dna molekülü
negatif yüklüdür, suda çözünebilir fakat alkolde çözünmez. basitçe bir dna molekülüne bakacak olursak fosfat grubu, deoksiriboz ve nitrojenli bazdan (a,t,g,c) oluşmaktadır.
izolasyon yöntemlerinde birbirine izleyen 3 aşamadan oluşmaktadır.
1) hücrelerin parçalanması ile yüksek molekül ağırlıklı dna'nın açığa çıkarılması.
2)denatürasyon veya proteoliz ile dna-protein kompleksinin ayrılması ve dna'nın çözünür duruma getirilmesi. (denatürasyon: çift zincirli dna molekülü yüksek ph veya yüksek sıcaklık etkisinde bırakıldığında sarmal yapısında çözünmelerin meydana gelmesidir. denatürasyon işleri geri dönüşümlüdür. (bkz: renaturation
))
3)dna'nın basit enzimatik ve/veya kimyasal yöntemlerle proteinler,rna ve diğer makromoleküllerden ayrılması.
ilk aşama hücre duvarının parçalanması dedik. bahsedelim.
aşama 1: hücre duvarının parçalanması.
-fiziksel parçalanma: dondrup- çözme
-kimyasal madde ile muamele.
bu kimyasal maddeler:
-tuz: hücre duvarından geçerek proteinleri dna'dan ayırır.
-deterjan: hücre duvarının geçirgenliğini arttırarak hücre içeriğinin serbest kalmasını sağlar.
-etil asetat, toluen, sds: membran yapısını bozar.
-edta: mg(+2) bağlayarak dnaz aktivitesini inhibeisyonu ve dna stabilizasyonunu sağlar.
-izopropanol, etanol: nükleik asitlerin çöktürülmesinde kullanılır.
-amonyum sülfat, sodyum sülfat: proteinlerin çötürülmesinde kullanılır.
-proteinaz: homojen bir karışım oluşmasını sağlar.
-rnaz: hücre içinde bulunan rna'lar tek iplikçik halde stabil olabildiklerinden onların da ortamdan uzaklaştırılması gerekmektedir ve bunun için de rnaz enzimi kullanılır.
hücre duvarını geçtik. o da ne? hücre zarı!
aşama 2: hücre membranının parçalanması.
dna ekstraksiyonu için sds (sodium dodecyl sulfate) veya ctab (cetyltrimethylammonium bromide) gibi çözücüler ile muamele edilerek hücre zarı kolayca parçalanır.
artık hücre içine girmiş bulunuyoruz. etrafımıza şöyle bir bakalım neler var... hmm mitokondri, kloroplast, çekirdek, golgi cisimciği. dna'yı istiyoruz biz. dna hücre içinde çekirdekte, mitokondride, kloroplastlarda bulunur.
aşama 3:dna-protein kompleksinin çözülmesi.
-genel olarak kloroform veya fenol karışımı eklenir.
-denatürasyon: kimyasal çözülme gerçekleşir. fenol ekstraksiyonu işlemi kullanılır. fenol ile proteinler ve dna fragmanları birbirinden ayrılır ve uzaklaşmaları sağlanır.
-spin kolon: fiziksel çözülmede kullanılır. dna'yı tutma özellikli. özel solüsyonlar ile dna'nın tüpler içine özel olarak yerleştirilen matriks tabakasına tutunması sağlanır. matrikse tutunamayan moleküller ortamdan uzaklaştırılırlar. böylece dna harici maddelerin hepsi uzaklaşmış olur. daha sonrada elüsyon yardımıyla dna'mızı matriksten ayırırız ve dna'yı elde etmiş oluruz.
spin kolon yöntemi bence en güzelidir. tam bir bilim.
aşama 4: dna'nın ortamdaki diğer moleküllerden ayrıştırılması.
-genelde bu aşamada dna'nın fiziksel ya da kimyasal etkilere maruz bırakılması ile sağlanır. örneğin dna kimyasal olarak çöktürülebilir. bu işlemde en çok kullanılan kimyasal etanol'dür. ayrıca çökeltmeyi sağlayan isopropanol gibi kimyasallar da bu aşamada kullanılır.
-fiziksel uygulamada santrifüj yapılır. santrifüj hızı ve zamanı ayrılması istenilen dna molekülünün ağırlığına göre değişkenlik gösterir.
bu aşamaları sırasıyla uyguladığımızda istediğimiz dna'yı elde etmiş oluruz. artık mikroskopta incelemeye alabilirsiniz. kolay gelsin.