Doğal Nükleositler – Biyokimya ve Moleküler Biyolojide Laboratuvar Teknikleri – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri
Metanol veya asetonitril bazen nükleosit bazlarının ters faz ayrımlarında organik modifiye ediciler olarak kullanılır ve tutma sürelerini azaltma ve seçicilikleri değiştirmenin etkisi. Asetat tamponları da fosfat tamponlarına bir alternatif olarak kullanılmıştır, ancak muhtemelen çözünen moleküller ile polar olmayan komplekslerin oluşumu nedeniyle nispeten düşük kolon verimleri sağlar.
Elüent tamponunun pH’ı, nükleosid bazının iyonizasyon durumunda bir değişiklik meydana gelmedikçe tutma üzerinde çok az etkiye sahiptir. Bu değişiklik, tutma süresi üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir ve seçicilik üzerinde ince kontrole izin verir.
Ters faz modu, nükleosit bazlarını içeren çoğu ayırma için yeterlidir, ancak bazı modifiye edilmiş bazlar için çözücü cephesinden çözünürlük bir sorun olabilir. Bu, ters fazlı iyon çifti modu kullanılarak basitçe aşılır.
Bu nedenle, 2.5 mM potasyum fosfat (pH 5.6) içinde 5 mM heptan sülfonat içeren bir mobil faz kullanılarak, sitozin ve 5-metilsitozinin ayrıştırılması mümkün olmuştur.
Ters fazlı iyon çifti HPLC’yi etkileyen faktörlerin zarif bir çalışmasında, 5-floroürasil ve onun analog 5′-de-oksi-5-floroüridinin bazlarının, nükleositlerinin ve nükleotidlerinin ayrılması iki aşamalı bir elüsyon prosedüründe gerçekleştirildi. Tercih edilen mobil faz, 2 mM sodyum asetat-1.5 mM fosfat tamponu, pH 6.0 içinde 0.1 mM tetrabutilamonyum iyonları, 2.5 mM tetraetilamonyum iyonları ve% 2 metanol içeriyordu.
Modifiye edilmemiş silika üzerinde nükleositlerin ve bunlara karşılık gelen bazların ayrılması da sağlanmıştır. Nükleosit türevleri dahil biyolojik olarak önemli en az elli bileşiğin tutulma süreleri bildirilmiştir.
Ters fazlı kromatografi kullanılarak kolaylıkla çözülmeyen birkaç bileşen çifti, bir diklorometan, metanol ve sulu tampon karışımı kullanılarak silika üzerinde ayrıldı; Bu tür sistemlerdeki nükleositlerin düşük çözünürlüğü, uygulamayı çok düşük numune boyutları (5-10 pg) ile sınırlamıştır. Benzer bir çalışma, pH ve mobil faz içeriğinin ve konsantrasyonun retansiyon üzerindeki etkilerini araştırdı.
Nükleotit
Nükleotitler
Nükleotid
Nükleotit çeşitleri
Nükleotid Nedir
Nükleik asitlerin yapı taşı
Nükleotit dizilimi
Nükleotitler neye göre isimlendirilir
Nükleositler
Nükleositler, birçok biyolojik sistemde, yalnızca DNA ve RNA’nın öncüleri olarak değil, aynı zamanda kendi başlarına metabolik düzenleyiciler olarak işlev gören hayati bir rol oynarlar. Sonuç olarak, biyolojik sıvılardaki nükleositlerin kantifikasyonu ve HPLC analizi, işlevlerine ilişkin önemli bilgiler sağlayabilir. DNA ve RNA’nın ana ve küçük bileşenlerinin analizi en uygun şekilde nükleosit seviyesinde gerçekleştirilir ve ayrı bir bölüm olarak ele alınacaktır.
Geçmişte nükleositlerin HPLC ayrımları, anyon değişimi ve katyon değişimi dahil olmak üzere çeşitli modlarda ortaya çıkarılmıştır; bununla birlikte, stabil salmastraların ters fazın eklenmesi tercih edilen yöntem haline geldi.
Nükleositlerin ayrılması için tipik kromatografik koşullar, ODS sabit fazlarında metanol veya asetonitril gibi organik değiştiricilerle seyreltik fosfat tamponlarının kullanımını içerir. Bu parametrelerdeki varyasyonların etkileri aşağıda açıklanmaktadır.
P H’nin Etkisi
PH’ın 4.0 ile 8.0 arasında değişmesinin, yaygın nükleositlerin tutulma süresi üzerinde çok az etkisi vardır. Bu aralıkta pH arttıkça daha uzun tutma sürelerine doğru hafif bir eğilim vardır, ancak bu bölgedeki pK değerlerine sahip nükleositler için daha dramatik etkiler ortaya çıkar.
Örneğin, 3-metil sitidin, 5-metil sitidin, 1-metil adenosin, adenosin ve 7-metil guanozin sırasıyla pK, 8,7,4,3,7,6,3,5 ve 7,1 değerlerine sahiptir ve dolayısıyla tutma süreleri orantısız olarak değişir. ücretlerini kazandıkça veya kaybederken. Bu nedenle, pH, ürünün seçiciliğini değiştirmek için kullanılabilir.
kromatografik sistem.
Organik değiştiricinin etkisi
Mobil fazda organik çözücü konsantrasyonunun% 0’dan% 10’a yükseltilmesi genel olarak ortak nükleositlerin tutma sürelerini logaritmik bir şekilde azaltır. Seçicilik faktörlerinin artan metanol konsantrasyonlarına tepkisine bağlı olarak nükleositleri dört farklı gruba ayırmak mümkün olmuştur; bu tür gruplar içinde seçicilikte çok az değişiklik vardır (Gehrke ve diğerleri, 1980).
Etkili sıcaklık
Nükleositlerin tutulma süresi, 25 ila 55 ° C aralığında sıcaklıktaki artışın doğrusal bir fonksiyonu olarak azalır. Artan sıcaklıklarla kolon verimliliği önemli ölçüde artar.
Burada kayda değer, ancak nükleotidlerin analizi için de değerli olan yararlı bir teknik, 2 ‘, 3’-cis-diol içeren ribonükleotidler gibi moleküllerin içermeyen moleküllerden ayrılması için boronik asit afinite sütunlarının kullanılmasıdır. deoksiribonükleositler ve 2 ‘, 3’-siklik nükleosit monofosfatlar gibi bu işlevsellik önemlidir.
2 ’, 3’-cis-diol parçasını içeren alkali pH molekülleri, desteklenen boronat grupları (Hageman ve Kuehn, 1977) ile bir kompleks oluşturacaktır ve pH’ın düşürülmesi ile adsorbe edilen fraksiyon elüe edilebilir ve liyofilizasyon yoluyla uçucu tamponlar çıkarılabilir.
Bu teknik, bir benzen boronik asit grubunun bir aralayıcı molekül aracılığıyla gözenekli silikaya bağlanmasıyla HPLC’de kullanılmak üzere uyarlanmıştır. Ticari olarak temin edilebilen destekler, Bio-Rad Affi-Gel 601’i içerir.
Yukarıda ana hatları verilen genel ilkeler tüm nükleosid ayrımları için geçerlidir, ancak bu tekniklerin değerli olduğu çeşitli alanlardan alınan özel örnekleri dikkate almak öğreticidir.
Doğal Nükleositler
Biyolojik sıvılar ve dokular olarak
Biyolojik dokularda ve sıvılardaki nükleositlerin analizinde HPLC’nin değeri, tekniğin sağladığı çözünürlük ve duyarlılıktan ve bileşiklerin kesin olarak tanımlanma olasılığından kaynaklanmaktadır. Deprotinizasyondan sonra, bir pBondapak C ,, ters faz kolonunda kromatografi gerçekleştirildi.
Nispeten az sayıda makale, HPLC kullanılarak hayvan hücrelerindeki nükleositlerin tahminini bildirmiştir. Ancak hücrelerin metabolik durumu bu şekilde belirlenebilmekte ve bu da bazı hastalıkların ilerleyişinin izlenmesine olanak sağlamaktadır.
Hücre özütlerindeki nükleositlerin yeni bir tespiti, ilk asit çökeltme, nötrleştirme ve santrifüjlemeden sonra sulu bir sodyum asetat-asetonitril mobil faz kullanılarak ters fazlı bir CI8 kolonunda kromatografiden sonra gerçekleştirildi.
Nispeten yüksek nükleotid seviyelerinin mevcudiyetinde (örneğin, kalp hücrelerinde bulunabildiği gibi) nükleositlerin belirlenmesi, en iyi, anyon değişim kromatografisi kullanılarak ekstra bir saflaştırma aşamasından sonra gerçekleştirilebilir. Ayrılan nükleositler daha sonra geleneksel olarak tersine çevrilmiş bir faz Cı sabit fazda analiz edilebilir.
DNA’nın bileşenleri olarak
Prokaryotlardan veya ökaryotlardan gelen çoğu DNA molekülü, replikasyon sonrası işlemeyle üretilen bazı küçük metillenmiş bileşenler içerir. 5-Metilsitosin ve N6-metiladenin genellikle prokaryotlarda meydana gelirken, yalnızca eski genellikle yüksek ökaryotlarda bulunur.