PCR (Polymerease Chain Reaction) nedir?
Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), spesifik bir DNA parçası veya örneğinin kopyalarının primerler tarafından yönlendirilerek in vitro ortamda enzimatik olarak sentezlenmesidir.
Bu yöntem ile DNA molekülünün milyonlarca hatta milyarlarca kopyası yapılabilir.
PCR Bileşenleri
DNA şablonu
- DNA Polimeraz Enzimi
- DNA Template
- Primerler
- Nükleotitler
- Reaksiyon Tamponu
, kopyalamak istediğiniz belirli DNA dizisidir.
PCR için uygun bir DNA polimeraz
enzimi için iki gereksinim vardır. İlk olarak, 75 °C civarında iyi bir aktivite oranına sahip bir tanesine ihtiyaç vardır.
İkincisi, her yeni döngünün başında daha fazla enzim eklenmesine gerek kalmaması için 95-100°C sıcaklıklara dayanabilmelidir. Bu özelliklerle ilk keşfedilen, kaplıcalarda bulunan termofilik bir bakteri olan Thermus aquaticus'tan izole edilen Taq
polimerazdır.
Primerler
Doğal olarak sıcak bir ortamdan geldiği için PCR'de gerekli olan yüksek sıcaklıklarda kolay denatüre olmaz; artı 70°C'de 60 baz çifti/sn ekleyebilen iyi bir verimliliğe sahiptir.
, genellikle uzunlukları yaklaşık 8-60 baz çifti olan kısa DNA oligonükleotitleridir. Projenin amacı genel genomik çalışmalar ise, rastgele diziler olabilirler. Bununla birlikte, amaç bilinen bir gen gibi genomdaki belirli bir DNA bölümünü amplifiye etmekse, spesifik dizilerin primerleri kullanılmalıdır.
Dört farklı deoksiribonükleotit trifosfat (dNTP), adenin (A), guanin (G), sitozin (C) ve timin (T), DNA replikasyonu için yapı taşları sağlamak için gereklidir. DNA polimeraz, normal A-T ve C-G eşleşmelerini takiben, orijinal zincirin dizisine göre yeni büyüyen DNA zincirine tamamlayıcı bazları ekemektedir.
Stabil bir pH sağlamak için bir reaksiyon tamponu
kullanılır. Ayrıca magnezyum klorür içerebilir, yoksa MgCl2 ayrıca eklenmelidir. Mg2+, PCR reaksiyonunda hayati bir rol oynar, Taq polimeraz için bir kofaktör görevi görür ve böylece enzim aktivitesini etkiler.
PCR Sıcaklık Döngüleri (Temperature Cycles)
Genel olarak, tek bir PCR çalışması 25-35 döngüden geçecektir.
-
Denaturasyon (Denaturation)
Tek bir döngü için ilk adım, çift sarmallı DNA şablon molekülünün tek sarmal haline getirildiği denatürasyon adımıdır. Bu aşamada sıcaklık tipik olarak kaynamaya yakın, 95-100°C aralığındadır. Yüksek ısı, teller arasındaki hidrojen bağlarını koparır. PCR karışımı ısıtılarak hidrojen bağlarının kırılması ve DNA'nın tek iplikli hale gelmesi sağlanır.
İkinci adım, primerlerin tek sarmallı DNA şablonundaki tamamlayıcı dizilere bağlandığı bir primer tavlama adımıdır. Bu adım için genel sıcaklık aralığı 45-55°C'dir. Bu tavlama adımında sıcaklık çok daha düşüktür ve primerlerin tek iplikli DNA şablonuna bağlanmasına izin verir.
Son PCR adımı, DNA polimeraz enziminin (Taq polimeraz), yeni bir tamamlayıcı DNA parçasını uzatarak primere yeni bazlar bağlamasıdır. PCR'nin son adımının ve ilk döngüsünün tamamlanması, mevcut DNA şablonu miktarının iki katına çıkmasıyla sonuçlanır. Kimyasal karışım yaklaşık 75°C'ye ısıtılır ve yeni sentezlenen DNA ipliği kopyalanacak şablon alanının sonuna kadar uzatılır. Bu adımın tamamlanması aynı zamanda bir döngünün tamamlanmasıdır.
2. döngü için denatürasyon, tavlama ve uzatma adımları tekrar tekrarlanır. Bu sefer, 1. döngünün başındakinin iki katı kadar DNA şablon molekülü olacaktır. Başka bir deyişle, orijinal şablondan ve önceki döngüde yapılan kopyalardan kopyalar yapılmaktadır. Bu nedenle, her şey doğru çalışıyorsa, bir döngünün sonunda, o belirli DNA dizisinin miktarı, döngünün başında bulunan miktarın iki katıdır.
Thermal Cycler
DNA örneklerini ısıtan ve soğutan sistemlere Termal Isıl Döngüleyici (Thermal Cycler)
denir. Küçük tüp, tek bir PCR reaksiyonu için gereken tüm kimyasal bileşenleri içerir. Belirli sıcaklıklar ve her sıcaklıkta harcanan süre için bir termal döngüleyici programlanabilir. Bir sıcaklığa ısınmak veya başka bir sıcaklığa soğumak için geçen süreye 'rampa süresi' denir. Bu süre, bazı termal döngüleyici modellerinde de kontrol edilebilir.