Diğer moleküler imzaların yanı sıra 3B kromatin yapısı ve epigenetik modifikasyonlar tarafından desteklenen kök hücre plastisitesi, farklılaşma sürecini harici ipuçları olmadan oldukça stokastik hale getirir. Kök hücrelerin bu içsel plastisitesinin bir sonucu olarak, ilgilenilen hücre tipine yönelik doğrudan farklılaşma özellikle zorlayıcı hale gelir. İlginç bir şekilde, tasarlanmış mikro ve nano topografiler, temas rehberliğinin neden olduğu nükleer deformasyona neden olabilir ve potansiyel olarak hücresel plastisiteyi modüle edebilir ve soya özgü farklılaşmayı en üst düzeye çıkarabilir. Bununla birlikte, özellikle doku-implant arayüzünde doku rejenerasyonunun ilaç/sitokinsiz hızlanması için fenotipik sonuçları düzenleyen mühendislik topografyaları araştırılmamıştır.
Kromatin paketleme, 2 metre uzunluğundaki DNA polimerinin nispeten küçük bir ~10 μm hücre çekirdeği içindeki konformasyonunu belirler ve dış ipuçlarına transkripsiyonel yanıt vermenin ana düzenleyicisidir. Sonuç olarak, nükleer morfoloji, hücrelerin fenotipik sonuçları için önemli etkileri olan kromatin yeniden modellemesini ve transkripsiyonel yeniden programlamayı düzenlemede kritik bir rol oynar. in vivo, habis hücre migrasyonu ve düz kas hücresi kontraksiyonu gibi çeşitli biyolojik süreçlerin yanı sıra kök hücre homingine nükleer deformasyon eşlik eder. Nükleer morfolojideki bu tür değişiklikler, temas kılavuzu aracılığıyla tanımlanmış topografyalara sahip yüzeylerde çoğaltılabilir. laboratuvar ortamında. Burada, nükleer morfolojinin insan mezenkimal stromal hücrelerinin (hMSC’ler) osteojenik farklılaşması üzerindeki etkisini araştırmak için mikro topografi mühendisliği, moleküler biyoloji ve gelişmiş nanoyapısal görüntüleme araçlarını entegre ettik. Çalışmamız, hücre plastisitesini ve kök hücrelerin dış farklılaşma ipuçlarına transkripsiyon yanıtını modüle etmek için bir araç olarak temas rehberliği kaynaklı nükleer daralma yoluyla kromatin mühendisliğini göstermektedir. Temas rehberliği kaynaklı kromatin yeniden programlama ve hedeflenen hücre farklılaşması için doğrudan kanıt sağlıyoruz. laboratuvar ortamında Ve in-vivo. Elde edilen kromatin yeniden organizasyonunun transkripsiyonel yeniden programlamaya neden olduğunu gösteriyoruz Ayrıca, mikrotopografi mühendisliğinin, çekirdeğin ve hücre iskeletinin deforme olmuş çekirdeklerde 3-D kromatin konformasyon üzerindeki etkilerini ayırmak için bir araç olarak kullanılabileceğini gösteriyoruz. Daha da önemlisi, gelişmiş kemik rejenerasyonunu ilk kez gösteriyoruz in-vivo mikropillars üzerinde temas rehberliği kaynaklı kromatinin yeniden programlanması nedeniyle.
Nükleer morfoloji değişikliği nükleer yapıyı nasıl etkiler?
Nükleer morfolojiyi kontrol etmek için, sitrat bazlı bir biyomateryal (CBB) olan metakrilatlanmış poli (oktametilen sitrat) (mPOC) ile çeşitli boyut, şekil ve aralıklara sahip mikropillar yapıları tasarladık ve ürettik.TM, ABD Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) tarafından kas-iskelet ameliyatlarında kullanılmasına izin verilen biyolojik olarak parçalanabilen doku sabitleme cihazlarının üretiminde kullanılmıştır. Mikroyapılar, hücre morfolojisini ve hücre iskeleti düzeneğini etkiledi. F-aktin ve ara filamentler, çekirdeği mikrosütunların arasına sokan ve nükleer deformasyona neden olan sıkıştırma ve çekme kuvveti sağladı. Mikro sütunların hapsedilmesi nedeniyle, deforme olmuş çekirdek, farklı nükleer lamin topluluğu ve kromatin yoğunluğu gösterdi (Şekil 1). Lamin a/c’nin multimerizasyonu, deforme olmuş çekirdekte mikropiller çevresinde, deforme olmamış çekirdekte bazal tarafta meydana geldi. Sonuç olarak, laminle ilişkili kromatinin organizasyonu mikropillarda değiştirilir. Mikropillar yüzeyler üzerindeki hMSC çekirdeklerinde kromatin konsantrasyonunun, özellikle heterokromatin benzeri alanların, nükleer kenara doğru yeniden yerleşimlerinde bir artış olduğunu gösteren düz yüzeylere kıyasla arttığını bulduk.
Şekil 1. Mikro sütun kaynaklı nükleer deformasyon, nükleer yapısal bileşenlerdeki değişikliklerle ilişkilidir. A. Düz ve mikropillar yüzeylerde hMSC çekirdeklerinin lamin A/C boyama görüntüleri. B. Düz ve mikropillar yüzeylerde ekilmiş hMSC’lerin 50 nm kalınlığındaki reçine bölümlerinin ChromTEM görüntüleri. Turuncu ok, mikro sütunların yerini gösterir. C. Üst: Radyal Kromatin konsantrasyon analizi, konumundan nükleer çevreye olan mesafenin bir fonksiyonu olarak ardışık 25 nm kalın bantlar içindeki kromatin yüzdesi ile tanımlanır. Altta: ChromTEM görüntüleri 25 nm, 250 nm, 500 nm ve 750 nm’de radyal bantları gösterir.
Kromatinin yeniden programlanması transkripsiyonu nasıl etkiler?
Önceki çalışmamıza dayanarak1kromatin paketleme ölçeklendirmesinin (D), transkripsiyon düzenlemesi ile ilişkili ve aynı zamanda fenotipik plastisitenin çok önemli bir düzenleyicisi olan önemli bir fiziksel özelliktir. Kısmi dalga spektroskopik (PWS) mikroskopi kullanarak ölçüm yapabiliyoruz. D canlı hMSC’lerde 20 nm kadar küçük uzunluk ölçeklerine duyarlılık ile (Şekil 2). dramatik bir düşüş gösterdi. D düz yüzeylerle karşılaştırıldığında mikro sütunlar üzerinde, kromatin konformasyonunda ciddi bir değişiklik olduğunu gösterir. Kromatin konformasyonunun hücre fenotipini nasıl etkilediğini anlamak için, sırasıyla büyüme ve osteojenik indüksiyon ortamı ile düz ve mikropillar yüzeylerde kültürlenmiş hMSC’lerde RNA dizilimi ve ATAC dizilimi gerçekleştirdik. Mikro sütunlar üzerindeki gen ifadesindeki değişikliklerin, kromatin erişilebilirliğindeki değişikliklerle ilişkili olduğunu ortaya çıkardı. Spesifik olarak, dış uyarana yanıt olarak yer alan genlerin ifadesinde yukarı düzenleme bulduk. Böylece, soya özgü yanıt verme katsayısını değerlendirdik, RLSdüz bir yüzeye kıyasla bir mikropillar yüzey üzerindeki kök hücrelerin bir dış farklılaşma uyarısına ortalama transkripsiyonel tepki olarak tanımlanır. Kromatin paketleme makromoleküler kalabalıklaştırma (CPMC) modelimize dayalıdır1osteojenik farklılaşma indüksiyonuna soya özgü transkripsiyonel tepkinin düşükte arttığını ortaya çıkardık. D yüksek ile karşılaştırıldığında mikropiller üzerindeki hücreler D gelişmiş transkripsiyonel uyum gösteren düz yüzeyler üzerinde kültürlenmiş hücreler. ile daha da doğrulandı. laboratuvar ortamında hMSC’lerin osteojenik farklılaşması. Deforme çekirdeklere sahip hücreler, indüksiyon üzerine gelişmiş osteojenik farklılaşma gösterdi.
Şekil 2. Deforme olmuş çekirdeklerde kromatin paketleme ölçeğindeki bir azalma, hMSC’lerin osteojenik farklılaşmaya yanıt verebilirliğini artırır. A. Düz ve mikropillar yüzeylerde hMSC’lerin PWS mikroskopisi. B. Mikro sütunlar hücre çekirdeklerini deforme eder ve ortalamayı önemli ölçüde azaltır D kök hücrelerde. C. Düz bir yüzeye tohumlanan hMSC’ler (yüksek D) ve mikropillar yüzey (düşük D) (sırasıyla SF ve SP) osteojenik soya (sırasıyla IF ve IP) doğru farklılaşmaya teşvik edildi. D. Farklılaşma indüksiyonu nedeniyle soya özgü transkripsiyonel yanıt, düşük D hücreler.
Mikropillar implantların biyomedikal anlamı
Yaklaşımımızın klinik alaka düzeyini araştırmak için, kritik boyutlu kalvarial kusurları olan çıplak farelere mPOC yapı iskeleleri ekilmiş hMSC’ler yerleştirdik (Şekil 3). μCT taramaları, mikropillar implantlarla tedavi edilen gelişmiş yeni kemik oluşumu gösterdi. Histoloji görüntüleri, mikropillar implantların daha iyi rejenerasyon etkinliğini doğruladı. Ayrıca, nükleer deformasyon ve kromatin konformasyon değişikliğinin devam ettiğini gösteren mikropillar implante edilmiş doku kesitlerinde daha düşük bir D değeri gözlendi. in vivo.
Figür 3. Mikropiller kaynaklı nükleer deformasyon, kemik rejenerasyonunu destekler in vivo. A. 4 mm çapında iki kritik boyutlu kraniyal kusur oluşturuldu, ardından hMSC tohumlu düz ve mikropillar mPOC yapı iskelelerinin implantasyonu yapıldı. B. Düz ve mikropillar implantlarla tedavi edilen defekt bölgesinde yeni oluşan kemik hacmi. C. Düz ve mikropillar implantlarla tedavi edilen kalvarial defekt dokusunun trikrom boyaması.
Genel olarak, yüzey topolojisinin neden olduğu nükleer daralma, kök hücrelerin rejeneratif potansiyelini tahmin edilebilir bir şekilde modüle etmek için kromatin mühendisliği için bir araç görevi görebilir. Daha da önemlisi, temas rehberliğinin neden olduğu nükleer daralma, kemik yenilenmesini destekledi in vivo, eksojen sinyal molekülleri kullanmadan, mikrotopografi mühendisliğinin biyomedikal implantlara ve cihazlara uygulanabilirliğini vurgulamaktadır. Gelecekteki adımımız, klinik çeviri için büyük ölçekli mikro tasarımlı implantlar geliştirmektir.
Referanslar
1. Virk, RKA et al. Düzensiz kromatin paketleme fenotipik plastisiteyi düzenler. bilim Av. 6eaax6232 (2020).