Overview
Bu video, bir arenada solucan hareketini kaydetmek için video ve izleme yazılımının kullanımını açıklar. Örnek protokol, etanol maruziyetinin solucan locomotion üzerindeki etkisini ölçmektedir.
Protocol
Aşağıdaki protokol, Etanol'ün Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp'in Locomotion Hızı üzerindeki Etkilerini Ölçmek için Bir Tahlil olan Davies ve ark.'dan bir alıntıdır. (2015).
-
Tahlilden Önceki Gün Gerçekleştirilmesi Gereken Adımlar
- L4 evre solucanları OP50 E. coliçimi ile tohumlanmış taze nematod büyüme ortamı (NGM) plakalarına seçin ve 20 °C O/ N'de kültüre edin. Her test koşulu 10 solucan gerektirir; O/N solucan kaybına izin vermek için fazla miktarda solucan seçin.
- Sadece ilk gün yetişkin olan hayvanları tahlil edin; birçok mutant vahşi tipten daha yavaş büyür. Gelişimsel gecikmeleri olan suşlar için toplama zamanlamasını, test edilen tüm hayvanların ilk gün yetişkin olması için ayarlayın.
- L4 evre solucanları OP50 E. coliçimi ile tohumlanmış taze nematod büyüme ortamı (NGM) plakalarına seçin ve 20 °C O/ N'de kültüre edin. Her test koşulu 10 solucan gerektirir; O/N solucan kaybına izin vermek için fazla miktarda solucan seçin.
- Tahlil Günü Gerçekleştirilmesi Gereken Adımlar
- Tahlil için hazırlık:
- Standart unseeded 60 x 15 mm NGM plakalar üzerinde tahliller gerçekleştirin. 37 °C'de kullanılacak tüm plakaları 2 saat boyunca kapakları kapalı olarak kurulayın. Her deneysel deneme için dört kurutulmuş NGM plakası kullanın; bunlar 0 mM ve 400 mM etanol test plakaları ve bunlara eşlik eden acclimation plakaları olacaktır.
NOT: Burada NGM plakalarının kullanımı önemlidir; plakaların bileşimindeki farklılıklar, özellikle de ozmolariteleri, etanollerin davranış üzerindeki doz tepkisini güçlü bir şekilde etkileyebilir, bunun nedeni, en azından kısmen hayvanlar tarafından biriken etanol miktarındaki değişikliklerdir. NGM agar 160 mOsm'dir.
- Kuruduktan sonra, tahlilde kullanılacak katlanmamış NGM plakalarının her birini tartın ve ağırlığı not edin. Boş bir plakanın ağırlığına göre plakalardaki ortam hacmini belirleyin. Agar ağırlığının hacme dönüşümünü yaklaşık olarak tahmin etmek için, ortamın eşit miktarda su ile aynı ağırlığa sahip olduğunu varsayalım.
NOT: En tutarlı sonuçlarımız, orijinal 10 ml'lik bir hacmin 8,3-8,9 ml arasında kurutma sonrası hacme sahip olduğu için yeterince susuz kalan NGM ortamları ile bulunmuştur. 2 saat kuru zamana bir alternatif, kuvözlerdeki farklılıkları hesaba katmak için plakalar bu hacim aralığına ulaşana kadar kurumaktır.
- Solucanların farklı genotipleri veya tedavi grupları için ağıl görevi görmek için 4 bakır halkayı (iç çapı 1,6 cm) plakaların her birinin yüzeyine eritin. Her halkayı forsepsle kavrayın ve yaklaşık 3 saniye boyunca bir alevde ısıtın (Bunsen brülöründen gelen güçlü bir alev iyi çalışır). Yüzüğü 'atlamasını' önlemek için halkayı hala tokmaklarla tutarken hemen bir tabağa yerleştirin.
- Halkanın yüzeyindeki birkaç noktadaki tokmalarla hafifçe bastırarak halkanın agar yüzeyine doğru düz olduğundan emin olun. Yüzüğü yerleştirirken, ek üç halka için yer bırakmaya dikkat edin.
- Üç bakır halkayı plakanın yüzeyine eritin, mümkün olduğunca birbirine yerleştirmeye özen edin, böylece dördü de kameranın görüş alanında olacaktır.
NOT: Agar ile iyi bir mühür yapmak, test sırasında solucanları halkalarda tutmak için gereklidir. Plaka üzerinde zıplayan halkaların agar ile doğru contayı yapması olası değildir ve solucanların yuva yapmasına izin veren ve solucanları görselleştirmeye müdahale eden agarı yaralayabilir.
- Her test plakası için, kurutulması ve katedilmemiş olması gereken ve etanol almayacak bir "acclimation" plakası hazırlayın. Bu plakalara dört bakır halka yerleştirin.
- Her halkanın yanındaki plakaların altını halkada kullanılacak solucan suşu ile etiketle, halkanın görüş alanında yazmamaya dikkat edin. Test plakasındaki etiketleri beraberindeki alışma plakasıyla eşleştirin.
- Son konsantrasyonun 0 mM veya 400 mM etanol (ağırlıktan hacme) olması için her test plakasına eklenecek% 100 etanol miktarını hesaplayın. Her deney için (n = 1), bir 0 mM ve bir 400 mM etanol plakası olacaktır; iklimlendirme plakaları etanol almaz. Etanol ekleyin, plakanın yüzeyine borulayın. Plakayı kapatmak ve tezgah üstünde 2 saat boyunca aşındırmasına izin vermek için laboratuvar filmi kullanın.
- 1,5 saat geçtiğinde, tahlil adımını başlatın, adım 2.2.
- Standart unseeded 60 x 15 mm NGM plakalar üzerinde tahliller gerçekleştirin. 37 °C'de kullanılacak tüm plakaları 2 saat boyunca kapakları kapalı olarak kurulayın. Her deneysel deneme için dört kurutulmuş NGM plakası kullanın; bunlar 0 mM ve 400 mM etanol test plakaları ve bunlara eşlik eden acclimation plakaları olacaktır.
- Locomotion tahlil gerçekleştirin: Tahlil plakaları
- Her deney grubundan 10 solucanı, alışma plakasındaki bakır bir halkanın ortasına dikkatlice aktarın. Solucan toplama ile hafifçe kazıyarak bu noktada agar üzerinde görülebilen yiyecekleri çıkarın. Deneysel grupların deneysel denemeler boyunca plakalara konma sırasını farklılık gösterir, böylece aynı suşlar denemeler boyunca aynı sırayla plakalara konulmayacaktır.
NOT: Amaç, hayvanları minimum miktarda yiyecekle tabağa aktarmaktır, çünkü alışma plakasındaki yiyecekler test tabağına aktarılırsa solucanlar yiyeceklerin etrafında toplanır ve ilacın hareketlilik üzerindeki etkisi gizlenir.
- Solucanların yuva yapmasına izin vereceğinden ve tahlilleri bozacağından, agar yüzeyini kazma ile kırmamaya dikkat edin. Solucanları RT'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
- Her plakanın başlatmaları arasında uygun bir aralık olduğundan emin olun. Deneyimli bir deneyci 40 hayvanı hareket ettirebilir, < 1,5 dakikada 4 halka için 10/ halka, ancak 2 dakikaya kadar herhangi bir aralık kabul edilebilir. Standart test, hem 0 mM hem de 400 mM etanol için 10-12 dk ve 30-32 dk pozlamada film kaydına sahiptir.
- İkinci film başlamadan önce ilk film dosyasının kaydedilmesine izin vermek için 0 mM pozlama için acclimation plakasını ve 400 mM pozlama için alışma plakasını yaklaşık 2 dakika 30 saniye arayla başlatın.
- 30 dakikalık alışma süresinden sonra, solucanları acclimation plakalarından test plakalarına aktarın. Solucanları, her plakanın tamamlanması arasındaki zamanlamayı takip ederek, alışma plakasına eklendikleri sırayla test plakalarına (0 mM veya 400 mM etanol) aktarın. Buharlaşmaya etanol kaybını en aza indirmek için plakayı laboratuvar filmi ile kapatın.
- Düzleştirilmiş çekmenin üstünde solucan toplamak için ince kenarlı düzleştirilmiş bir solucan çekme ile bir kepçe hareketi kullanın. Solucanların, solucanı kazmaya yapıştırmaya yardımcı olduğu için solucanların aktarılmasında yaygın olarak kullanılan bakteri kullanmadan, katlanmamış iklimlendirme plakasından test plakasına transferini gerçekleştirin.
NOT: Hayvanların bu adımda transfer edilme hızı çok önemlidir, çünkü plakadaki ilk solucanlar plakaya eklenen son solucanlardan daha uzun süre etanol maruz kalacaktır ve daha önceki zaman noktaları zamana bağlı bazı etkiler gösterebilir. Bu, deneysel kopyalarda önce bir tabağa yerleştirilen suşların döndürülmesinin ana nedenidir.
- Her deney grubundan 10 solucanı, alışma plakasındaki bakır bir halkanın ortasına dikkatlice aktarın. Solucan toplama ile hafifçe kazıyarak bu noktada agar üzerinde görülebilen yiyecekleri çıkarın. Deneysel grupların deneysel denemeler boyunca plakalara konma sırasını farklılık gösterir, böylece aynı suşlar denemeler boyunca aynı sırayla plakalara konulmayacaktır.
- Locomotion Tahlil Yap: Film Çekimi
- 0,5x mikroskop hedefi, 0,8x büyütme ve 2048x20487,4 μm piksel CCD'ye sahip bir kamera gibi görüş alanındaki dört halkanın da (yaklaşık 42x42 mm 2 kare) aynı anda görüntülenmesini sağlayan bir mikroskop/kamera kombinasyonu kullanın.
- Yoğunluk eşiği adımında nesne tanımaya yardımcı olan görüş alanında eşit aydınlatma kullanın. 3"x3" arka ışık iyi çalışır.
- Solucanları, geleneksel mikroskopla iletilen ışık kaynağına kıyasla arka ışığı kullanırken kaybolan kontrastı oluşturan, medya tarafı yukarı (kapak aşağı) konumlandırılmış bir plaka üzerinde görüntüleyin.
- Hareketli solucanların hızlandırılmış filmlerini yakalamak için görüntü analiz yazılımını hazırlayın. Yazılımı her 1 saniyede bir 12 bit gri ölçekli görüntüler yakalayacak şekilde 2 dakikalık (120 kare) bir film olarak ayarlayın. Çıktı dosyasının boyutunu küçültmek için, yeterli görüntü çözünürlüğünü korurken, 1024x1024 piksel görüntüleri yakalamak için 2x2 binning modunu kullanın.
- Filmleri kaydet. Son solucanlar bu tabağa yerleştirildikten 10 dakika sonra ilk plakanın (0 mM etanol) 120 karelik bir filmini kaydetmeye başlayın. Film dosyasını kaydedin.
- İkinci plakayı (400 mM etanol) kaydedin. Her pozlama için 30-32 dakikalık zaman noktalarını yakalamak için son solucanlar ilk plakaya (0 mM etanol) yerleştirildikten 30 dakika sonra başlayan her iki plaka için de bu işlemi tekrarlayın.
NOT: Analiz edilecek bir sonraki plakanın kaydına başlamadan önce her yakalama oturumundan sonra görüntü dosyalarını kaydetmek için yeterli zamana izin verin.
- Arşivlenmiş filmlerin geleceğe yönelik olarak hazırlanması ve bu filmlerin ImageJ gibi diğer kamu malı açık kaynaklı görüntüleme yazılımı programları tarafından açılmasına ve analiz edilmesine izin vermek için, her filmin bir kopyasını 8 bit 256 gri ölçekli TIFF dosyalarına dönüştürün.
NOT: Burada açıklanan görüntü analizi yazılımı özel bir dosya biçimi kullanır.
- Tahlil için hazırlık:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
|Name||Company||Catalog Number||Comments|
|C. elegans strains||Caenorhabditis Genetics Center|
|60 x 15 mm Petri plates, triple vented||Greiner Bio-One||628161||Other plate brands will suffice.|
|NGM agar||Various||NaCl (3 g/L), agar (17 g/L), peptone (2.5 g/L), 1 ml cholesterol (5 mg/ml in ethanol), 1 ml (1 M) MgSO4, 1 ml (1 M) CaCl2, 25 ml (1 M) KPO4, pH=6, 975 ml H2O|
|Forceps||Various||e.g., Fisher Scientific #10300|
|37 °C Incubator||Various||For drying agar|
|Copper rings||Plumbmaster||STK#35583 (48 cap thread gasket)||1.6 cm inner diameter, 1.8 cm outer diameter copper rings|
|100% ethanol||Various|
|Parafilm M||Bemis||PM996|
|CCD camera||QImaging||RET-4000R-F-M-12||This camera has a large field of view.|
|Stereomicroscope with C-mount and 0.5X objective||Leica||MZ6||Discontinued model, M60 is current equivalent.|
|Light source||Schott||A08923||3”x3” backlight for even illumination across the field of view|
|Imaging and tracking software||Media Cybernetics||ImagePro-Plus v6.0-6.3||Newer versions of the software have tracking functions.|