enzimatik olarak metillenirler.
Adenin ve sitozin, guanin ve timinden sıklıkla daha fazla metillenir. Bu bazların metilasyonu rastgele değildir; bir DNA molekülünün bazı bölgelerinde sınırlı olur. Metilasyonun fonksiyonu bazı durumlar için anlaşılmıştır bazı durumlar için ise halen bilinmemektedir.
DNA nükleotid dizisinin tayini
Bir DNA molekülünün nükleotid dizisi, bilgi hazinesi olarak kabiliyetini belirler. 1970’lerin sonlarına kadar 5-10 nükleotid içeren bir nükleik asit dizisinin elde edilmesi bile zor ve çok zahmetli idi. 1977’de biri Alan Maxam ve Walter Gilbert tarafından diğeri Frederick Sanger tarafından iki yeni tekniğin geliştirilmesi daha uzun DNA moleküllerinin dizisini saptamayı mümkün kıldı.
Hem Sanger hem Maxam-Gilbert tekniğinde genel prensip, DNA’yı işaretlenmiş dört fragman grubuna ayırmaktır. Her grubu oluşturan reaksiyon baza özeldir; belli bir bazın DNA dizisinde bulunduğu pozisyona uygun uzunlukta fragman oluşturur. Örneğin 5I-pAATCGACT-3I biçiminde bir oligonükleotid için sadece C ile sonlanan fragmanlar oluşturan bir reaksiyon, dört ve yedi nükleotid uzunluğunda fragmanlar (pAATC ve pAATCGAC) meydana getirir. Aynı oligonükleotid için G ile sonlanan fragmanlar oluşturan bir reaksiyon ise yalnızca beş nükleotidli bir fragman (pAATCG) meydana getirir.
Nükleik asitleri parçalayan enzimler, fosfodiester bağını hidrolitik olarak parçalarlar; çeşitli sınıflara ayrılırlar: 1) Ekzonükleazlar: Nükleotidleri, zincirin ucundan başlayarak ayırırlar. 2) Endonükleazlar: Tek veya çift sarmala etkili türleri vardır; tek zincire veya oluk bölgesine elektrostatik güçlerle bağlanır. 3) EndoRNAz: DNA-RNA kompleksini parçalayan, 5I fosfomonoester oluşturan, 3I monoester ve oligonükleotid oluşturan türleri vardır. 4) Restriksiyon enzimleri (kısıtlayıcı enzimler): DNA zincirlerini spesifik konumlarda kesen nükleazlardır; pekçok çeşidi vardır:
Restriksiyon enzimleri, bakteriyel enzimlerdir; izole edildikleri bakteriye göre isimlendirilirler; belirli bir bakteride varlıkları, bakteriyofajlar denen bazı bakteriyel virüslerin büyümesini kısıtlar. Her enzim, 4-7 baz çifti uzunluğunda olan, palindrom diziler diye adlandırılan spesifik bir çift kollu DNA dizisini tanır ve ayrıştırır. Bu DNA ayrışmaları, enzim tarafından uygulanan mekanizmaya bağlı olarak ya yapışkan veya zikzaklı uçlar ya da künt uçlar ile sonuçlanır:
DNA’da bulunan dört baza (A, G, C, T) uyan işaretlenmiş fragman grupları elektroforetik olarak yan yana ayrıldıklarında dizinin doğrudan okunabildiği bir bandlar merdiveni elde edilir ve böylece nükleotid dizisi tayin edilmiş olur:
Sanger yöntemi teknik olarak daha kolay olduğundan yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu yöntemde DNA polimeraz vasıtasıyla DNA sentezi mekanizmasından yararlanılır ve DNA sentezini durdurmak için dideoksinükleozid trifosfat (ddNTP) analogları kullanılır:
Sanger yöntemi ile elde edilen nükleotid dizisinin analiz edilen nükleotid dizisi için tamamlayıcı olduğuna dikkat edilmelidir.
DNA dizisinin tayini için, Sanger yönteminin bir varyasyonunu kullanan otomatize metotlar da geliştirilmiştir:
kaynak:
http://www.myotherdrive.com/dyn/dl/734.405807.07102009.46724.6a64fi/847n