Mikrodizi (Microarray) Nedir
Bu kavramı birçok yerde "mikrodizin" olarak da görmüşsünüzdür, o ayrı bir yazı konusu. Bu yazıda, daha önce detaylı bir şekilde bahsedeceğimi söylediğim mikrodizi teknolojisine giriş yapacağım. Mikrodizi veri analizi yerine, bu teknolojinin nasıl bir şeye benzediğinden bahsedeceğim.
Bu teknoloji fazlasıyla popüler ülkemizde (dünyada artık Yeni Nesil Sekanslama konuşuluyor), bir süre daha devam edeceğe de benziyor. Temel birkaç sebepten birisi bu teknolojiyi uygulamayı bilen insan sayısı göreceli olarak hayli fazla, her yerde (evet, neredeyse her yerde) mikrodizi cihazı var, ve bu teknolojiyi kullanarak yayın çıkarmak göreceli olarak kolay. Bu durum da beraberinde gereğinden yüksek beklentileri ve uygunsuz teknoloji kullanımlarını getiriyor.
Önce neden böyle bir teknolojiye ihtiyaç duyulduğundan başlayalım.
Klasik bilimsel yaklaşım belirli bir vakit diliminde belirli bir faktörü incelemek üzerine kurulu. Bu nedenle p53 üzerine binlerce yayın var; ancak p53'ün tam olarak nasıl çalıştığına ilişkin elimizde tam bir bilgi yok, çünkü etkileşim mekanizmasını tam olarak anlayabilmiş değiliz. Buradaki anahtar kelime, "etkileşim" [interaction]. Yani klasik yaklaşımla, direksiyonun bir otomobil için çok önemli olduğunu anlayabiliyoruz. Hatta direksiyonun türler arasında (kamyon, otobüs, vapur, uçak vb.) korunduğunu ve bazen farklı şekillere büründüğünü ve buna rağmen aynı etkiyi yaptığını da kavrayabiliyoruz. Ama direksiyonun tam olarak nasıl çalıştığını klasik yaklaşımla anlayamıyoruz; çünkü bir başka deneyde direksiyonu sabit tutup gaza basıyoruz, bir başkasında otomobilin krank milini çıkarıp etkisine bakıyoruz, ve benzeri şeyler. Bu sıkıntı bilimin birçok dalında kendini gösteriyor, fakat özellikle de birden fazla faktörün işin içine girdiği alanlarda içinden çıkılmaz bir hal alıyor bu durum.
Psikoloji bilimsel olarak geç kabul gören fakat hızlı ilerleyen bir dal. Klasik bilimsel yaklaşımla çözülemeyen bazı problemleri çözmek adına farklı bir yaklaşım ortaya çıkıyor. Gestalt psikolojisi denilen bu yaklaşım diyor ki:
"Bütün, onu oluşturan parçaların toplamı değil, daha fazlasıdır."
Yani deniyor ki, bir ormanı anlamak istiyorsanız teker teker her bir ağacı araştırmanız yetersizdir. Ormanı oluşturan şey, ağaçlar ve onların birbiriyle etkileşimidir. Yani p53'ün ne işe yaradığı çoğu zaman anlamsızdır; önemli olan, p53'ün diğer moleküllerle etkileşimini ortaya koymaktır. Yani direksiyonu çevirdiğimizde tekerlerin nasıl hareket ettiğini keşfetmek, belirli hızlarla giderken her bir derecelik direksiyon açısındaki değişmenin kaç metrelik sapmalara denk geldiğini görmek, her bir lastiğin aşınmışlığının bu sapmaları nasıl etkilediğini keşfetmek, direksiyon boşluğu denen şeyin aracın yönünü ayarlamayı nasıl etkilediğini bulmak tüm resmi görmektir. Elbette direksiyonun şekli, yapıldığı materyal vb. şeyler kıymetlidir ama, bütün resmin sadece ufak bir parçasıdır. Gestalt psikolojisini detaylı bir şekilde araştırmanızı öneririm; sistem biyolojisini anlamak için çok güzel bir başlangıç noktası bence.
1977 yılında Northern Blot adı verilen bir yöntem geliştirildi. Amaç, gen ifade miktarını hedef bir gen/transkript için belirleyebilmekti. Örneğin, p53 gen ifade miktarını bu yöntemle tayin edebiliyordunuz ve sadece bir veya birkaç gen ifade miktarını kendi aralarında farklı durumlar (hastalıklı - sağlıklı vb.) için kıyaslayabiliyordunuz. Burada önemli bir detay var; ilgilendiğiniz gen veya transkriptin DNA dizilimini, en azından bir kısmını bilmeniz gerekiyor ki ona göre probu tasarlayabilesiniz. Aslında bu durum aynı zamanda çok büyük bir kısıtlayıcı etkiye sahip; henüz keşfedilmemiş genler için bu yöntemi kullanabilmek mümkün değil.
Hücredeki süreçleri daha iyi anlayabilmek için mümkünse hücredeki her detaya ilişkin veriye ihtiyacımız var. Genetik alanındaki araştırmalar ilerledikçe ve moleküller arası etkileşimin önemi farkedildikçe aynı anda onlarca gene ait özelliklere bakabilmenin daha faydalı olabileceği düşüncesi yaygınlaşmaya başladı; gestalt yaklaşımının biyoloji versiyonu gibi düşünebilirsiniz bu gelişme sürecini. Yeni bir teknolojinin geliştirilmesi biraz uzun sürdü; SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) yöntemi bu arayışlar doğrultusunda ortaya çıktı, sene 1995. Henüz İnsan Genom Projesinin çıktıları bilinmiyordu ve araştırmacılar mümkün olduğu kadar çok gen ifade değişimini aynı anda gözlemleyebilmek istiyordu. Böylece, bir hastalık durumunda gen ifade miktarlarının sağlıklı bireylerin gen ifade miktarlarına göre nasıl değiştiği ve böylelikle hastalığa neyin neden olduğu, veya hastalığın neleri etkilediği/değiştirdiği anlaşılabilecekti. Yandaki şekil SAGE metodunu kısaca özetliyor. SAGE yönteminin bir diğer avantajı ise, hücredeki transkriptlerin ne olduğunu önceden bilmenizi gerektirmeyen ve yeni genlerin keşfine olanak sağlayan bir yaklaşıma sahip olması. Daha doğrusu, yeni bir genin ufak bir dizisini keşfetmekten bahsediyoruz, yine de bu o zamanlar için büyük bir keşif olarak düşünülebilir (Bir yazımda EST'lerden kısaca bahsetmiştim).
SAGE metodu DNA dizilimlemeye dayanır ve o dönemde elimizdeki en iyi yöntem Sanger yöntemiydi. Eğer dizilimlemek istediğiniz DNA bölgesi fazlasıyla uzunsa bu hem uzun süreler, hem de yüksek maliyetler anlamına geliyor. Bu nedenle, yine aynı dönemde geliştirilen mikrodizi teknolojisi düşük maliyetler vadettiği için bir anda popüler hale geldi ve SAGE metodunun pabucunu dama attı. Oysa iki metodun karşılaştırmalarına baktığımızda, SAGE yöntemi mikrodizi teknolojisine göre çok daha kesin ve nicel sonuçlar verebiliyor. Maliyet avantajı fazlasıyla baskın gelmiş anlaşılan.
Peki mikrodizi teknolojisi ne getirdi, temel farkı neydi? Bu yeni teknolojiyi, aynı anda gerçekleştirilen Northern Blot'lar gibi düşünebiliriz; binlerce ve bazen on binlerce Northern Blot, tek seferde, çok daha az sarf maliyetiyle. Yaklaşım aynı; önceden tasarlanmış ve bir transkripti tanımlayabilecek en az bir prob tasarlayın. Prob lafı biraz korkutucu geliyor başta ve bir kavram kargaşasına da yol açabiliyor. Kastettiğimiz şey, 20 ila 500 baz arasında uzunluğu olan tek zincirli bir DNA molekülü (ülkemizde yaygın olarak kullanılan Affymetrix teknolojisinde DNA molekülünün uzunluğu 25 baz olarak belirlenmiş). Olay tamamen hibridizasyon temelli ve bu nedenle tek zincirli DNA parçaları, eşlenecekleri diğer molekülleri bekliyorlar; onlar da hedef transkriptler.
Bir video yüzlerce kelimeye bedel, buradan teknolojinin nasıl işlediğini izleyebilirsiniz. Birçok farklı mikrodizi teknolojisi ve yine birçok uygulaması var; yani aslında mikrodizi teknolojisi dediğimizde ortada yine ufak bir kavram kargaşası var ancak sistemin çalışması yukarıda bahsettiğimiz gibi. Peki sonra ne oluyor?
Problara bağlanması için hücrelerden elde ettiğimiz DNA veya mRNA parçaları floresan moleküllerle işaretleniyor (kafamda, her bir nükleik asit molekülünün ucunda birer LED veya ampül varmış gibi hayal ediyorum). Problar sabit olduğu ve her bir pozisyonda hangi transkripti hedeflediği bilindiği için, o bölgelerdeki floresan ışımaya bakılıyor ve bu ışıma miktarının hücredeki gen ifadesi miktarıyla paralel olduğu varsayılıyor. Buradaki paralel olma ifadesi şu demek; elimizde sayısal veriler var ancak bunlar mutlak rakamlar değil. Çok ışıma varsa hücrede bu gen çok miktarda ifade ediliyor diye düşünüyoruz, az ışıma varsa az gen ifadesi var diye düşünüyoruz. Bu az veya çok olma durumu hücrede gerçekte kaç kopya transkript olduğu bilgisini vermiyor. Bu nedenle mutlaka bir referansa veya bir referans grubuna ihtiyacımız var.
Mikrodizi ne değildir, tam da bu noktada başlıyor. Tek bir mikrodizi deneyiyle bir gene ait ifade değerini mutlak olarak söyleyemezsiniz, herhangi bir tespit yapamazsınız. Aynı değer grubuna ait örneklerle yapacağınız mikrodizi deneyleriyle de bunu yapamazsınız. Yani, 10 tane hasta bulup bunlardan alacağınız örneklerle yaptığınız mikrodizi deneyi, pratikte neredeyse hiç bir işe yaramaz, çünkü bu teknoloji böyle kullanılmaya uygun değil; mutlaka birden fazla referans çalışmaya ihtiyacınız var. Böylece elde ettiğiniz hasta örneklerine ait verilerin "çok" veya "az" olduğunu söyleyebileceğiniz bir referans noktası elde edebilirsiniz.
Model organizma çalışırken referans veya kontrol grubu bulmak çok daha kolay ancak konu insan olduğunda sağlıklı bireylerden kontrol örneklerini nasıl bulabilirsiniz? Örneğin, sağlıklı bir bireye karaciğer biyopsisi yapmanın veya o bireyin beyninden parça almanın hem etik hem de yasal bir çok problemi var. O zaman bu dokulardan elde edilen örneklerle mikrodizi deneyleri yapılmayacak mı? Referansınız yoksa, evet, çalışmanın bir anlamı yok. Yeterince örnek toplayamıyorsanız, yine burada bir problem var. Elinizdeki değerler mutlak değerler değil ve bu değerlerin kendi içlerinde de sapmalar var, bu nedenle birçok örneğe ihtiyacınız var. Bütçeniz kısıtlıysa ve her bir deney grubu için sadece bir örnek çalışabilecekseniz, mikrodizi teknolojisine başvurmanın yine neredeyse hiç bir anlamı yok. Veya referans olarak kullanacağınız kontrol örnekleri gerçekten de kontrol değilse (deney grubu örnekleriyle aynı dokudan ve aynı şartlarda alınmadıysa vb.), o zaman yine yapacağınız çalışma tehlikeye giriyor.
Yukarıda saydığım nedenlerden ötürü bir mikrodizi deneyi tasarlamadan önce bir biyoinformatik uzmanına veya bir biyoistatistikçiye danışmakta çok büyük faydalar var; bu sayede birçok hatanın ve verimsizliğin önüne geçilebilir. Her bir farklı üreticinin geliştirdiği mikrodizi teknolojileri de birbirinden farklı, bu nedenle bu konuda da bilgi sahibi olmak gerekiyor. Gözünüz korkmasın, Wikipedia'da ufak bir gezinti farklı mikrodizi teknolojileri hakkında fikir sahibi olmanız için yeterli.