We are searching data for your request:
Upon completion, a link will appear to access the found materials.
Kendi klonumu kullanarak Adipoz Türevli kök hücreleri transfekte etmek istiyorum. Benim sorunum çok fazla kontaminasyon (yalnızca genomik değil, tekniğin doğası gereği, istenmeyen ve kurtulamadığım ürünlerle karşılaşmam).
Bu yüzden, plazmit DNA örneklerim ile bir jel çalıştırmayı ve istediğim bantları saflaştırmayı düşünüyordum. Ancak numunemdeki Ethidium Bromide kontaminasyonu bir sorun teşkil eder mi yoksa normal bir jel ekstraksiyon kiti bundan kurtulur mu bilmiyorum.
DNA bantlarının agaroz jelden kesilerek saflaştırılması ve izolasyonu olağandır (Lee ve diğerleri., 2012). Bandın kesilmesinden sonraki saflaştırma aşaması, EtBr'nin ve diğer safsızlıkların çoğundan kurtulur. Örneğin, Isogen ve Sigma-Aldrich'in web sitelerine bakın.
Referans
- Lee et al. J Vis Exp (2012); 62: e3923
2. PUC Biyoloji Biyoteknolojisi: İlkeler ve Süreçler Tek İşaretli Sorular ve Cevaplar
Soru 1.
Ökaryotik hücrelerde kısıtlama endonükleazları var mı? Cevabınızı gerekçelendirin.
Cevap:
Ökaryotik hücrelerde kısıtlama endonükleazları yoktur. Ökaryotik hücreler, viral enfeksiyona karşı başka savunma araçlarına, yani bağışıklık sistemine sahiptir.
Soru 2.
Genetik mühendisliğinde yaygın olarak kullanılan konak hücreler hangileridir?
Cevap:
E. koli.
Soru 3.
Bitkilerde gen klonlamak için kullanılan yaygın vektörler nelerdir?
Cevap:
Agrobacterium tumefaciens'te bulunan tiplasmid.
Soru 4.
PCR tekniğini kim keşfetti?
Cevap:
Kary Mullis.
Soru 5.
Biyoreaktör nedir?
Cevap:
Aseptik koşullar altında biyolojik reaksiyonları gerçekleştirmek için tasarlanmış bir mühendislik kurulumudur.
Soru 6.
DNA parçalarının ayrılabileceği tekniği adlandırın?
Cevap:
Jel elektroforezi.
7. soru
Taq polimerazın kaynağını adlandırın?
Cevap:
Termos aquaticus.
Soru 8.
Rekombinant proteinler nelerdir?
Cevap:
Bir rekombinant DNA veya transgenik organizmadan üretilen proteinler, rekombinant proteinlerdir.
Soru 9.
Bitki hücresinde transformasyon için yaygın olarak kullanılan vektörü adlandırın?
Cevap:
Agrobacterium tumefacien.
Soru 10.
Kısıtlama enzimini ilk kez kim izole etti?
Cevap:
Warner Arber ve Hamilton Smith.
Soru 11.
Bir patent tanımlayın?
Cevap:
Patent, biyolojik materyalin mucidine belirli bir süre için bir buluşu kullanma, kullanma ve satma konusunda münhasır üretim hakkını güvence altına alan devlet korumasıdır.
Soru 12.
Plazmit terimini tanımlayın.
Cevap:
Otonom olarak kopyalanan dairesel ekstra kromozomal DNA (veya) Bakterilerin sitoplazmasında bulunan dairesel çift sarmallı, ekstra kromozomal DNA.
Soru 13.
Biyoteknolojiyi tanımlar.
Cevap:
Doğa bilimi ve organizmaların, hücrelerin, bunların parçalarının ve moleküler analoglarının ürün ve hizmetler için entegrasyonu Biyoteknoloji olarak bilinir.
Soru 14.
UV radyasyonu altında DNA'yı görselleştirmek için kullanılan bileşiği adlandırın.
Cevap:
Etidyum bromür.
2. PUC Biyoloji Biyoteknoloji: İlkeler ve Süreçler İki İşaretli Sorular ve Cevaplar
Soru 1.
Aşağıdakileri kısaca açıklayın:
(a) Çoğaltmanın kökeni
(b) Biyoreaktörler
(c) Sonraki işlemler.
Cevap:
(a) Replikasyonun Kökeni: Bu, DNA molekülündeki, replikasyonun başladığı ve bu diziye bağlandığında herhangi bir DNA parçasının konakçı hücre içinde kopyalanabileceği dizidir.
(b) Biyoreaktörler: Ticari ölçekte büyük miktarda ürün elde etmek için büyük hacimli (100-1000 litre) kültürün işlenebildiği kültür kaplarıdır.
(c) Aşağı Yönde İşleme: Oluşumdan sonra, bir ürün, bitmiş bir ürün pazarlamaya hazır olmadan önce bazı işlemlerden geçer. Bu işlemler, topluca sonraki işlem olarak adlandırılan ayırma ve saflaştırmayı içerir.
Soru 2.
Kısaca açıklayınız:
(a) PCR
(b) Kısıtlama enzimleri ve DNA
(c) kitinaz
Cevap:
(a) PCR: PCR, Polimeraz Zincir Reaksiyonu anlamına gelir. Bu reaksiyonda, ilgili genin (veya DNA'nın) çoklu kopyaları, primer setleri ve Taq DNA polimeraz enzimi kullanılarak in vitro sentezlenir.
(b) Kısıtlayıcı Enzimler ve DNA: Bakteriyofajların büyümesini kısıtlayan enzimlerdir. Bu enzimler, Kısıtlama Modifikasyon Sistemi adı verilen savunma mekanizmalarının bir parçası olarak işlev gördükleri birçok bakteride bulunur. Kısıtlama enzimleri iki tiptir:
(a) Kısıtlama endonükleazı DNA'yı parçalara ayırır.
(b) Modifikasyon enzimi DNA'ya metil grubu ekler.
(c) Kitinaz: Mantar duvarında bulunan kitinli maddeyi parçalayan bir enzimdir.
Soru 3.
Öğretmeninizle tartışın ve aşağıdakileri nasıl ayırt edeceğinizi öğrenin:
(a) Plazmit DNA ve Kromozomal DNA
(b) RNA ve DNA
(c) Eksonükleaz ve Endonükleaz.
Cevap:
(a) Plazmit DNA ve Kromozomal DNA: Plazmit DNA, bazı bakterilerde bulunan küçük, çift sarmallı dairesel bir DNA'dır. İlaç direnci, N2 fiksasyonu ve doğurganlık için genler taşırlar. Kromozomal DNA, boyut olarak çok daha büyüktür ve hücrenin diğer özellikleri için genler taşır.
(b) RNA ve DNA: RNA, riboz şekeri ve adenin, guanin sitozin ve urasil azotlu bazlar içeren ribonükleotitlerin tek sarmallı polimeridir, oysa DNA, deoksiriboz şeker ve adenin, guanin, sitozin içeren çift sarmallı bir deoksiribo-nükleotit polimeridir. ve timin azotlu bazlar.
(c) Eksonükleaz ve Endonükleaz: Eksonükleazlar, DNA'nın uçlarından nükleotitleri uzaklaştırırken, endonükleazlar DNA içindeki belirli pozisyonlarda kesimler yapar.
Soru 4.
Rekombinant DNA teknolojisinde kullanılan araçlardan bahsedin.
Cevap:
İstenen gen, vektör DNA, enzimler, konak hücre ve Biyoreaktör.
Soru 5.
Palindromik diziler nelerdir? Örnek vermek.
Cevap:
Çift sarmallı bir DNA molekülünde, bir bölgedeki iki zincir hem ileri hem de geri yönde okunduğunda aynıysa, bunlara palindromik diziler denir.
Soru 6.
Restriksiyon endonükleaz nasıl adlandırılır?
Cevap:
Restriksiyon endonükleazının isimlendirilmesi aşağıdaki kurallara dayanmaktadır:
- REN'in ilk harfi, türetildiği bakterinin cins adını ifade eder ve büyük harflerle yazılır.
- İkinci ve üçüncü harfler, türetildiği bakterinin tür adını ifade eder ve küçük bir harf olarak yazılır.
- Dördüncü bir harf varsa, bakteri türünün veya alt türünün adını temsil eder.
- Roma numarası, aynı organizmadan türetilen farklı REN'leri gösterir.
Örn: Hind III.
7. soru
Moleküler makas nedir? Rollerini açıklayın.
Cevap:
DNA'yı belirli bölgelerde parçalayan nükleer enzimlere kısıtlama endonükleazları [REN] denir. REN'ler popüler olarak Biyomoleküler makas olarak bilinir. REN, bir DNA'nın her iki zincirini de aynı pozisyonda veya farklı pozisyonlarda kesebilir,
örneğin: Eco RI, Hind III, Sal I, Bam I.
Soru 8.
Plazmid pBR'nin düzgün etiketli bir diyagramını çizin322
Cevap:
Soru 9.
PCR tekniğinin uygulamalarını yazar.
Cevap:
- DNA ve RNA ipliklerini büyütmek için.
- Kısıtlama parçalarının birbirine göre yönelimini ve konumunu incelemek.
- Kromozomlarda mutasyonların/mutasyona uğramış genlerin varlığının tespiti.
- DNA parmak izlerini tanımlamak için.
Soru 10.
nükleazlar nedir? Eksonükleazlar ve endonükleazlar arasında ayrım yapın.
Cevap:
Kısıtlama enzimleri nükleazlardır. Eksonükleazlar ve ekzonükleazlar olmak üzere iki çeşittirler.
endonükleazlar.
Eksonükleazlar, nükleotitleri DNA'nın uçlarından uzaklaştırır ve endonükleazlar, DNA'nın kendi içindeki belirli noktaları kesebilir.
Soru 11.
Karıştırılan tank biyo-reaktörünün düzgün etiketli bir diyagramını çizin.
Cevap:
Soru 12.
'Seçilebilir işaretçiler' nedir? Genetik mühendisliğinde kullanımları nedir?
Cevap:
Seçilebilir bir işaretleyici, vektörü içeren konakçı hücrelerin seçilmesine ve dönüştürülmeyen maddelerin, örn. antibiyotiklere direnci kodlayan gen, sadece transformantların seçici büyümesine izin verdikleri için yararlı seçilebilir işaretlerdir.
Soru 13.
"Ekleme devre dışı bırakma" nedir?
Cevap:
B – galaktosidaz enziminin kodlama dizisine bir rekombinant DNA sokulursa, bu, "İnsersiyonel inaktivasyon" olarak adlandırılan enzimin inaktivasyonu ile sonuçlanır. Kromojenik substratın varlığı mavi renkli koloniler verir, eğer bakterideki plazmid bir inserte sahip değilse, insert varlığı sokma inaktivasyonuna neden olur ve koloniler herhangi bir renk üretmez.
Soru 14.
Serpme karıştırılmış tank biyoreaktörünün düzgün etiketli bir diyagramını çizin.
Cevap:
Soru 15.
Biyoreaktörler nelerdir? Genetik mühendisliğinde en sık kullanılan biyoreaktörü adlandırın.
Cevap:
Aseptik koşullar altında biyolojik reaksiyonları gerçekleştirmek için tasarlanmış bir mühendislik kurulumudur.
2. PUC Biyoloji Biyoteknoloji: İlkeler ve Süreçler Üç İşaretli Sorular ve Cevaplar
Soru 1.
Modern Biyoteknolojide yer alan iki temel teknik nelerdir?
Cevap:
Modem Biyoteknolojide yer alan iki temel teknik şunlardır:
(a) Genetik materyalin doğasını değiştirme veya fenotipini değiştirmek için başka bir konakçı organizmaya sokma tekniği olan Genetik Mühendisliği.
(b) Üretim için steril koşullar altında çok sayıda istenen mikropların veya hücrelerin büyümesini ve çoğalmasını kolaylaştıran teknikler.
Soru 2.
Genetiği değiştirilmiş organizmalar nelerdir? Davranışlarının bağlı olduğu iki faktör söyleyin?
Cevap:
Genleri manipülasyon yoluyla değiştirilmiş organizmalara genetiği değiştirilmiş organizmalar veya transgenik organizmalar denir. Davranışlarının bağlı olduğu iki faktör şunlardır:
- ilgilenilen genin uygun şekilde yerleştirilmesi.
- İstenen ürünü üretmek için genetiği değiştirilmiş organizmaların uygun şekilde toplanması.
Soru 3.
“Biyopirasit” ile ne demek istiyorsunuz? Bir örnek verin?
Cevap:
Biyokorsanlık, biyo-kaynakların çok uluslu şirketler ve diğer kuruluşlar tarafından ilgili ülkelerden ve kişilerden uygun izinler alınmadan kullanılması anlamına gelir; Hindistan'da yetişen Basmati pirinci, kendine has lezzeti ve aroması ile ayırt edilir, ancak bir Amerikan şirketi, ABD patenti aracılığıyla Basmati'nin patent haklarını aldı.
2. PUC Biyoloji Biyoteknoloji: İlkeler ve Süreçler Beş İşaret Sorular ve Cevaplar
Soru 1.
Rekombinant DNA teknolojisi sürecini açıklar.
Cevap:
Genetik mühendisliği süreci:
(a) Genetik materyalin izolasyonu (DNA): Rekombinant DNA teknolojisinde, DNA'nın diğer makro moleküllerden arındırılmış saf halde izole edilmesi esastır. DNA molekülü hücrede zarla çevrili olduğundan, DNA'yı RNA, proteinler, polisakkaritler ve lipitler gibi diğer makromoleküllerle birlikte serbest bırakmak için hücreyi açmamız gerekir. Bu, bakteri hücrelerinde, bitki ve hayvan hücrelerinde belirli enzimlerle gerçekleştirilir.
Diğer makro moleküller, spesifik enzimlerle uygun muamele ile uzaklaştırılabilir. Son olarak, saflaştırılmış DNA molekülleri, soğutulmuş etanol ilavesinden sonra çökeltilir ve bu, süspansiyondaki ince ipliklerin toplanması olarak görülebilir.
(b) DNA'nın belirli yerlerde kesilmesi: İzole edilen saflaştırılmış DNA molekülü, restriksiyon endonükleaz adı verilen uygun bir enzim yardımıyla yapışkan uçlu segmentlere kesilir (parçalanır).
(c) Jel elektroforezi: Kesilen DNA parçaları, agaroz jel kullanılarak jel elektroforezi ile ayrılır. DNA negatif yüklü bir moleküldür, dolayısıyla pozitif elektrota (anot) doğru hareket eder.
(d) İlgilenilen Genin PCR kullanılarak amplifikasyonu: Gen amplifikasyonu, 'bir genin birçok kopyasını yapma süreci'dir. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) adı verilen bir teknik kullanılarak elde edilir.
PCR Prosedürü :
1. Amplifiye edilecek istenen segmentten DNA, iki primer molekülün fazlalığı, dört deoksiriboz trifosfat ve DNA polimeraz, yeterli miktarda Mg++ içeren bir eppendorf tüp içinde bir reaksiyon karışımında birlikte karıştırılır. Eppendorf tüp PCR ünitesine yerleştirilir ve sırasıyla aşağıdaki işlemler yapılır.
2. Denatürasyon: Reaksiyon karışımı önce 90 – 98°C (genellikle 94°C) arasında bir sıcaklığa tabi tutulur. Hidrojen bağlarının kırılması nedeniyle iki DNA zincirinin ayrılmasıyla sonuçlanır. Buna denatürasyon denir. Her DNA dizisi, DNA sentezi için bir şablon dizisi görevi görür. PCR'nin ilk döngüsünde bu adımın süresi genellikle 94°C'de 2 dakikadır.
3. Tavlama (tavlama=birleştirme): Karışım şimdi düşük bir sıcaklığa (40-60°C) soğutulur. Bu adım sırasında, bir DNA bölgesini tamamlayan iki oligonükleotit primeri, DNA zincirinin her 3 ucuna bir tavlanır (melezleşir). Tavlama adımının süresi, PCR'nin ilk ve sonraki döngüleri sırasında genellikle bir dakikadır.
4. Primer uzatma: Bu adım sırasında, taq DNA polimeraz enzimi, nükleotidleri ve DNA şablonlarını kullanarak primerleri uzatır. İki yeni DNA dizisi (5'te) sonlandırmak için iki primer birbirine doğru uzanır. Primer uzatma süresi 72°C'de genellikle 2 dakikadır. Amplifiye edilmiş parça, gerekirse daha fazla klonlama için Vector ile bağlanmak için kullanılabilir. Taq DNA polimeraz, çift sarmallı DNA'nın yüksek sıcaklıkla indüklenen denatürasyonu sırasında aktif kalır.
(e) Konakçıya rekombinant DNA eklenmesi:
1. Elektroporasyon: Bakteri hücresi, soğuk CaCl içeren bir çözeltiye yerleştirilir.2 çözelti, ardından aralıklı olarak 42°C'ye yerleştirildi. Bu, hücre zarında gözeneklerin gelişmesine neden olur. Şimdi rekombinant plazmit, konakçı hücreye göç eder ve bakteri hücresi dönüştürülür.
2. Mikroenjeksiyon: İstenilen bir genin bir hayvan hücresinin çekirdeğine mikro şırınga ile direkt olarak enjekte edilmesidir.
3. Biyolistik: Burada uygun bir bitki hücresi, DNA'yı hücreye sokmak için DNA ile kaplanmış yüksek hızlı altın veya tungsten mikropartikülleri (2-2 mm) ile bombardımana tutulur.
(f) Yabancı gen ürününün elde edilmesi:
- Transgen, uygun koşullar altında kendisini protein(ler) formunda ifade eder.
- Ürün(ler), uygun bir prosedür uygulanarak ortamdan ekstrakte edilebilir.
- Transgenik hücreler, transgen ürününü küçük bir ölçekte elde etmek için laboratuarda kültürlenebilir.
- Transgenik hücreler ayrıca, daha büyük biyokütle ve istenen ürünün üretilmesi için kullanılan ortamın bir taraftan boşaltıldığı ve diğer taraftan taze ortamın eklendiği sürekli bir kültür sisteminde kültürlenebilir/çoğaltılabilir.
- Biyoreaktörler, ticari ölçekte yeterli miktarlarda ilgilenilen ürünü elde etmek için büyük hacimli kültürü işlemek için kullanılır.
(g) Sonraki İşlemler: Bir biyoreaktörde oluşturulan ürünler, bitmiş ürün olarak pazarlamaya hazır olmadan önce bir dizi işlemden geçirilmelidir.
Yararlı ürünlerin geri kazanılması için kullanılan çeşitli işlemlere topluca sonraki işlem adı verilir. İşlemler, ürünün ayrılmasını ve saflaştırılmasını, uygun koruyucuların eklenmesini ve sıkı bir kalite kontrol testini vb. içerir. Bu tür formülasyonlar, ilaçlarda olduğu gibi sıkı klinik deneylerden geçmelidir. Bu kalite kontrol testleri ve klinik deneyler üründen ürüne değişiklik gösterir.
Soru 2.
Plazmid pBR322'yi diyagram yardımıyla açıklayın.
Cevap:
pBR-322, doğal bir plazmit ve F+ plazmitidir. Yaklaşık 4.3 kb boyutundadır. Bir ori bölgesi (replikasyonun orijini), iki antibiyotik direnç bölgesi, Ampisilin direnci (Amp r ) ve Tetrasiklin direnci (Tet r ) için seçilebilir belirteçleri olan bir plazmittir. Farklı bölgelerde yedi tanesi önemli olan on üç benzersiz siteye sahiptir. Benzersiz bir site, ECORI adı verilen özel bir kısıtlama enzimi (REN) tanıma sitesidir.
Bitkilerde ve hayvanlarda genleri klonlamak için vektörler, bitkilerde Agrobacterium tumefaciens'ten izole edilen Ti plazmitidir ve retrovirüs artık patojenik değildir ve geni hayvan hücrelerine vermek için kullanılır.
Not: İnsersiyonel inaktivasyon: Bir vektörün kodlama dizisine bir gen veya rekombinant DNA eklendiğinde, bir enzimden veya belirli bir karakterden sorumlu kodlama dizisi inaktive olur. Bu, Ekleme inaktivasyonu olarak bilinir.
Soru 3.
a) Jel elektroforezi nedir? Bu tekniği kullanarak DNA parçalarının nasıl ayrıldığını ve tespit edildiğini açıklayın.
b) Plazmitler nelerdir? İdeal bir plazmitin herhangi iki özelliğinden bahsedin.
Cevap:
(a) DNA'nın kısıtlama endonükleazları ile kesilmesi, DNA fragmanları ile sonuçlanır. Bu parçalar jel elektroforezi olarak bilinen bir teknikle ayrılabilir. DNA fragmanları negatif yüklü moleküller olduğundan, bir ortam/matris aracılığıyla bir elektrik alanı altında anoda doğru hareket etmeye zorlanarak ayrılabilirler.
Günümüzde en yaygın kullanılan matris, deniz otlarından elde edilen doğal bir polimer olan agarozdur. DNA fragmanları, agaroz jelin sağladığı eleme etkisi ile boyutlarına göre ayrılır (çözünür). Bu nedenle, parça boyutu ne kadar küçükse, o kadar uzağa hareket eder.
Ayrılan DNA parçaları, ancak DNA'nın etidyum bromür olarak bilinen bir bileşikle boyandıktan sonra UV radyasyonuna maruz bırakıldıktan sonra görselleştirilebilir (saf DNA parçalarını görünür ışıkta ve lekelenmeden göremezsiniz). UV ışığına maruz kalan etidyum bromür lekeli bir jelde parlak turuncu renkli DNA bantları görebilirsiniz.
Ayrılan DNA bantları, agaroz jelden kesilir ve jel parçasından özütlenir. Bu adım elüsyon olarak bilinir. Bu şekilde saflaştırılan DNA parçaları, klonlama vektörleri ile birleştirilerek rekombinant DNA'nın oluşturulmasında kullanılır.
(b) Bakterilerin sitoplazmasında bulunan küçük dairesel ve kromozom dışı çift sarmallı DNA moleküllerine plazmit denir. Kendilerini kopyalama gösterirler. 2 ila içerirler. 8 bin nitrojen baz çifti. Ayrıca antibiyotiğe dirençli genler ve bazı karakterlerin ifadesi için genler gibi bazı genler içerirler. Kısıtlama enzimleri kullanılarak belirli bölgelerde kesilebilirler ve bu plazmitlere istenen genler eklenebilir.
Kızdırma Boyaları™
DNA ve RNA Yükleme Boyaları, tüm ihtiyaçlarınızı karşılamak için birden fazla formatta sunulur ve aşağıdaki bileşenlerde varyasyonlara sahiptir:
Boyalar: Yükleme boyaları, şu anda hareket eden Bromophenol Blue'yu kullanır.
Migrasyon cephesini vurgulamak için 100bp (%2.5-3.0 agaroz) ve göç eden Xylene Cyanol FF (CianoBlue &ticari Yükleme Boyaları)
Daha yüksek moleküler ağırlıklı nükleik asitlerin çözülmesine yardımcı olmak için 800bp (%2.5-3.0 agaroz).
SDS: SDS deterjanı (sodyum dodesil sülfat), CleanAway &ticari Yükleme Boyalarında sağlanır ve bunların yüksek düzeyde DNA bağlayıcı proteinlere sahip DNA ile kullanılması önerilir. SDS, zayıf DNA göçünü, DNA'nın kuyulara yapışmasını veya bant kaymalarını önleyen DNA-protein etkileşimlerini ortadan kaldırır. Ek olarak, SDS işlemi uzun yapışkan uçların yeniden tavlanmasını ve yapay DNA bantlarının üretilmesini önler.
Ethidium Bromide: Ethidium Bromide'in faydaları, Glow & Trade Yükleme Boyaları'dır, yukarıda vurgulanmıştır, ancak etidyum bromür içermeyen yükleme boyalarımızın faydalarını isteyen araştırmacılar için, Univerasl Yükleme Boyalarımızı sunuyoruz.
Aşağıdaki tablo, yükleme boyalarında bulunan farklı boyaları ve SDS'yi vurgulamaktadır, ayrıca Kızdırma Boyaları ve ticareti etidyum bromür (Evrensel Boyalar) olmadan da mevcuttur.
Wizard® SV Gel ve PCR Temizleme Sistemi Kullanılarak Ethidium Bromide ve Buzağı Bağırsak Alkalin Fosfatazının Uzaklaştırılması
Etidyum bromür ve buzağı bağırsak alkalin fosfataz, Wizard® SV Gel ve PCR Clean-Up System kullanılarak DNA örneklerinden etkili bir şekilde çıkarıldı. Etidyum bromürün verim üzerinde hiçbir etkisi olmamıştır.
Tanıtım
Buzağı bağırsak alkalin fosfataz (CIAP) ve etidyum bromür gibi birçok yaygın laboratuvar reaktifi, aşağı akış DNA uygulamaları üzerinde zararlı etkilere sahip olabilir veya potansiyel sağlık tehlikeleri olabilir. CIAP enzimi, genellikle, yeniden bağlanmayı önlemek için vektör DNA fragmanlarını defosforile etmek için kullanılır. Bununla birlikte, ligasyondan önce CIAP'in çıkarılamaması, 5'akut fosfat grubunun ek DNA'dan çıkarılması nedeniyle verimliliği azaltabilir. Başarılı ligasyon, DNA fragmanlarından en az birinin bir 5'akut fosfat grubuna sahip olmasını gerektirdiğinden, defosforile edilmiş ek DNA artık defosforile edilmiş vektöre bağlanamaz ve fonksiyonel olarak reaksiyondan çıkarılır. CIAP gibi, DNA lekesi etidyum bromür, sonraki uygulamalara müdahale edebilir (1). Etidyum bromür de bilinen bir mutajendir ve özel kullanım ve imha prosedürleri gerektirir. Bu deneyler, CIAP ve etidyum bromürün, Wizard® SV Gel ve PCR Clean-Up Systems kullanılarak DNA saflaştırmasına müdahale edip etmeyeceğini ve bu reaktiflerin etkili bir şekilde çıkarılıp çıkarılmadığını belirlemek için yapıldı.
Yöntemler
Buzağı Bağırsak Alkalin Fosfatazının Uzaklaştırılması: Bir birim Buzağı Bağırsak Alkalin Fosfataz (Kat.# M1821) 50 mikrol 500 bp'lik bir PCR ürününe ilave edildi. CIAP içeren veya içermeyen PCR ürününün kopya örnekleri, Wizard® SV Gel ve PCR Clean-Up System kullanılarak veya fenol/kloroform ekstraksiyonu ve ardından etanol çökeltmesi ile saflaştırıldı. Wizard® Sistemi için DNA, 50 mikrol Nükleazsız Su (Cat.# P1193) ile ayrıştırılmıştır. Fenol/kloroform ekstraksiyonu ve etanol çökeltmesi için, DNA peleti 50&mikrol Nükleazsız Su içinde yeniden süspanse edildi. CIAP içermeyen saflaştırılmamış PCR ürünü, CIAP'li saflaştırılmamış PCR ürünü veya saflaştırılmış PCR ürünleri daha sonra pGEM®-T Easy Vector System (Cat.# A1360) kullanılarak pGEM®-T Easy Vector'e bağlandı. Saflaştırılmış PCR ürünlerinin ligasyonu, aşağıdaki bölümde açıklandığı gibi üç kopya halinde gerçekleştirilmiştir. pGEM®-T Kolay Vektör Sistemi Teknik Kılavuzu #TM042. Kimyasal olarak yetkin JM109 hücreleri, 2 & mikrol ligasyon reaksiyonu ile transforme edildi ve IPTG, X-gal ve 125 & mikrog/ml ampisilin içeren LB plakaları üzerine kaplandı. 37°C'de bir gecelik büyümeden sonra koloniler sayıldı. Açık mavi koloniler beyaz koloniler olarak sayıldı çünkü her iki tipin de insert DNA'ya sahip olduğu belirlendi.
Ethidium Bromür'ün Kaldırılması: Ayrı bir deneyde, 5 mikrol Ethidium Bromide (Kat.# H5041) ve 20 mikrol su, 25 mikrol 1 kb DNA Merdivenine (Kat.# G5711) ilave edildi. Her biri 50 & ul'lik iki kopya, aşağıdaki bölümde açıklandığı gibi Wizard ® SV Gel ve PCR Clean-Up System kullanılarak saflaştırıldı. Wizard ® SV Gel ve PCR Temizleme Sistemi Teknik Kılavuzu #TB308. Saflaştırmadan önce ve sonra 1 kb DNA Ladder'ın eşdeğer hacimleri %2 agaroz jel üzerinde ayrıldı ve bir UV transillüminatör üzerinde görselleştirildi. Jelin etidyum bromür ile boyanmasından önce ve sonra fotoğraflar çekildi.
Sonuçlar
Tablo 1, CIAP'in çıkarılmasının etkinliğini incelemek için tasarlanmış deneylerin sonuçlarını göstermektedir. Saflaştırılmış veya saflaştırılmamış PCR ürünleri, pGEM®-T Easy Vector'e bağlandı. Negatif kontrol olarak vektörlü ancak PCR ürünü olmayan bir ligasyon yapıldı ve pGEM®-T Easy Vector System ile sağlanan Kontrol Ekleme DNA'sı ligasyon için pozitif kontrol olarak kullanıldı. Ekli plazmit DNA'yı temsil eden beyaz kolonilerin sayısı, saflaştırılmamış PCR ürünleri ile saflaştırılmış PCR ürünleri ile karşılaştırıldığında, saflaştırma yönteminden bağımsız olarak önemli ölçüde daha düşüktür. Wizard® SV Gel ve PCR Clean-Up kullanılarak saflaştırılan PCR ürünlerinin ligasyonu, fenol/kloroform ekstraksiyonu ve etanol çökeltmesinden daha fazla koloniyle sonuçlandı, ancak ek içeren kolonilerin yüzdesi için karşılaştırılabilir sonuçlar verdi. Wizard® SV 96 PCR Clean-Up System (Cat.# A9340, veriler gösterilmemiştir) kullanılarak saflaştırılmış DNA ile benzer sonuçlar elde edilmiştir.
Tablo 1. Saflaştırılmamış veya Saflaştırılmış PCR Ürünlerinin Ligasyon Sonuçları.
Etidyum bromürün çıkarılmasını izlemek için, saflaştırılmış ve saflaştırılmamış 1 kb DNA Merdiveni, etidyum bromür boyamasından önce ve sonra bir agaroz jel üzerinde görselleştirildi. Boyamadan önce, saflaştırılmış 1 kb DNA Merdiveni için jel üzerinde, etidyum bromürün uzaklaştırıldığını gösteren hiçbir DNA bandı görülmez (bakınız Şekil 1, Panel A). DNA'nın varlığını doğrulamak için jel daha sonra etidyum bromür ile boyandı ve tekrar görselleştirildi. DNA parçaları açıkça görülebilir (bkz. Şekil 1, Panel B). Boyama yoğunlukları, saflaştırma öncesi ve sonrası DNA örnekleri için eşdeğerdir ve bu, DNA'nın etidyum bromür içeren çözeltilerden verimli bir şekilde geri kazanıldığını gösterir.Şekil 1. Saflaştırılmış ve saflaştırılmamış PCR ürünlerinin jel görüntüsü.
1 kb DNA Ladder'a etidyum bromür ilave edildi ve ardından Wizard® SV Gel ve PCR Clean-Up System ile saflaştırıldı. Panel A. Her şeride eşdeğer hacimde saflaştırılmamış merdiven (-) ve saflaştırılmış merdiven (+) yüklendi. Jel, etidyum bromür boyamasından önce 5 saniyelik bir maruz kalma süresiyle fotoğraflandı. Panel B. Panel A'da gösterilen agaroz jeli daha sonra etidyum bromür ile lekelendi ve 1/8 saniyelik bir maruz kalma süresi ile fotoğraflandı.
Çözüm
Wizard® SV Gel ve PCR Temizleme Sistemi, hem dana bağırsağı alkalin fosfatazını hem de etidyum bromürü DNA solüsyonlarından etkili bir şekilde uzaklaştırır. Bu sistemle saflaştırılan DNA, fenol/kloroform ekstraksiyonu ve etanol çökeltmesi ile saflaştırılan DNA'nınkiyle karşılaştırılabilir ligasyon verimliliği verdi. Wizard® SV Gel ve PCR Temizleme Sistemi, fenol/kloroform ekstraksiyonu ve etanol çökeltmesinden farklı olarak tehlikeli kimyasalların kullanımını içermez.
Topoizomeraz I inhibitörlerini incelemek için DNA gevşemesi ve bölünme deneyleri
Topoizomeraz I enziminin tarihi, bitki alkaloid kamptotesin (CPT) ile yakından iç içe geçmiştir. Bu antitümör ilaç, enzimin DNA parçalama özelliklerinin ve biyokimyasının çoğunun aydınlatılmasına önemli ölçüde katkıda bulunmuştur. Spesifik inhibitörlerin tanımlanması, esas olarak bu kovalent kompleksi stabilize etme kapasitelerine dayanmaktadır. İnhibitör yokluğunda, kovalent kompleks oldukça kararsızdır ve aktif enzimi ve yeniden bağlanmış DNA molekülünü sağlam çift sarmal ile yeniden oluşturmak için serbestçe ayrışır. Bu katalitik döngü, replikasyon ve transkripsiyon dahil olmak üzere hücrelerde DNA'nın tüm manipülasyonları sırasında DNA burulma stresini gidermek için gereklidir. Bu inhibitörleri tanımlamak ve etki mekanizmalarını karakterize etmek için çeşitli deneysel yaklaşımlar kullanılmıştır. Çoğu durumda, saflaştırılmış topoizomeraz I ve radyoaktif olarak etiketlenmiş bir DNA substratı kullanan in vitro testler, bu ilaçların zehirlenme etkilerini kanıtlamak için kullanılmıştır. Bu bölüm, topoizomeraz I inhibitörlerini karakterize etmek için sıklıkla kullanılan iki deneysel yaklaşıma odaklanmaktadır. Bu prosedürler temel olarak topoizomeraz I-hedefli ilaçlar üzerine kendi çalışmalarımızdan örneklerle gösterilmiştir.
Aşağı akış uygulamaları için plazmidinizdeki etidyum bromür ne kadar kötü? - Biyoloji
Agaroz jel elektroforezi, DNA parçalarını ayırmak ve analiz etmek için kullanılan bir yöntemdir. Bu yöntem, bir adım daha ileri götürülebilir, parçalar, akış aşağı uygulamalarda kullanım için jelden saflaştırılabilir. Çeşitli boyutlarda (70 bp 10 kb) yüksek kaliteli DNA fragmanları, %96'ya varan geri kazanım oranlarıyla Eppendorfs Perfectprep Jel Temizleme Kiti kullanılarak agaroz jellerden saflaştırılabilir. Çoğu uygulama inhibitörlere duyarlı olduğundan, izole edilmiş DNA'nın yüksek kalitede olması önemlidir. Klonlama, jel ile saflaştırılmış bir DNA parçasının kullanılabileceği yaygın bir aşağı akış uygulamasıdır ve başarılı klonlama, parçanın saflığının iyi bir göstergesidir. Bu uygulama, künt uçlu bir ligasyonda jel ile saflaştırılmış DNA'nın kullanımını gösterir.
Lambda DNA'nın 3.49 kb'lik bir PCR fragmanı, 1.68 kb'lik bir kör uçlu DNA fragmanı üretmek için EcoRV ile sindirildi. Klonlama vektörü, pUC19, Smal ile sindirildi ve küt uçlu doğrusallaştırılmış bir vektör elde edildi. DNA'yı sindirip bir agaroz jel üzerinde ayırdıktan sonra, parçayı ve doğrusallaştırılmış vektörü saflaştırmak için Perfectprep Jel Temizleme Kiti kullanıldı. Bunlar daha sonra üç kopya halinde gerçekleştirilen kör uçlu klonlama reaksiyonlarında ekleme ve vektör olarak kullanıldı. Tuz duyarlılığı nedeniyle, kör uçlu klonlama daha zordur ve bu şema jel ile saflaştırılmış DNA parçalarının klonlama kapasitesinin sıkı bir testidir.
pUC19, klonlama başarısının ilk ölçüsü olarak mavi/beyaz koloni taramasına izin veren lacZ genini içerir. Beyaz koloniler, lacZ geninin bozulduğunu ve klonlamanın başarılı olduğunu gösterir. Bu deneyde üretilen beyaz kolonilerin sayısına bağlı olarak, Eppendorf kiti ile saflaştırılmış DNA kullanılarak klonlamanın oldukça verimli olduğu kanıtlanmıştır. Beyaz kolonilerden izole edilen plazmit DNA üzerindeki müteakip kısıtlama sindirimleri, kolonilerin gerçekten doğru şekilde bağlanmış ek ve vektörü içerdiğini doğruladı (veriler gösterilmemiştir). Bu, agaroz jellerinden elde edilen DNA'nın hassas klonlama deneylerinde kullanılabileceğini göstermektedir.
Perfectprep Jel Temizleme Kiti (Eppendorf)
Eppendorf PCR Reaktifleri
Taq DNA Polimeraz
3.49 kb'lik bir Lambda DNA parçası, aşağıdaki PCR bileşenleri kullanılarak amplifiye edildi. Parantez içindeki sayılar, her reaksiyondaki bileşenin nihai konsantrasyonunu veya miktarını temsil eder.
10x Taq DNA Polimeraz Tamponu (1x)
25 mM MgCl2 (0,5 mm)
10 mM dNTP Karışımı (0.2 mM)
Taq DNA Polimeraz (0.05 U/l)
Şablon DNA (50 ng)
Primerler: 10 M JMF1 5-AAA-AAC-GTC-CGA-GAC-GAA-TG-3 (0,1 M) 10 M JMrev3.6 5-TCA-GCA-TCT-AGC-ATG-CAA-CC-3 (0,1 M) M) (Entegre DNA Teknolojileri) Lambda DNA, aşağıdaki döngü koşullarıyla bir Eppendorf Mastercycler gradyanı kullanılarak amplifiye edildi:
35 Döngü:
45 saniye boyunca 94C
20 saniye boyunca 70C
2 dakika için 72C
5 dakika için 72C
10C sonsuza kadar tutun
20 ml 3.49 kb PCR ürünü, 30 l'lik bir reaksiyonda 20 birim EcoRV ile 37°C'de iki saat inkübe edildi. Reaksiyon, 3 1 10x Jel Yükleme Tamponu eklenerek durduruldu ve daha sonra bir jel üzerine yüklendi. Klonlama için yeterli sayıda ek DNA elde etmek amacıyla bu reaksiyonların birçoğu gerçekleştirilmiştir.
10 g vektör pUC19, 25°C'de iki saat boyunca 40 l'lik bir reaksiyonda 40 birim Smal ile doğrusallaştırıldı.
EcoRV kısıtlama sindirmelerinin her birinin tüm reaksiyon hacmi (30 l), 2 l 10 mg/ml etidyum bromür içeren 100 ml %0.8 SeaKem LE agaroz jeli üzerinde yürütülmüştür. Jel, iki saat boyunca 120 V'de 1x TBE'de çalıştırıldı.
Lineerleştirilmiş vektörün bir yarısı (20 l), 2 ml 10 mg/ml etidyum br omid içeren 100 ml %0.8 SeaKem LE agaroz jeli üzerinde çalıştırıldı. Jel, 1x TBE'de 120 V'de 1.5 saat çalıştırıldı.
EcoRV fragmanları jelden çıkarıldı ve kullanılarak saflaştırıldı. Tüm numuneler, üretici protokolünde açıklandığı gibi 30 l'de ayrıştırıldı. DNA konsantrasyonları, A260 okumaları ile belirlendi.
Lineerleştirilmiş vektör DNA bandı jelden çıkarıldı ve Eppendorf Jel Temizleme Kiti ile saflaştırıldı ve 30 l'de ayrıştırıldı. DNA konsantrasyonu, A260 okumaları ile belirlendi.
Karides Alkali Fosfataz Tedavisi:
Doğrusallaştırılmış vektör, vektör uçlarının yeniden bağlanmasını önlemek için SAP ile işlendi. 3 1 vektör DNA numunesi, üretici protokolünde açıklandığı gibi, 30 l'lik bir reaksiyonda iki birim SAP, 1x SAP reaksiyon tamponu ve moleküler biyoloji dereceli su ile 37°C'de bir saat süreyle inkübe edildi. Daha sonra reaksiyon, on beş dakika boyunca 65°C'de inkübe edilerek enzim inaktive edildi.
Ligasyon reaksiyonları, 3:1'lik bir ekleme/vektör molar oranına dayalı olarak kuruldu. Bu oran aşağıdaki denkleme dayanmaktadır:
(insersiyon uzunluğu) (sindirilmiş plazmit ng) = plazmidin ligasyon uzunluğunda kullanılacak ek parçasının ng'si 1:1 molar oran = ng insert: ng plazmit
3:1 molar oran = 3 (ng insert) : 1 (ng plazmit)
Eppendorf Jel Temizleme Kiti ile saflaştırılmış ek ve vektör DNA kullanılarak üç reaksiyon gerçekleştirildi. 800 kohezif uç birimi (yaklaşık 6 Weiss birimi) T4 DNA ligaz ve %5 PEG 8000 içeren 25 1 reaksiyon, gece boyunca (15 saat) 14°C'de inkübe edildi. Bunu takiben, numuneler 65°C'de on beş dakika inkübe edilerek ligaz inaktive edildi.
Her bir ligasyon reaksiyonundan 2 İt TOP 10 yetkin hücrenin 50 l'sine ilave edildi ve hafifçe karıştırıldı. Bu hücreler otuz dakika buz üzerinde tutuldu ve daha sonra 42°C'de tam otuz saniye inkübe edildi ve tekrar buza yerleştirildi. Her hücre şişesine 250 ul SOD ortamı ilave edildi ve şişeler daha sonra yatay olarak 37°C'de 225 rpm'de bir saat süreyle inkübe edildi.
Her transformasyonun 10 İt ve 30 İt'i, 40 İt 40 mg/ml X-Gal ve 100 g/ml ampisilin içeren LB agar plakaları üzerine kaplandı. Plakalar gece boyunca 37°C'de inkübe edildi ve sabahları beyaz koloniler açısından kontrol edildi.
Şekil 1: 1.68 kb kör uçlu Lambda DNA fragmanının pUC19'a klonlanmasından üretilen kolonilerin mavi/beyaz taraması. 10 l dönüştürülmüş yetkin hücre kaplanmıştır. Bu ligasyondaki ek ve vektör, kullanılarak agarozdan saflaştırıldı. Bu plakadaki kolonilerin çoğunluğu beyazdır, bu kolonilerdeki vektörlerin ek içerdiğinin bir ön göstergesidir. Tartışma
Eppendorf Perfectprep Jel Temizleme Kiti kullanılarak izole edilen ekleme ve vektör DNA, zor bir klonlama stratejisi olan kör uçlu klonlamada kullanılabilir. Bu deneyde, üç denemenin tümü, kolonilerin çoğunluğunun rekombinant plazmit içerdiğini düşündüren yüksek bir beyaz koloni yüzdesi ile sonuçlandı. Bu kolonilerin dördünden elde edilen plazmit DNA, Eppendorf Perfectprep Plazmit Mini Kiti kullanılarak saflaştırıldı ve bu DNA üzerindeki müteakip kısıtlama sindirimleri, dört koloninin de doğru ek içeren plazmidi içerdiğini doğruladı (veriler gösterilmemiştir). Eppendorf Jel Temizleme Kiti ile saflaştırılan DNA, hassas bir klonlama prosedüründe iyi performans göstermiştir ve yapışkan uçlar içerenler gibi daha az zor klonlamada performansın daha da iyi olacağı varsayılmaktadır.
- Nükleik asitleri amplifiye etmek için Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) işleminin kullanımı, Roche Molecular'a ait 4683105 ve 4683202 numaralı ABD Patentleri kapsamındadır ve bir lisans gerektirir.
Kaynak:
Sayfa: Hepsi 1 2 3 4 5 6
İlgili biyoloji teknolojisi:
Bakteriyel Lipopolisakkarit, Plazmit DNA ile Kopürleşir: Hayvan Modelleri ve İnsan Gen Tedavisi İçin Etkiler
Kemirgenlerde gen tedavisi deneyleri sırasında, türetilen plazmit DNA'nın kas içi enjeksiyonları kullanılarak Escherichia koli, doza bağlı toksisite kaydettik. Bu gözlem, DNA örneklerinin olası kontaminantları için bir araştırma başlattı. DNA örneklerinde endotoksin biyoaktivitesini izlemek için oldukça spesifik ve hassas limulus amiposit lizat tahlilini (LAL) kullandık ve standarttan türetilen plazmit DNA'yı bulduk. E. koli Endotoksin veya lipopolisakkarit (LPA) ile yoğun şekilde kontamine olacak geleneksel DNA izolasyon protokollerini kullanan bakteri suşları. Standart DNA izolasyon prosedürleri, 500 μg/ml'ye kadar LPS'nin birlikte saflaştırılmasıyla sonuçlanır. LPS, sitokinlerin ve diğer inflamatuar mediatörlerin güçlü bir indükleyicisidir ve gen terapisinde çıplak DNA kullanımını karmaşık hale getirebilir. Endotoksinin plazmit DNA ile birlikte saflaştırılmasının da önemli etkileri vardır. laboratuvar ortamında transfeksiyon çalışmaları ve DNA'nın embriyolara mikroenjeksiyonu. Plazmid DNA'nın LPS kontaminasyonunu azaltmak için basit ve etkili bir protokol geliştirildi. Plazmid DNA izolasyonundan önce bozulmamış bakterilerin sferoplastlara dönüştürülmesi, lizozim ile inkübasyon, deterjan ile muamele n-oktil-p-d-tioglukopiranozit (OSPG) ve polimiksin-B (PMB) kromatografisi, 50 ng/ml'den az LPS içeren plazmit DNA'nın izolasyonuna izin verdi. Bu, geleneksel plazmid DNA saflaştırma yöntemleriyle karşılaştırıldığında, LPS kontaminasyonunda 10.000 kat azalmayı temsil eder, etidyum bromür gibi potansiyel olarak toksik reaktifleri önler ve daha yüksek bir plazmid DNA verimi üretir.
Gen terapisindeki birkaç yeni deney, bağışıklık tepkilerinin modülasyonuna odaklanmıştır. Bakteriyel lipopolisakkarit (LPS), gen immünoterapi çalışmalarının sonuçlarını karıştırabilen güçlü bir lenfosit mitojeni ve adjuvandır. Hazırlanan plazmit DNA E. koli standart tekniklerle LPS ile yüksek oranda kirlenmiştir. Burada, bakterilerin sferoplastlara dönüştürülmesi ve ardından iyonik olmayan bir deterjan ve polimiksin B kromatografisi ile işleme tabi tutulmasıyla DNA'dan LPS'yi çıkarmak için basit bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntemle hazırlanan DNA, esasen LPS içermez ve geleneksel olarak saflaştırılmış plazmit DNA'nın aksine, aşağıdakileri takiben spesifik olmayan bağışıklık aktivasyonu üretmez. canlıda Yönetim.
Nükleik Asit Numune Hazırlama Yöntemi
DNA ve RNA, bir hücre içinde genetik bilgiyi depolamak ve iletmek için kullanılan nükleik asit molekülleridir. Moleküler biyolojinin merkezi dogması, DNA'nın RNA'ya kopyalandığını ve daha sonra proteine çevrildiğini belirtir. Bu, gen ve protein ekspresyonuna basit bir bakış olsa da, DNA ve RNA'nın ilgili bir örnek için genomik, gen ekspresyonu ve hücresel düzenleme hakkında önemli bilgiler sağlayabileceğini göstermektedir. DNA ve RNA üzerinde analiz yapabilmek için genellikle bu molekülleri hücrelerden veya dokulardan çıkarmak gerekir.
Moleküler biyolojinin merkezi dogması.
Nükleik asitlerin ekstrakte edilmesi, saflaştırılması ve konsantre edilmesi için iyi bilinen birkaç yöntem mevcuttur. En uygun nükleik asit izolasyon yönteminin seçilmesi, başlangıç numunesi materyali, hedef nükleik asidin miktarı, boyutu ve stabilitesi ve ilgili nükleik asit için aşağı akış uygulaması dahil olmak üzere çeşitli faktörlere bağlıdır. Saflaştırma adımını takiben, alt uygulamalara geçmeden önce nükleik asit konsantrasyonunun, saflığının ve bütünlüğünün belirlenmesi genellikle gereklidir.
Ortak Nükleik Asit Numune Hazırlama Yöntemleri
|Sezyum Klorür Gradyanları||Filtre Sütunu Arıtma||Jel Ekstraksiyonu||Guadinidium İzotiyosiyanat Fenol Kloroform Ekstraksiyonu - Etanol Yağış||Iyon değiştirici reçine||Fenol Kloroform Ekstraksiyonu - Etanol Yağış||Boyut hariç tutma|
|için önerilir||plazmit DNA||DNA ve RNA > 200bp||DNA||RNA||DNA||RNA||DNA ve RNA|
|Artıları||Son derece saf DNA||Hızlı ve kolay||Hızlı ve kolay||Hacimce ölçeklenebilir: son derece saf RNA||Hacme göre ölçeklenebilir||Hacimce ölçeklenebilir: son derece saf RNA||Hızlı ve kolay|
|Eksileri||Pahalı aletler ve izole edilmiş plazmitten etidyum bromür ve sezyum klorürün çıkarılmasını gerektirir||Molekülleri kurtarmayabilir <200 bp||Potansiyel olarak düşük verimli agaroz kontaminasyonu, akış aşağı reaksiyonları engelleyebilir||Fenol tehlikelidir||Artık reçine aşağı akış reaksiyonlarını engelleyebilir||Fenol tehlikelidir||Potansiyel olarak düşük verim kusurlu boyut ayrımı|
DNA İzolasyonu
DNA Filtrasyon Sütunu
Filtre kolonu saflaştırması, memeli hücre kültürlerinden, bakterilerden ve mayanın yanı sıra bitki ve hayvan dokusundan DNA'yı saflaştırmak için kullanılabilir. Çözeltinin pH'ını ve tuzunu ayarlayarak, ilgili DNA, DNA'yı bir filtre kolonunun dibinde bulunan bir silika membrana bağlayarak hücresel kalıntılardan veya diğer istenmeyen kirleticilerden ayrılabilir. Bu, genomik ve plazmid DNA saflaştırması için popüler bir yöntemdir. Vakum ve santrifüj protokolleri mevcuttur. DNA membrana bağlandıktan sonra, RNA, proteinler ve lipidler gibi kirleticileri uzaklaştırmak için düşük ve yüksek sertlikte bir yıkamaya tabi tutulur. Saflaştırılmış DNA, bir elüsyon tamponu ile membrandan bir toplama tüpüne ayrıştırılır. Kullanılan elüsyon tamponunun hacmi, istenen plazmit veya DNA'nın nihai konsantrasyonuna bağlı olarak değiştirilebilir. Kurtarılan DNA, PCR ve Southern blot analizi ile kullanım için uygundur.
Geleneksel olarak, sezyum klorür gradyanları, plazmit DNA'yı genomik DNA'dan uzaklaştırmak için kullanıldı. Bu yöntem oldukça saf DNA sağlarken, zaman alıcıdır ve geri kazanılan plazmitten etidyum bromür ve sezyum klorürün çıkarılmasını gerektirir. Plazmit saflaştırma kitleri, DNA > 200 baz çiftinin saflaştırılması ve konsantrasyonu için daha hızlı ve daha verimli bir yol sağlar. DNA, silika bazlı zar üzerine adsorbe edilir ve RNA, protein ve diğer hücresel bileşenler yıkanır. Saflaştırılmış DNA daha sonra elüsyon tamponu kullanılarak ayrıştırılır ve floresan dizileme, hücre transfeksiyonu, elektroporasyon ve enzimatik kısıtlama ve modifikasyon için hemen mevcut bir formda geri kazanılır. Plazmit saflaştırma kitleri, çeşitli başlangıç numune türleri için Bio-Rad'den temin edilebilir.
Plazmid DNA Saflaştırma Seçim Kılavuzu
|Kit||DNA |
Teslim olmak
|Hazırlık |
Zaman
|Bakteri kültürü |
Yoğunluk veya Hacim
|arıtma |
Biçim
|bağlama |
Matris
|Büyüme |
medya
|Aurum ve ticaret plazmid mini||>20 &kupa||10 dk||12 OD'ye kadar |
&boğa ml*
|Vakum** |
ve döndürmek
|silika |
zar
|Standart|
|Kuantum Hazırlık ve mini hazırlık||>20 &kupa||15 dakika||1&ndash10 ml||Döndürmek||iki atomlu |
toprak
|zenginleştirilmiş |
veya standart
* (OD600 seyreltilmemiş kültür) x (ml olarak kültür hacmi) = OD & boğa ml. 1 OD600 yaklaşık 8 x 108 hücre/ml'ye eşdeğerdir.
** Aurum vakum manifoldunun kullanılması.
Iyon değiştirici reçine
Filtre kolon saflaştırmasına veya fenol/kloroform ekstraksiyonuna alternatif olarak, PCR kontaminasyonlarının kandan, kültürlenmiş hücrelerden ve bakterilerden uzaklaştırılması için tamponlu bir iyon değişim reçinesi kullanılabilir. InstaGene&trade Matrix, PCR amplifikasyonundan önce bir numuneden PCR inhibitörlerini çıkaran bir Chelex reçinesidir. Matrisin mevcudiyetinde kaynatılarak tek bir hücre parçalama aşaması yeterlidir. Bu mümkündür, çünkü matris, PCR amplifikasyon sürecine müdahale eden hücre liziz ürünlerini verimli bir şekilde emer. Matris daha sonra santrifüjleme ile topak haline getirilebilir ve süpernatant, akış aşağı PCR amplifikasyonu için kullanılabilir.
Fenol/Kloroform Ekstraksiyonu ve Etanol Yağış
Yüksek derecede saf DNA elde etmek için kullanılabilecek geleneksel bir DNA saflaştırma yöntemi, fenol/kloroform ekstraksiyonu ve ardından etanol çökeltmesidir. Bu yöntem, hayvan ve bitki dokularından, kültürlenmiş memeli hücrelerinden, bakteri ve maya hücrelerinden DNA'nın bir saatten kısa sürede çıkarılması için tasarlanmıştır. Sulu nükleik asit numunesi, eşit hacimde bir fenol:kloroform karışımı ile birleştirilir. Fenol, DNA'ya bağlı proteinleri ayrıştırırken, kloroform proteinleri ve lipidleri denatüre eder. Üç farklı faz oluşacaktır: sulu faz, interfaz ve organik faz. Bunlardan sulu faz DNA'yı içerirken, proteinler ve lipidler diğer iki fazda kalır. Sulu faz daha sonra DNA'yı çökeltmek için etanol ile işlenebilir. Çöken DNA daha sonra santrifüjleme ile topak haline getirilebilir ve akış aşağı reaksiyonlarda kullanım için tercih edilen bir tampon içinde çözülebilir. Fenol/kloroform ekstraksiyonu ve etanol çökeltme yöntemi kullanılarak saflaştırılan DNA, tipik olarak filtre kolonu saflaştırmasından geri kazanılan DNA'dan daha saftır. Geri kazanılan DNA, PCR ve Southern blot analizinde kullanım için uygundur.
Kerala Plus İki Botanik Bölüm Akıllı Sorular ve Cevaplar Bölüm 4 Biyoteknoloji İlkeleri ve Süreçleri
Artı İki Botanik Biyoteknoloji: İlkeler ve Süreçler Tek İşaret Sorular ve Cevaplar
Soru 1.
Genetik mühendisliğinde kullanılan Ti plazmitleri,
(a) Bacillus thuringiensis
(b) Agrobacterium tumefaciens
(c) Pseudomonas tumefaciens
(d) Bacillus subtilis
Cevap:
(b) Agrobacterium tumefaciens
Soru 2.
Hangisi biyoteknolojide moleküler makas olarak kabul edilir?
(a) Ters transkriptaz
(b) Kısıtlama endonükleazı
(c) Taq polimeraz
(d) Topoizomeraz
Cevap:
(b) Kısıtlama endonükleazı
Soru 3.
Jel elektroforezinde DNA bantlarını tanımlamak için kullanılan lekeyi adlandırın
Cevap:
etidyum bromür
Soru 4.
rDNA teknolojisinde alein DNA ve klonlama vektörü aynı Restriction endonükleaz enzimi tarafından kesilmiştir. Sebep ver.
Cevap:
Yabancı ve yabancı DNA'yı unutan yapışkan uçları kesmek için aynı restriksiyon enzimi kullanılmalıdır.
Soru 5.
DNA'yı bitkilere aktarmak için kullanılan en yaygın tekniği adlandırın.
Cevap:
Biyolistik veya gen tabancası
Soru 6.
Agrobacterium'un plazmidi,
(a) Ti plazmiti
(b) F1 plazmidi
(c) T plazmidi
(d) Sütun E1
Cevap:
(a) Ti plazmit
7. soru
Aşağıdakilerden hangisi bir restriksiyon endonükleaz değildir?
(a) EcoRI
(b) Hind III
(c) ben
(d) DNAz I
Cevap:
(d) DNAz I
Soru 8.
İstenilen DNA, önemli bir teknikle 1 milyar kopyaya yükseltilebilir. Adını sen koy.
Cevap:
Polimeraz Zincir Reaksiyonu
Soru 9.
Kısıtlama enzimindeki Kısıtlama şunları ifade eder:
(a) DNA'daki fosfodiester bağının enzim tarafından parçalanması
(b) DNA'nın sadece belirli bir pozisyonda kesilmesi
(c) Bakterilerde bakteriyofaj çoğalmasının önlenmesi
(D. Yukarıdakilerin hepsi
Cevap:
(c) Bakterilerde bakteriyofaj çoğalmasının önlenmesi
Soru 10.
PCR tekniğinde polimeraz enzimi yardımıyla nükleotidler şablon iplik üzerine tek tek eklenir. Hangi organizmadan izole edilir.
Cevap:
termos aquaticus
Soru 11.
Aşağıdakilerin yokluğunda bir rekombinant DNA molekülü üretilebilir:
(a) Kısıtlama endonükleazı
(b) DNA ligazı
(c) DNA parçaları
(d) E.coli
Cevap:
(d) E.coli
Soru 12.
Agaroz jel elektroforezinde DNA molekülleri aşağıdakilere göre ayrılır:
(a) Yalnızca şarj edin
(b) Yalnızca boyut
(c) Yük/boy oranı
(D. Yukarıdakilerin hepsi
Cevap:
(b) Yalnızca boyut
Soru 13.
Aşağıdaki bakterilerden hangisi restriksiyon endonükleaz kaynağı değildir?
(a) Haemophilus influenzae
(b) Esherichia coli
(c) Agrobacterium tumefaciens
(d) Bacillius amiloli
Cevap:
(a) Haemophilus influenzae
Soru 14.
Bir PCR reaksiyonunda aşağıdaki adımlardan hangisi Taq polimeraz tarafından katalize edilir?
(a) Şablon DNA'nın denatürasyonu
(b) DNA şablonuna primerlerin tavlanması
(c) Şablon DNA üzerindeki primer ucunun uzaması
(D. Yukarıdakilerin hepsi.
Cevap:
(c) Şablon DNA üzerindeki primer ucunun uzaması
Soru 15.
DNA'nın uçlarından nükleotitlerin çıkarılmasını katalize eden bir enzim:
(a) endonükleaz
(b) eksonükleaz
(c) DNA ligazı
(d) Hind-ll
Cevap:
(b) eksonükleaz
Soru 16.
Polimeraz Zincir Reaksiyonu yardımcı olur
(a) DNA sentezi
(b) DNA amplifikasyonu
(c) Protein sentezi
(d) Aminoasit sentezi
Cevap:
DNA sentezi
Soru 17.
Çift sarmallı DNA'dan başlamak, sıralama amacıyla büyük miktarlarda saf tek sarmallı DNA elde etmek için bir strateji önerir.
Cevap:
PCR (POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU)
Soru 18.
DNA'nın belirli noktalardan kesilmesi, 'moleküler makas' adı verilen ensimlerin keşfiyle mümkün oldu. Bu enzimi tanımlayın.
Cevap:
Kısıtlama enzimleri/Kısıtlama Endonükleazları
Soru 19.
İlk keşfedilen Restriksiyon Endonükleaz aşağıdakilerden hangisidir?
(a) Hintçe I
(b) Hintçe II
(c) EcoR I
(d) EcoR II
Cevap:
(b) Hind II
Soru 20.
Aşağıdaki çizimi inceleyiniz ve A ve B olarak gösterilen enzimleri bulunuz.
Cevap:
Soru 21.
DNA parçalarının ayrılması için kullanılan tekniği yazın.
Cevap:
Jel elektroforezi
22. soru
Jelden DNA moleküllerinin jel elektroforezinin son aşaması. Bu sürece ne denir?
Cevap:
elüsyon
23. soru
Verilen seçeneklerden biri PCR ile ilgili değildir. Bul onu.
(a) Denatürasyon
(b) Biriktirme
(c) Uzatma
(d) Tavlama
Cevap:
biriktirme
Soru 24.
Aşağıdakilerden hangisi gen transfer yöntemlerinden biri değildir?
(a) Mikroenjeksiyon
(b) Devre dışı bırakılmış patojen vektörleri
(c) Gen silahı
(d) Elüsyon
Cevap:
(d) Elüsyon
25. soru
Bitkilerde gen aktarımına uygun klonlama vektörü
(a) Ti plazmiti
(b) Bakteriyofajlar
(c) Virüsler
(d) Transpozonlar
Cevap:
(a) Ti Plazmit
26. soru
Aşağıdakilerden hangisi PBR-322'nin seçilebilir belirteçleridir.
(a) amp R , kan R
(b) tet R , kan R
(c) ampR, tetR
(d) chl R , tet R
Cevap:
ampR, tetR
27. soru
Kısıtlama Endonükleazlar, DNA'yı belirli yerlerde keserek ________
(a) Şeker-fosfat bağları
(b) Şeker-Azot baz bağları
(c) Hidrojen bağları
(d) Disülfit bağları
Cevap:
Şeker-fosfat bağı
28. soru
Aşağı akış işleme, rekombinant DNA teknolojisi sürecindeki son adımdır. "Aşağı akış işleme" ile ne anlıyorsunuz?
Cevap:
Gen ürününün ayrılması ve saflaştırılması.
Soru 29.
Ti plazmiti, bitkiler için uygun bir klonlama vektörüdür. _______ adlı bir bakterinin plazmitidir.
Cevap:
Agrobacterium tumifaciens.
Artı İki Botanik Biyoteknoloji: İlkeler ve Süreçler İki İşaretli Sorular ve Cevaplar
Soru 1.
Elüsyon, elektroforezin önemli bir adımıdır.
- Agaroz jel parçasından ayrılan DNA bantları kesilir ve çıkarılır.
- UV ışığı altında DNA bantları turuncu renkte gözlenir.
Soru 2.
Genetik mühendisliği, istenen genetik yapıya sahip yeni organizma oluşturmaya yardımcı olan gen manipülasyon tekniğidir.
- Stanley cohen ve Herbert Boyer'in genetik mühendisliğine katkılarını veriniz.
- DNA zincirini kesmek için kullanılan enzimi adlandırın?
- Herbert Boyer ve Stanley Cohen, 1972'de antibiyotik direncini kodlayan bir geni doğal bir Salmonella typhimurium plazmidi ile bağlayarak ilk rekombinant DNA'yı oluşturdular.
- kısıtlama endonükleaz
Soru 3.
Sivrisinekler, sıtma parazitini insan vücuduna aktaran vektörler olarak kabul edilir. Plazmitler biyoteknolojide Vektörler olarak kabul edilir. Savunmak.
Cevap:
Vektörler, materyalleri bir organizmadan diğerine aktaran ajanlardır. Plazmitler, bağımsız replikasyon yeteneğine sahip bakterilerde görülen ekstra kromozomal DNA'dır.
Biyoteknoloji alanında plazmitler, yabancı bir DNA'yı entegre ettikten sonra hızla çoğaldıkları için vektör olarak kullanılır. Böylece, plazmit aracılığıyla yabancı gen başka bir organizmaya dahil edilebilir.
Soru 4.
Eco R I, E.coli bakterilerinden elde edilen ve virüsün büyümesini kısıtlamalarına yardımcı olan restriksiyon endonükleaz enzimidir. Endonükleazları adlandırma kriterleri nelerdir?
Cevap:
EcoRI, Escherechia coli Ry 13 bakterisinin adından gelir. E cinsi temsil eder, co türleri temsil eder, 'R' suş adından türetilmiştir ve I enzimin izole edildiği sıradır.
Soru 5.
DNA parçalarının ayrılması ve izolasyonu, jel elektroforezi olarak bilinen bir teknikle yapılabilir.
- Ayrı DNA parçaları kullanılan prosedür nedir?
- Agaroz jelin izole edildiği organizmayı adlandırın
Cevap:
1. Negatif olarak değiştirilmiş DNA parçaları, agaroz matrisi aracılığıyla bir elektrik alanı altında anoda doğru hareket etmeye zorlanarak ayrılır.
DNA parçaları agaroz jelde boyutlarına göre ayrılır. Böylece parça boyutu küçüldükçe daha uzağa hareket eder. Daha sonra agaroz jelden elüsyon ile kesilir.
Soru 6.
PCR, ilgilenilen genin çoklu kopyalarını yapmak içindir.
- PCR ile ilgili ana adımı verin.
- Bu teknikte kullanılan termostabil DNA polimeraz enzimini adlandırın. Niye ya?
Cevap:
1. PCR'de yer alan ana adım:
- Denatürasyon – DNA zincirlerinin ayrılmasını içerir.
- Tavlama – Çift sarmallar, DNA polimerazın etkisiyle serbest nükleotidlerden sentezlenir.
- Uzatma – Gittikçe daha fazla nükleotidin eklenmesi sonucunda ipliklerin uzunluğu artar. Böylece DNA 1 milyar kopyaya kadar çoğaldı.
2. Taq polimaraz
PCR silindiri yüksek sıcaklıkta çalışır. Bu nedenle termostabil enzim kullanılır.
7. soru
r DNA teknolojisinde rekombinant DNA doğrudan bitki hücresine enjekte edilir
- Biolispics veya Gen tabancası.
- Bu, onları kalsiyum iyonları ile muamele ederek ve hücreleri ve rekombinant DNA'yı buz üzerinde inkübe ederek ve ardından 42°C'ye yerleştirerek yapılır. Sonra onları tekrar buza koyuyoruz. Bu, bakterilerin rekombinant DNA'yı almasına yardımcı olur.
Soru 8.
Genetik materyallerin izolasyonunda RNA kullanımı ise proteaz, selülaz vb. kullanılmaz.
- rDNA teknolojisi sürecinde ortaya çıkan zorlukları öğrenin.
- Biriktirme nedir?
- Yukarıda bahsedilen enzimler kullanılmadığı takdirde, yabancı gen izolasyonu için saf halde DNA elde etmek zordur.
- Soğutulmuş alkolden ayrılan ince DNA ipliği.
Soru 9.
Eksonükleazın eylemi endonükleazınkinden nasıl farklıdır?
Cevap:
Eksonükleaz, nükleotitleri DNA moleküllerinin uçlarından uzaklaştırırken, endonükleaz bir DNA molekülü içinde belirli bir pozisyonda kesilir.
Soru 10.
Sarma, r DNA teknolojisinde kullanılan önemli yöntemlerden biridir.
- DNA'nın ince iplikler olarak göründüğü ortamı adlandırın.
- Genetik materyalin izolasyonunda lizozim kullanılmasının amacı nedir?
Soru 11.
Yapışkan uçlar, restriksiyon endonükleaz enzimi kullanılarak elde edilen eşleşmemiş DNA iplikleridir.
Katılıyor musunuz? Sebep verin
Cevap:
Evet. Aynı kısıtlama enzimi, hem vektör DNA'yı hem de yabancı DNA'yı kesmek, DNA ligazının etkisini kolaylaştıran yapışkan uçlar elde etmek için kullanılır.
Soru 12.
Biyoteknoloji laboratuarında Ramu, r DNA'sı oluşturmakla ilgilendi, bunun için r DNA teknolojisinin araçlarını kullandı.
- DNA polimeraz enzimi kullanılmazsa ne olur?
- Restriksiyon enziminin etkisine maruz kalan DNA dizisini adlandırın
Soru 13.
3′ şablon ipliğin ucu polimeraz zincir reaksiyonunda çok önemlidir
- 3′ ucunun şablon dizisini ekleyen tamamlayıcı ipliği adlandırın
- Bu teknikte sağlanan nükleotidlerin türünü öğrenin
Soru 14.
r DNA teknolojisinde rekombinant DNA doğrudan bitki hücresine enjekte edilir
2. Gen transferi için yöntemler:
a. Bakteri, bakteri hücresini DNA'yı almaya yetkin yapan kalsiyum gibi iki değerlikli katyon ile muamele edilir (bakteri hücresinin gözenekleri genişler).
Rekombinant DNA, hücrelerin yeniden birleştirilmiş DNA ile buz üzerinde inkübe edilmesi, ardından ısı şoku (42YC) ve ardından tekrar buz üzerinde inkübe edilerek hücreye zorlanır. Bu, bakterilerin yeniden birleştirilmiş DNA'yı almasına yardımcı olur.
B. Altın veya tungstenin yüksek hızlı mikro parçacıkları DNA ile kaplanır ve hücreye bombardıman edilir. Bu yönteme biyolistik veya gen tabancası denir.
Soru 15.
Biyoteknolojide çalışan bir araştırmacı, çalışmasının bir parçası olarak büyük miktarlarda insülin üretmeye ihtiyaç duyuyor.
- Amaç için hangi enstrümanı seçecek?
- Enstrümandaki imkanlar nelerdir?
2. Bir biyoreaktör yaygın olarak bir karıştırma tipi kullanır. Reaktör içeriğinin karıştırılmasını kolaylaştıran bir karıştırıcılı silindirik tanktan oluşur. Ayrıca oksijen kullanılabilirliğini kolaylaştırır.
Bir biyoreaktörde bir karıştırıcı sistemi, bir oksijen dağıtım sistemi, sıcaklık kontrol sistemi, pH kontrol sistemi mevcuttur. Küçük hacimli ürünler periyodik olarak numune alma portlarından çıkarılır.
Soru 16.
DNA teknolojisinde genetik materyalin amplifikasyonu önemlidir, Böyle bir cihazda
- PCR için programlanmış silindirin çalışması yüksek sıcaklık gerektirir. Bu nedenle termostabil DNA polimeraz kullanılır
- Taq polimeraz
Soru 17.
Bitkilere istenilen genin aktarılmasında Agrobacterium yerine başka bakterilerin kullanılması zordur. Katılıyor musun? Nedenler verin.
Cevap:
Evet. Agrobacterium Ti plazmitine sahiptir, geni enfeksiyon yoluyla dikot bitkilere aktarma yeteneğine sahiptir. Bu nedenle gen transferinde yaygın olarak kullanılmaktadır.
Soru 18.
Bakteri kolonileri içeren besiyerine kromojenik substrat eklendiğinde, insersiyonel inaktivasyona tabi tutulur, bazıları mavi renkli, diğerleri beyaz renkli koloniler olarak görünür. Nedenler verin.
Cevap:
Koloniler mavi renkte görünür, eigengene sahip değildir, bunlar non-rekombinant olarak adlandırılırken, beyaz renkli koloniler yabancı gen insersiyonuna sahiptir, bunlar rekombinant olarak adlandırılır.
Mavi renk üretimi, beta-galaktosidaz enzimi ile kromojenik substrat arasındaki reaksiyondan kaynaklanırken, beyaz renkli kolonilerin substrat ile reaksiyona girecek enzimi yoktur.
Soru 19.
Salmonella, Ecoli vb. plazmitler içermesine rağmen PBR 322 genetik mühendisliğinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Niye ya?
Cevap:
Plazmit PBR 322, yapay klonlama vektörüdür, replikasyon orijini, seçilebilir işaretleyici, klonlama yerleri vb. gibi çeşitli özelliklere sahiptir. Yapay klonlama vektörünün bazı özellikleri doğal plazmitte bulunmaz. Bu nedenle PBR 322, genetik mühendisliğinde yaygın olarak kullanılmaktadır.
Soru 20.
Seçilebilir işaretleyici ile ne demek istediniz? 2 örnek verin.
Cevap:
Seçilebilir işaret, antibiyotiğe dirençli gendir. Örnekler ampisiline dirençli ve tetrasikline dirençli gendir.
Soru 21.
Genetik materyallerin izolasyonunda RNA as, proteaz, selülaz vb. kullanılmaz. rDNA teknolojisi sürecinde ortaya çıkan zorlukları öğrenin.
Cevap:
Yukarıda bahsedilen enzimler kullanılmadığı takdirde, yabancı gen izolasyonu için saf halde DNA elde etmek zordur.
22. soru
DNA hidrofilik bir molekül olduğundan hücre zarından geçemez. DNA bir Bakteri hücresine nasıl yerleştirilebilir?
Cevap:
Bakteriyel hücreler, DNA'yı almak için yetkin olmalıdır. Bu, onları kalsiyum iyonları ile muamele ederek ve hücreleri ve rekombinant DNA'yı buz üzerinde inkübe ederek ve ardından onları 42°C'ye yerleştirerek yapılır.ÖC Sonra tekrar buza koyun. Bu, bakterilerin rekombinant DNA'yı almasına yardımcı olur.
23. soru
Jel elektroforezinin altında yatan ilkeyi belirtin ve bu tekniğin biyoteknolojideki iki uygulamasından bahsedin.
Cevap:
Jel elektroforezinde moleküler ayırma, jel filtrasyonuna ve ayrıca ayrılan moleküllerin elektroforetik hareketliliğine dayanır. Makro moleküler ayırmanın en güçlü ve yine de uygun şekilde kullanılan yöntemleri arasındadır.
Soru 24.
Agrobacterium tumifaciens, klonlama vektörü olarak işlev görecek şekilde nasıl uygun şekilde modifiye edilmiştir?
Cevap:
Genler bakteri veya virüsten ökaryotik hücrelere aktarılır ve bu genler dönüştürülen hücreyi istedikleri gibi çalışmaya zorlar, örneğin: Agrobacterium aracılı gen transferi.
25. soru
Eksonükleazın eylemi endonükleazınkinden nasıl farklıdır?
Cevap:
Eksonükleaz, nükleotitleri DNA moleküllerinin uçlarından uzaklaştırırken, endonükleaz bir DNA molekülü içinde belirli bir pozisyonda kesilir.
26. soru
Bir agaroz jelde hareket eden DNA dizisinin boyutuna ve yüküne göre, klonlama için daha küçük olan fragman seçilir.
- Sindirilmiş ve sindirilmemiş parçaları ayırmak için kullanılan tekniği adlandırın
- Agaroz jelden saf DNA parçası elde etmek için kullanılan yöntem hangisidir?
27. soru
Selüloz enzimi neden genetik materyali bitki hücrelerinden izole etmek için kullanılır, ancak hayvan hücreleri için kullanılmaz?
Cevap:
Bitkilerde hücre duvarı varlığından dolayı selüloz kullanılırken hayvan hücresinde hücre duvarı yoktur.
28. soru
DNA'nın iki dizisindeki nükleotid dizisi aşağıdadır. Dizileri gözlemleyin ve önceki soruları yanıtlayın.
5' GAATTC 3'
3' CTTAAG 5'
- Böyle bir nükleotid dizilimi için kullanılan özel terimi adlandırın
- Bu belirli noktalarda çalışan/işleyen özel enzim türünü adlandırın
- GA dizisi arasında DNA'yı kesen enzimi adlandırın.
- Enzimin etkisinden sonra üretilen tek iplikçikleri adlandırın.
Soru 29.
DNA kesme enzimleri esas olarak prokaryotlardan izole edilir.
- Numara.
- Kısıtlayıcı endonükleazları yoktur. Ökaryotik hücreler, viral enfeksiyona, yani bağışıklık sistemine karşı başka savunma araçlarına sahiptir.
Soru 30.
Dönüştürme yeteneğine sahip mikroorganizmalara örnek veriniz.
Cevap:
Bir bakteri Agrobacterium tumefactions, normal bitki hücrelerini tümör hücresine dönüştürebilen ve bitkilerde karga tümörlerine neden olabilen Ti-plazmitinde T-DNA'ya sahiptir.
31. soru
'Geleneksel hibridizasyonun sınırlamalarından biri, arzu edilen genlerle birlikte istenmeyen genlerin dahil edilmesine ve çoğaltılmasına yol açmasıdır'. Genetik mühendisliği bu sınırlamaların üstesinden gelmeye nasıl yardımcı olur?
Cevap:
Bu yöntemde arzu edilen genler/yabancı gen kesilebilir ve plazmide dahil edilebilir ve böylece rekombinant DNA hazırlanır. Daha sonra hedef organizmaya verilir.
32. soru.
Jel içi elektroforezde saf DNA parçalarını görünür ışıkta ve boyama olmadan göremeyiz. DNA parçalarını görselleştirmenin nasıl mümkün olduğunu açıklayın?
Cevap:
DNA'nın Ethidium bromür ile boyanması, ardından UV radyasyonuna maruz bırakılması.
33. soru.
Aşağıda verilen şekil, genetik mühendisliğinde kullanılan önemli bir tekniktir.
Soru 34.
Aşağıdaki A ve B sütunlarını uygun şekilde eşleştirin
|A||B|
|ben. Jel elektroforezi||a. Sürekli mikroorganizma kültürü|
|ii. mikroenjeksiyon||B. genlerin amplifikasyonu|
|iii. Polimeraz zincirleme reaksiyonu||C. DNA parçalarının ayrılması|
|iv. biyoreaktör||NS. DNA parçalarının çökelmesi|
|e. Doğrudan gen transfer yöntemi|
|A||B|
|(ben)||(C)|
|(ii)||(e)|
|(iii)||(B)|
|(iv)||(a)|
35. soru
Aşağıda verilen bir klonlama vektörünün diyagramıdır.
Soru 36.
Her kısıtlama endonükleazı, DNA'daki spesifik bir palindromik nükleotid dizisini tanır.
- Palindrom, iki DNA molekülü zincirinde aynı şekilde okunan bir baz çiftleri dizisidir.
- 5′ GAATTC 3′
- 3′ CTTAAG 5′
37. soru.
Aşağıda, farklı hücre tiplerinden DNA moleküllerinin salınması için kullanılan bazı enzimler verilmiştir. Lizozim, kitinaz, selüloz. Bunları aşağıda verilen sütunlarda uygun şekilde düzenleyin.
Cevap:
|Bitki hücreleri||selülaz|
|bakteri hücreleri||lizozim|
|mantar hücreleri||kitinaz|
Soru 38.
Seçilmiş belirteçler, gen klonlaması sırasında dönüştürülmemiş hücreleri tanımlamamıza ve ortadan kaldırmamıza yardımcı olur. Beta-galaktosidaz enzimi geninin seçilebilir bir işaretleyici olarak nasıl çalıştığını açıklayın.
Cevap:
Beta-galaktosidaz enziminin kodlama dizisine rekombinant DNA eklendiğinde, enzim üretimi için gen çıkarılır, bu koloniler kromojenik substrat içeren yetiştirme ortamına aktarıldıktan sonra dönüştürülmeyen koloniler mavi renk verir, ancak dönüştürülmüş koloniler herhangi bir renk vermez. ekleme inaktivasyonu nedeniyle.
Soru 39.
Bakterileri plazmidi almaya zorlamak için önce bakteri hücrelerinin DNA'yı almaya "yetkin" hale getirilmesi gerekir. Bakteri hücresini DNA almaya yetkin hale getirmek için bir yöntem önerin.
Cevap:
İlk olarak, hücreye, DNA'nın hücre duvarındaki gözeneklerden bakteriye girme verimliliğini artıran kalsiyum gibi iki değerlikli katyon uygulayın. Daha sonra hücreyi rDNA ile buz üzerinde inkübe edin ve kısa bir süre 42°C'ye koyun ve ardından tekrar buza koyun.
Soru 40.
İlgilenilen genin çoklu kopyaları, DNA polimeraz enzimi kullanılarak in vitro sentezlenir.
- Yukarıdaki işlemin üç adımı hangileridir?
- Burada kullanılan DNA polimeraz enzimini öğrenin.
1. Yukarıdaki sürecin üç adımı:
2. Termostabil DNA polimeraz/Taq polimeraz.
41. soru
Biyoreaktörler, rekombinant proteinlerin büyük ölçekli üretimine yardımcı olur.
- Yaygın olarak kullanılan iki biyoreaktör hangileridir?
- Bir biyoreaktörde karıştırma mekanizmasının amacı nedir?
Karıştırıcı, içeriğin karıştırılmasını kolaylaştırır ve2 kullanılabilirlik.
42. soru.
Aşağıda verilen bir klonlama vektörünün diyagramıdır. Şemayı inceleyiniz ve aşağıdaki soruları cevaplayınız.
- Bu vektörün yapıldığı bakteriyi adlandırın?
- Resimde gösterilen 'ori' ve 'rop'un anlamları nelerdir?
- ekoli
- "ori" -kopyalamanın kökeni, "rop" replikasyonunun başladığı noktadır - plazmit replikasyonunda yer alan proteinleri kodlar.
43. soru.
Kısıtlama Endonükleazlar, DNA molekülünün kesilmesinden sorumlu enzimlerdir. Eco Rl türetilir.
Cevap:
1. Cinsinden ilk harf ve tür adından ikinci iki harf 'R' harfi türünden türetilmiştir Roma rakamı I keşif sırasını belirtir.
Artı İki Botanik Biyoteknoloji: İlkeler ve Süreçler Üç İşaretli Sorular ve Cevaplar
Soru 1.
Gen klonlamanın herhangi üç kullanımını yazın.
Cevap:
- Daha iyi çiftlik hayvanları üretmek için ilgili genler hayvanlara eklenebilir.
- İnsülin, hormonlar, interferonlar, vitaminler gibi istenen proteinler endüstriyel olarak bakterilerde üretilebilir.
- Gen klonlama ile rekombinant aşılar, geliştirilmiş antibiyotikler üretilebilir.
Soru 2.
- Süreci tanımlayın.
- (ii) ve (iii) adımlarında yer alan enzimleri tanımlayın
- EcoRI tarafından tanınan temel dizileri yazın
Cevap:
1. Rekombinant DNA teknolojisi.
2. Adımlarda yer alan enzimler:
3. EcoRI tarafından tanınan diziler:
Soru 3.
Bir geni bir hücreden diğerine aktarmak için kullanılan araçlara klonlama vektörü denir. PBR 322, yaygın olarak kullanılan bir klonlama vektörüdür.
- Bir klonlama vektörünün sahip olması gereken 2 önemli özelliği yazınız.
- Ori'nin önemi nedir?
- Replikasyon kaynağı Seçilebilir işaretleyici
- Çoğaltmanın kökeni, çoğaltmanın başladığı nokta.
Soru 4.
Stanley Cohen ve Hebert Boyer, plazmit ve antibiyotiğe dirençli gen kullanarak r DNA'sını oluşturdular.
- Kullanılan dilimleme ve ekleme enzimini adlandırın.
- Dilimleme enziminin rDNA teknolojisindeki önemi nedir?
Cevap:
1. Dilimleme enzimi – Kısıtlama endonükleazı Ekleme enzimi-DNA ligazı
2. rDNA teknolojisinde dilimleme enziminin önemi:
- DNA dizisi içinde kesmek için kullanılır.
- Hem vektör DNA'yı hem de yabancı DNA'yı kesmek için aynı kısıtlama enzimi kullanılır.
Soru 5.
A sütunundaki öğeleri B Sütunundaki öğelerle eşleştirin.
A B palindromik nükleotid dizisi DNA parçalarının ayrılması kısıtlama endonükleaz sentez gen ürünü Jel elektroforezi Rekombinant teknoloji aracı biyoreaktör 5′ – GAATTC- 3′, 3′ – CTTAAG- 5′ biyolistik vektör klonlama pBR322 Yabancı DNA'yı konakçıya sokma yöntemi A B palindromik nükleotid dizisi 5′ – GAATTC- 3′, 3′ – CTTAAG- 5‘ kısıtlama endonükleaz Rekombinant teknoloji aracı Jel elektroforezi DNA parçalarının ayrılması biyoreaktör sentez gen ürünü biyolistik Yabancı DNA'yı konakçıya sokma yöntemi PBR322 vektör klonlama
Soru 6.
Aşağıda, iki DNA zincirindeki nükleotid dizisi verilmiştir. İpleri gözlemleyin ve önceki soruları yanıtlayın
5' GAATTC 3'
3' CTTAAG 5'
- Böyle bir nükleotid dizilimi için kullanılan özel terimi adlandırın
- GA dizisi arasında DNA'yı kesen enzimi adlandırın.
- Enzimin etkisinden sonra oluşan tek iplikçikleri adlandırın.
7. soru
Aşağıda, rekombinant DNA teknolojisinin çeşitli adımları yer almaktadır. Bunları doğru sırayla düzenleyin.
i) Yabancı gen ürününün elde edilmesi
ii) PCR kullanılarak ilgili genin amplifikasyonu
iii) DNA'nın belirli lokasyonlarda kesilmesi
iv) Sonraki işlemler
v) Rekombinant DNA'nın konak hücreye/organizmaya eklenmesi
vi) Genetik materyalin izolasyonu
Cevap:
vi) Genetik materyalin izolasyonu
iii) DNA'nın belirli lokasyonlarda kesilmesi
ii) PCR kullanılarak ilgili genin amplifikasyonu Rekombinant DNA'nın konakçı hücre organizmasına eklenmesi
i) Yabancı gen ürününün elde edilmesi
iv) Sonraki işlemler
Artı İki Botanik Biyoteknoloji: İlkeler ve Süreçler NCERT Soruları ve Cevapları
Soru 1.
Öğrendiklerinizden enzimlerin mi daha büyük, DNA'nın mı moleküler boyutta daha büyük olduğunu söyleyebilir misiniz? Nasıl bildin?
Cevap:
DNA molekülleri, enzimlerin moleküler boyutuna kıyasla moleküler boyutta daha büyüktür. Çünkü DNA'nın gen denilen bölümünden bir enzim (protein) sentezlenir.
Soru 2.
Bir insan hücresindeki insan DNA'sının molar konsantrasyonu ne olurdu?
Cevap:
İnsanda DNA konsantrasyonu %0.4'tür. 6.6 × 109 bp içerir.
Soru 3.
Daha iyi havalandırma ve karıştırma özelliklerinin yanı sıra, karıştırmalı tank biyoreaktörlerinin çalkalama şişelerine göre başka hangi avantajları vardır?
Cevap:
Mikropları büyütmek ve istenen malzemeleri laboratuvarda küçük ölçekte karıştırmak için çalkalama şişeleri kullanılır. Ancak istenen biyoteknolojik ürünün büyük ölçekli üretimi, büyük karıştırmalı tank biyoreaktörleri gerektirir. Daha iyi havalandırma ve karıştırma özelliklerinin yanı sıra biyoreaktörler aşağıdaki avantajlara sahiptir:
- Oksijen dağıtım sistemine sahiptir.
- Köpük kontrolü, sıcaklık ve P^ kontrol sistemine sahiptir.
- Küçük hacimlerde kültür periyodik olarak geri çekilebilir.
Soru 4.
Ökaryotik hücrelerde kısıtlama endonükleazları var mı? Cevabınızı gerekçelendirin.
Cevap:
Hayır. Kısıtlama endonükleazları yoktur. Ökaryotik hücreler, viral enfeksiyona karşı başka savunma araçlarına, yani bağışıklık sistemine sahiptir.
Soru 5.
Mayozu hatırlayıp rekombinant DNA'nın hangi aşamada yapıldığını belirtebilir misiniz?
Cevap:
Faz I'in pachytene aşaması çaprazlanır.
Soru 6.
Seçilebilir bir işaretleyiciye ek olarak, yabancı DNA tarafından konakçı hücrelerin dönüşümünü izlemek için bir raportör enzimin nasıl kullanılabileceğini düşünebilir ve cevaplayabilir misiniz?
Cevap:
Raportör enzim, kromojenik substrat varlığında spesifik renk üretme yetenekleri temelinde rekombinantları rekombinant olmayanlardan ayırt edebilir. ArDNA, galaktosidaz enziminin kodlama dizisine eklenir.
Bu, insersiyonel inaktivasyon olarak adlandırılan enzimin inaktivasyonu ile sonuçlanır. Kromojenik bir substratın varlığı, bakterideki plazmidin bir ek içermemesi durumunda mavi renkli koloniler verir.
Ekin varlığı, galaktosidazın insersiyonel inaktivasyonu ile sonuçlanır ve koloniler herhangi bir renk üretmez. Bunlar rekombinant koloniler olarak tanımlanır.
Artı İki Botanik Biyoteknoloji: İlkeler ve Süreçler Çoktan Seçmeli Sorular ve Cevaplar
Soru 1.
Antibiyotik direnç geninin plazmit vektörü ile bağlanması,
(a) DNA ligazı
(b) Endonükleazlar
(c) DNA polimeraz
(d) Eksonükleazlar
Cevap:
(a) DNA ligazı
Soru 2.
İlk rekombinant DNA'nın yapımı, doğal plazmit kullanılarak yapıldı.
(a) E.coli
(b) Salmonella typhimurium
(c) Bacillus thuringiensis
(d) maya
Cevap:
(b) Salmonella typhimurium
Soru 3.
Aşağıdakilerden hangisi bitkilerde en iyi genetik vektör olarak kullanılır?
(a) Bacillus thuringiensis
(b) Agrobacterium tumefaciens
(c) Pseudomonas putida
(d) Yukarıdakilerin hiçbiri
Cevap:
(b) Agrobacterium tumefaciens
Soru 4.
Genetik mühendisliğinde plazmidi vektör yapan anahtar faktörlerden biri mi?
(a) Antibiyotiklere dirençlidir
(b) Restriksiyon enzimlerine dirençlidir.
(c) Yabancı gen taşıma özelliği vardır.
(d) Konakçıda enfeksiyona neden olma kabiliyetine sahiptir.
Cevap:
(c) Yabancı gen taşıma özelliği vardır.
Soru 5.
Bir klon
(a) aseksüel olarak elde edilen heterozigot
(b) eşeysiz olarak elde edilen homozigot
(c) cinsel yöntemlerle üretilen heterozigot
(d) cinsel yöntemlerle üretilen homozigot
Cevap:
(b) eşeysiz olarak elde edilen homozigot
Soru 6.
Rekombinant DNA tekniğinde vektör terimi,
(a) donör DNA tanımlanır ve eletroforez yoluyla alınır
(b) plazmit, DNA'yı canlı hücreye aktarır
(c) tüm genomun plazmit formunda toplanması
(d) enzim, DNA'yı belirli bölgelerde keser
Cevap:
(b) plazmit, DNA'yı canlı hücreye aktarır
7. soru
PCR sırasında DNA'nın amplifikasyonu için kullanılan enzim ticari olarak şuradan elde edilir:
(a) Streptococcus pyogenes
(b) Bacillus licheniformis
(c) Trichodermapallidum
(d) Thermusaquaticus
Cevap:
(d) Thermusaquaticus
Soru 8.
Kesilen DNA parçalarını tavlamak için kullanılan enzim
(a) DNA ligazı
(b) sarmal
(c) Topoizomeraz
(d) Polimeraz
Cevap:
(d) Polimeraz
Soru 9.
PCR erken teşhis amacına nasıl hizmet eder?
(a) Amplifikasyon yoluyla çok düşük miktarda DNA tespit ederek
(b) İnsan genetik bozukluklarını tanımlamak için güçlü bir tekniktir.
(c) Şüpheli kanser hastalarında mutasyonları saptamak için genler
(d) Yukarıdakilerin tümü
Cevap:
(d) Yukarıdakilerin tümü
Soru 10.
DNA replikasyonunda nükleotidlerin eklenmesinde kullanılan enzim
(a) katalaz
(b) DNA polimeraz
(c) nükleaz
(d) RNA polimeraz
Cevap:
(b) DNA polimeraz
Soru 11.
Restriksiyon endonükleaz enziminin önemi kesmektir.
(a) belirli bir bölgedeki RNA zincirleri
(b) belirli bölgedeki DNA zincirleri
(c) DNA zincirlerinin uçları
(d) yukarıdakilerin hiçbiri
Cevap:
(b) belirli bölgedeki DNA zincirleri
Soru 12.
Büyük miktarda rekombinant protein üretilir.
(a) doku kültürü
(b) biyoreaktör
(c) somatik hibridizasyon
(d) genetik mühendisliği
Cevap:
(b) biyoreaktör
Soru 13.
1 milyar DNA kopyası üretmek için replikasyon sürecinde polimeraz enzimi
(a) RNA polimeraz 1
(b) DNA polimeraz 1
(c) DNA polimeraz 11
(d) taq polimeraz
Cevap:
(d) taq polimeraz
Soru 14.
Sindirilmiş ve sindirilmemiş DNA parçaları elektroforez ile gözlemlenebilir.
(a) Etidyum bromür
(b) CFC
(c) Etidyum klorür
(d) asetil klorür
Cevap:
(a) Etidyum bromür
Soru 15.
DNA amplifikasyonunun hangi aşamasında DNA hibridizasyonu gerçekleşir
(a) denatürasyon
(b) uzatma
(c) tavlama
(d) uzama
Cevap:
(c) tavlama
Soru 16.
Agrobacterium'un plazimidi
(a) Ti plazmiti
(b) F1 plazmidi
(c) T plazmidi
(d) sütun E1
Cevap:
(a) Ti plazmiti
Soru 17.
Klonimg vektörünün ori'si şunu gösterir:
(a) klonlama alanı
(b) kısıtlama yeri
(c) çoğaltma yeri
(d) seçilebilir işaretçi bölgesi
Cevap:
(c) çoğaltma yeri
Soru 18.
Klonlama vektörünün seçilebilir belirteci önemli bir rol oynar.
(a) rekombinantların tanımlanması
(b) rekombinant olmayanların tanımlanması
(c) rekombinant olmayanlardan rekombinantların tanımlanması
(d) yukarıdakilerin hiçbiri
Cevap:
(c) rekombinant olmayanlardan rekombinantların tanımlanması
Soru 19.
Altın veya tungsten partikülünün DNA ile kaplanması
(a) doğrudan gen transferi
(b) dolaylı gen transferi
(c) hem doğrudan hem de dolaylı gen transferi
(d) yukarıdakilerin hiçbiri
Cevap:
(a) doğrudan gen transferi
Kerala Plus İki Botanik Bölümü Akıllı Sorular ve Cevaplar Bölüm 4 Biyoteknoloji İlkeleri ve Süreçleri'nin size yardımcı olacağını umuyoruz. Kerala Plus İki Botanik Bölüm Akıllı Sorular ve Cevaplar Bölüm 4 Biyoteknoloji İlkeleri ve Süreçleri ile ilgili herhangi bir sorunuz varsa, aşağıya bir yorum bırakın, en kısa sürede size geri döneceğiz.
Videoyu izle: Electrophoresis: How to Read Results (Haziran 2022).