This translation into Turkish was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages
1Albrecht-Kossel-Institute for Neuroregeneration, School of Medicine University of Rostock, 2Institute of Anatomy I, School of Medicine University of Jena
This article is a part ofJoVE General. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.Recommend JoVE to Your Librarian
Current Access Through Your IP Address
Current Access Through Your Registered Email Address
Luo, J., Yan, X., Lin, J., Rolfs, A. Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation. J. Vis. Exp. (65), e4078, doi:10.3791/4078 (2012).
Tavuk embriyo embriyonik gelişim sırasında gen fonksiyonu ve regülasyonu çalışmak için mükemmel bir model sistemi sağlar. Ovo elektroporasyon içinde güçlü bir aşırı-express ekzojen genlerin yöntemi veya tavuk embriyo 1 in vivo olarak endojen genlerin aşağı düzenlenmesi. DNA plazmid kodlama genleri 2-4, küçük müdahale RNA (siRNA) plazmidleri 5, küçük sentetik RNA oligos 6 ve morfolino antisens oligonükleotidler 7 gibi farklı yapılar kolaylıkla elektroporasyonla tavuk embriyosu transfekte edilebilir. Ancak, ovo elektroporasyon yılında uygulanması erken kuluçka evrelerinde (evre HH20 daha genç - Hamburg ve Hamilton göre) az embriyo ile sınırlıdır 8 ve sonraki aşamalarında embriyo yılında uygulama için bazı dezavantajları (evre HH22 büyük var - yaklaşık 3.5 kalkınma gün). Örneğin, daha sonraki aşamalarda vitellin membran usu olanshall membran yapışmış ve kabuk bir pencere açarak müttefiki embriyoların ölümle sonuçlanan, damarların yırtılması neden olur; eski embriyolar bu embriyolar erişmek ve işlemek için zordur vitellin ve allantoik damarları ile kaplıdır; eski embriyo hareket kabuk nispeten küçük bir pencereden yönü şiddetle kontrol etmek zordur ve olup.
Bu protokol; geç evrede (evre HH22 daha eski) az tavuk embriyosu gen transferi için bir ex ovo elektroporasyon yöntemi göstermektedir. Ex ovo elektroporasyon için, embriyolar Petri 9 kültüre ve vitellin ve allantoik damarları yaygın olarak yayılır. Bu koşullar altında, büyük tavuk embriyo kolayca erişilebilir ve manipüle edilmiştir. Bu nedenle, bu yöntem, daha eski tavuk embriyo uygulanan ovo elektroporasyon in bir sakıncaları ortadan kaldırmaktadır. Bu yöntemi kullanarak, plazmidler kolayca farklı bölüme transfekte edilebilirbüyük tavuk embriyo 10-12.
1. Ex ovo Kültürü
2. Ex ovo Elektroporasyon Hazırlık
3. Ex ovo Elektroporasyon Chicken Optik Tectum içine Gen Transferi
4. Temsilcisi Sonuçlar
Ex ovo elektroporasyon ile Cad7 ve GFP bir eksojen proteinleri başarılı bir şekilde aşırı ekspresyonu bir örnek olarak Şekil 1 'de gösterilmiştir. Plazmid GFP Cad7 plazmid birlikte E6 az tectum içine electroporated zaman, iki veya üç gün elektroporasyon sonra embriyolar toplanmış ve düzeltildi. E8 de, GFP proteini kuvvetli bütün resimler montaj (Şekil 1A-C) içinde tectum cinsinden ifade edilir. Ayrıca, E9 de tectum ilgili bölümlerin,GFP protein (Şekil 1D yeşil) ve Cad7 protein (Şekil 1E kırmızı) ex ovo elektroporasyon in vivo büyük tavuk embriyo gen transferi için başarılı bir yöntem olduğunu düşündürmektedir (Şekil 1F sarı) coexpressed vardır.
Şekil 1. Yi kodlayan plasmidin GFP ve Cad7 E6 azından tavuk tectum içine cotransfected zaman, iki ya da üç gün ex ovo elektroporasyon sonra GFP protein (yeşil) kuvvetli olarak E8 azından wholemount görüntü (AC) 'de gösterildiği ifade edilir. E9 azından tectum bölümleri içinde, GFP protein (D yeşil) ve Cad7 protein (E kırmızı) (F sarı) coexpressed vardır. BF, parlak alan görüntüsü. Ölçek çubuğu: AC için A 200 mikron; DF D 100 mikron.
Bu protokol ex ovo elektroporasyonla büyük tavuk embriyo (örneğin, E6 de optik tectum içine) gen transferi için bir kılavuz sağlar. Bu yöntem, büyük tavuk embriyo elektroporasyonla kullanılması uzanır ve kolay bir sonraki aşamada, in vivo gen fonksiyonu olarak incelemek için çok laboratuar uygulanabilir. E4 en az E7 için başarılı bir şekilde Embriyolar bu yöntem tarafından electroporated edilebilir ve electroporated embriyosu E15 11 kadar sağkalım olabilir. Beynin yanı sıra, bu yöntem ayrıca tavuk uzuv sistemi 11 içinde gen aktarımı için kullanılabilir.
Özel dikkat ex ovo elektroporasyon tarafından ödenmesi gerekmektedir. Küçük bir Petri kutularına E2.5 etrafında gerçekleştirilir çatlatma steril ve yumurta olmalıdır;. Örneğin, ex ovo kültürü ile embriyo yüksek hayatta kalma elde etmek için, kullanılan yumurta taze ve 12 de daha az bir hafta depolanmış ° C olmalıdır Ex ovo elektroporasyon için,boyutu ve elektrot yerleştirme doğru sahne ve embriyoların hedeflenen parçaya göre seçilmelidir. Iki plazmit cotransfected zaman, enjekte edilen plasmidler GFP işaretlenmiş hücreleri hemen hedef geni birlikte açığa vurabilir emin olmak için, uygun bir konsantrasyon oranı (örneğin, işaretleyici genin GFP ve hedeflenen geni arasındaki 1:08) olmalıdır.
Çıkar çatışması ilan etti.
Bu çalışma Alman Araştırma Vakfı (; LU1455/1-1 DFG) bir hibe ile desteklenmiştir.
|Name||Company||Catalog Number||Comments|
|Electroporator||Nepa Gene, Japan||CUY21-Edit|
|Electrodes||Nepa Gene, Japan||CUY661-3x7|
|Egg incubator||Ehret, Germany||BSS160|
|Embryo incubator||BINDER GmbH, Germany|
|Fluorescent microscope||Keyence, Deutschland GmbH||BZ-8000|
|Petri dish||Greiner Bio-One GmbH, Germany|
|Microelectrode puller||World Precision Instruments, Germany||PUL-100|