CRISPR-Cas9'un ilk günlerinden beri, araştırmacılar bu gen düzenleme teknolojisinin işleri kırmak için mükemmel olduğunu biliyorlar. Keskin olarak, bu makas benzeri aletler, bir snip yapmak ve bir geni kırmak için genomdaki herhangi bir yere gönderilebilir. Ama tam olarak nerede ve nasıl CRISPR-Cas9 genini bozacak birisinin tahminiydi. Şimdiye kadar. Brigham ve Kadın Hastanesi'ndeki araştırmacılar, Broad Institute ve MIT'deki meslektaşlarıyla işbirliği içinde, şablonsuz Cas9 düzenlemesinin öngörülebilir olduğunu ve eklemeleri ve delesyonları yüksek doğrulukla tahmin edebilen bir makine öğrenme modeli geliştirdiklerini keşfettiler. Eş-yazarlar Richard Sherwood, PhD, David Liu, PhD ve David Gifford, PhD tarafından yönetilen ekip, Bu yaklaşımın, insan hücre dizileri - Hermansky-Pudlak sendromu, Menkes hastalığı ve ailesel hiperkolesterolemi üç hastalık ile ilgili mutasyonları düzenlemek ve onarmak için kullanılabileceğini gösterdi - örneklerin yarısından fazlasında öngörülebilir bir onarım sonucu. Bu ilerlemelerin hem araştırma hem de klinik uygulamalar için etkileri vardır. Ekibin bulguları bu hafta içinde yayınlandı.Doğa .
"Birçok proje gibi, bu da şaşırtıcı bir sonuçtan çıktı: Biz CRISPR-Cas9'u genomdaki belirli bir noktada rastgele bir dizi mutasyona neden olmak için kullanmak istedik, fakat elde ettiğimiz mutasyonların rastlantısal olmaktan çok uzak olduğunu keşfettik. Brigham'ın Genetik Bölümü'nün baş araştırmacısı Sherwood, dedi. "CRISPR-Cas9'u yönettiğiniz altta yatan dizinin yüksek oranda doğrulukla hangi mutasyonların elde edileceğini tahmin etmenize izin veriyor."
Birçok genetik hastalık, bir genin işlevini bozan, bunları kopyalayabilen veya bunları doğrulukla düzelten ekleme ve delesyonlardan kaynaklanır. CRISPR-Cas9 araştırmacıları arasındaki konvansiyonel bilgelik, araştırmacıların sözde bir onarım şablonu içermedikçe, aracın bir gende rastgele bir şekilde ekleme ve delesyonlar oluşturduğuna karar vermiştir. Ancak Sherwood'un ekibi, şablonsuz bile olsa, hangi ekleme ve silme işlemlerinin gerçekleşebileceğini tahmin edebilir. Bazı genomik bölgelerde, belirli bir mutasyon baskındır - ekip, bu tür tek bir mutasyonun tüm ana düzenleme ürünlerinin yüzde 50'sinden fazlasını oluşturduğunu belirtmek için "kesin-50" terimini kullanmıştır.
Projelerini yürütmek için, Brigham'ın Genetik Bölümü'nün baş araştırmacılarından Christopher Cassa (PhD) de dahil olmak üzere Sherwood ve arkadaşları, DNA hedef siteleri ile eşleştirilmiş 2000 Cas9 kılavuz RNA (gRNA) kütüphanesi inşa ettiler. Bir makine öğrenim modeli olan inDelphi'yi eğitmek için bu kütüphaneyi kullandılar. InDelphi'nin beş insan ve fare hücre çizgisinde farklı uzunluklarda ve tek baz çifti eklemeleriyle yüksek doğrulukta (r = 0.87) delesyonunu tahmin edebildiğini ve gRNA'ların yüzde 11'ine kadar çıkabileceğini öngördüğünü bulmuşlardır.
Bu bulguları doğrulamak için, ekip mikroduplikasyonlardan kaynaklanan genetik hastalıkları olan hastalardan toplanan hücrelerde mutasyonları düzeltmek için seçilmiş gRNA'lar kullandı; bu, az miktarda genetik materyalin çoğaldığı kromozomal bir değişimdi. Özellikle Porto Rikolularda yaygın olan Hermansky-Pudlak sendromu, kan pıhtılaşma bozukluğuna ve albinizm neden olur. Menkes hastalığı bakır eksikliği ile sonuçlanır. Ekip ayrıca, ailesel hiperkolesterolemi ile LDL kolesterol seviyelerinin anormal derecede yüksek olduğu bir hastalığa yol açan mikroduplikasyonlara sahip hücreler üretmiştir. Her üç hastalık için, uygun Cas9 ve kılavuz RNA'nın sağlanması mutasyonu yüksek verimlilikle düzeltmiştir.
Yazarlar bu çalışmanın hala bir kanıt-kanıtı olduğuna dikkat çekiyorlar - laboratuvardaki hücresel modellerde umut vaat ederken, daha fazla test ve klinik uygulamaya getirmek için ek adımlar gerektiriyor. Ek olarak, sadece Cas9 kılavuz RNA'ların yüzde 5 ila 11'i "hassas-50" standardını karşıladı. Sherwood ve ekip şimdi, bazı eklemelerin veya delesyonların neden diğerlerinden daha yaygın olduğunu anlayarak kılavuz RNA'ların verimliliğini optimize etmeye çalışacak. Başkalarının mevcut terapötik uygulamalarda doğruluk için düzenleyici standartları belirlemek ve geliştirdikleri uygulamaları genişletmek için geliştirdikleri araçları kullanacaklarını umuyorlar.
"Şu anda, CRISPR-Cas9 için terapötik uygulamalar hakkında düşünen çoğu şirket, bir hastalığı tedavi etmek için hangi genleri kırmanız gerektiğini düşünüyor. Bulgularımız, bunun yerine mutasyonları nerede tamir edebileceğimizi tahmin etmenin mümkün olduğunu gösteriyor," diyor Sherwood . "Yüzde 50 mutasyon düzeltmesi yapmak istemiyoruz - geliştirmeye devam etmek istiyoruz. Şimdi CRISPR-Cas9 düzenlemesinin tahmin edilebilir olduğunu biliyoruz, hastalık mutasyonlarının nasıl daha kesin olarak düzeltileceğini ölçmek için bir parametreye sahibiz."