1- Önemli biyolojik maddelerin tanınması
Bir hücrenin kimyasal yapısı başlıca iki şekilde incelenebilir. Birinci yol hücrenin bulunduğu doku iyice öğütülür veya suyu çıkarılır ve kimyasal olarak analiz edilir. İkinci yol ise dokudan kesitler alınır ve kesitler belli maddeleri ortaya çıkaran ayıraçlarla boyanır. Bu metodun diğerine göre üstün yönü hücrelerin parçalanmadın incelenmesi imkanının olmasıdır. Böylece aranan maddenin hücre içinde bulunduğu yeri ve dağılımı detaylı şekilde incelenmiş olur.
Mikroskop,
10 tane deney tüpü,
Tüp sehpası,
Lam ve lamel,
Bunzen beki veya ispirto lambası,
Havan,
Jilet,
Saat camı,
Spatula,
Güvenlik gözlüğü,
Lugol çözeltisi,
Benedict ayıracı,
Schultz çözeltisi,
Floroglusinol,
Konsantre hidroklorik asit,
Seyreltik hidroklorik asit,
Sodyum hidrojenkarbonat,
Sudan III,
Milluon ayıracı,
Seyreltik potasyum hidroksit,
Bakır(II) sulfat çözeltisi (%1’’lik),
Etil alkol (mutlak ve %70’lik),
Litmus kağıdı,
Nişasta süspansiyonu,
Patates yumrusu,
Glukoz veya dekstroz,
Sukroz, elma, pamuk,
Odunsu bir gövde parçası,
Kibrit çöpleri,
Zeytin yağı,
Hint yağı tohumu,
Sıvı yumurta akı,
Islatılmış bezelye,
Çeşitli bitki dokuları, organları ve yiyecekler.
Benedict ayıracının hazırlanışı: 173 g sulu sodyum sitrat ve 100 g sulu sodyum karbonat yaklaşık 800 ml ılık damıtık suda çözülür. Süzülür ve süzüntü 850 ml’ye tamamlanır. Buna A çözeltisi adı verilir. 17.3 g sulu bakır sulfat yaklaşık 100 ml soğuk damıtık suda çözünür buna da B çözeltisi adı verilir. Mümkün olduğu kadar karıştırılmak suretiyle B çözeltisi A çözeltisine katılır ve karışım damıtık suyla 1 litreye tamlanır.
Floroglusinol (Benzen-1,2,3-triol)’in hazırlanışı: 2-5 g floroglusin 100 ml %95’lik etil alkolde çözünür. (çözelti kullanılmadan önce konsantre HCL ile asitlendirilmelidir).
Schultz çözeltisinin hazırlanışı Uygulama 2.1.’de verilmiştir.
1. Bir deney tüpünün dörtte birine kadar doldurulmuş nişasta süspansiyonu üzerine iki damla Lugol çözeltisi damlatılır. Çözeltinin mavi-siyah bir renk aldığı görülür. Bu renk nişastanın varlığını gösterir.
2. Patates yumrusu içinden ince kesitler alınır ve Lugol çözeltisi içerisinde preparat yapılır. Hücre içindeki nişasta tanelerine Lugol çözeltisi ulaştıkça bunların mavi renge dönüşleri izlenir.
Bütün monosakkaritler ve bazı disakkaritler ısıtıldıklarında bakır (II) sülfatı indirger ve bakır (I) oksit şeklinde çöktürürler. Böyle şekerlere indirgeyici şekerler adı verilir. İndirgeyici şekerleri belirlemek için en uygun ayıraç içerisinde iki değerli bakır sülfat bulunan Benedict ayıracıdır.
1. Bir deney tüpüne yaklaşık 4 ml glukoz ve eşit miktarda Benedict ayıracı konulur. Çalkalanır ve bir sıcak su banyosunda kaynama derecesine kadar ısıtılır. Tüpün dibinde oluşan çökelti şekerin varlığını gösterir.
Çökeltinin rengi ve yoğunluğu ortamda bulunan şekerin miktarı hakkında kabaca bir fikir verebilir. Çökelti yeşil renkte ise ortamda nispeten az şeker vardır. Kahverengi veya kırmızı renkte bir çökelti ise ortamda oldukça fazla miktarda şeker olduğunu gösterir.
3. Elmadan kenar uzunluğu 1 cm olan bir küp kesilir. Çok az suyla havanda öğütülür ve öğütülen materyal deney tüpüne alınır. Üzerine tüpün dörtte birini dolduracak şekilde su eklenir. Eşit hacımda Benedict ayıracı konularak su banyosunda kaynama derecesine gelinceye kadar ısıtılır. Sonuçlar kaydedilir ve tartışılır.
4. Elma dokusunda bulunan başlıca indirgeyici şeker fruktozdur. Fruktozun doku içinde dağılımını araştırmak için elmadan jiletle ince bir kesit alınır ve birkaç damla Benetict ayıracı ile birlikte preparat yapılır. Hücreler mikroskopta yüksek büyütme ile incelenir. Preparat bunzen alevinde veya ispirto ocağında doku kahverengi oluncaya kadar hafifçe ısıtılır. Kuruma varsa su ilave edilir. Preparat soğutulur ve tekrar incelenir. Hücrelerde meydana gelen değişiklikler izlenir. Şekerin bulunduğu hücreler belirlenir.
5. Sukroz bir disakkarit olup bakır sülfatı indirgemez. Ancak sukroz önce hidrolize edilerek monomerlerine ayrılır daha sonra Benedict ayıracı ile incelenirse varlığı belirlenebilir. Bunun için önce bir miktar sukroz çözeltisi seyreltik hidroklorik asitle kaynatılır ve sodyum hidrojenkarbonat ile nötralize edilir daha sonra da Benedict ayıracı ile test edilir.
1. Schultz çözeltisi ile selüloz eflatun renkte boyanır. Küçük bir parça didiklenmiş pamuk üzerine bir damla Schultz çözeltisi damlatılır ve sonuç izlenir.
2. Bir bitki dokusundan alınan kesitten Schultz çözeltisi içerisinde preparat yapılır. Mikroskopta hücre çeperlerinin renk reaksiyonu gözlenir.
1. Lignin asitlendirilmiş floroglusinol ile kırmızı renkte boyanır. Bir saat camına bir miktar floroglusinol konulur üzerine birkaç damla konsantre hidroklorik asit damlatılır. Bu karışıma bir kibrit çöpü daldırılır ve oluşan renk reaksiyonu gözlenir.
2. Odunsu bir gövdeden jiletle enine ve boyuna ince kesitler alınır. Kesitler saat camı içindeki floroglusinol ile birkaç dakika boyunca boyanır. Daha sonra bu kesitlerden su ile preparat yapılır. Daha uzun süre incelenmek isteniyorsa su yerine seyreltik gliserin kullanılmalıdır. Kesitler mikroskopta düşük büyütme ile incelenir ve ligninin hücrelerdeki dağılımı belirlenir.
Lipitler Sudan III ile kırmızı renkte boyanırlar. Deney tüpüne biraz zeytinyağı alınır. Üzerine biraz su ve birkaç damla Sudan III damlatılır ve iyice çalkalanır. Tüp dinlenmeye bırakıldığında yağ sudan ayrılır ve boya ile kırmızı renk aldığı görülür.
2. Tüpte bulunan zeytin yağı 5 ml mutlak (absolü) etil alkolle bir dakika boyunca çalkalanır. Üzerine eşit hacımda su ilave edilir. Tüpün dibinde görülen beyaz çökelti lipitlerin varlığını gösterir. Çökeltinin beyazlığı test edilen maddenin içindeki lipit miktarı ile doğru orantılıdır.
3. Bir dokuda bulunan lipitlerin belirlenmesi için doku havanda öğütülür. İçerisinde su bulunan bir tüpe alınır ve kaynatılır. Dokuda lipit varsa damlacıklar halinde dokudan ayrılacak ve su yüzeyine çıkacaktır. Ortama Sudan III katılır ve çalkalanır. Yağın dinlenmesi beklenir önce olduğu gibi kırmızı renkte boyandığı görülür. Deney keten tohumu veya hintyağı tohumu gibi yağ ihtiva eden bir tohumla tekrarlanır.
4. Yağların dokuda dağılımını araştırmak için doku Sudan III ile boyanır ve daha sonra suyla veya % 70’lik etil alkolle birkaç defa yıkanır. Dokuda yağ varsa yıkanma sonucu renk kaybolmaz ve doku kırmızı kalır. Hintyağı tohumundan boyuna kesitler alınır. SudanIII’le boyandıktan sonra kesitler su veya etil alkolle yıkanıp preparat yapılarak mikroskopta incelenir.
1. Yaklaşık 2 ml protein çözeltisi veya süspansiyonuna 6 damla kadar Million ayıracı damlatılır ve kaynatılır. Yüzeyde oluşan briket kırmızısı renk proteinin varlığını gösterir. Bu deney sıvı yumurta akı ile yapılabilir. Yumurta akı kaynatıldığında pıhtılaşma olacaktır.
2. Islatılmış bezelyenin ortasından ikiye ayrılır ve ince kesitler halinde dilimlenir. Dilimler lam üzerindeki Million ayıracı içerisine yerleştirilir ve kaynama derecesine kadar hafifçe ısıtılır. Kuruma görüldüğünde su ilave edilir. Preparat soğutulur ve mikroskop altında incelenerek proteinlerin dağılımı gözlenir. Million ayıracı tehlikeli bir madde olduğundan uzun süre kaynatılmamalı, buharları solunmamalı ve deri ile teması önlenmelidir. Kaynatma sırasında koruyucu gözlük takılması gerekir.
3. Million deneyinden daha güvenli ve çözünür proteinler için daha uygun olan diğer bir deney biüret testidir. Bunun için protein çözeltisine çözelti açık renk oluncaya kadar potasyum hidroksit dökülür. Deney tüpünün iç kenarına bir damla bakır sülfat damlatılır. Isıtılmaz. Çözeltinin yüzeyinde oluşan mavi bir halka proteinin varlığını gösterir. Tüp çalkalandığında mavi halka kaybolur ve çözelti eflatun renk alır.
Çeşitli bitki dokuları, elma, portakal, üzüm, havuç, turp gibi bitki organları, bu organların farklı yapıları indirgeyici şekerler, diğer şekerler, selüloz, lignin, yağ ve protein bakımından incelenir. Gerektiğinde dokular öğütülür veya kitlesel olarak incelenir. Mümkünse preparatlar yapılarak mikroskopta incelenir. Ayrıca ekmek, çeşitli tahıllar, süt tozu, bebek mamaları, sosis, salam, hazır çorbalar da yukarıdaki maddeler bakımından incelenebilir.