Ökaryotik ve prokaryotik hücrelerde hasar, mutasyon sıklığını artıran bir çeşit kimyasal ajan olan radyasyon ve mutajenler gibi çevresel faktörlerden kaynaklanır. Mutasyonların iki önemli kaynağı DNA replikasyonundaki yanlışlık ve genetik materyalindeki kimyasal hasarlardır. DNA onarım mekanizmaları, düzelterek okuma (proofreading) mekanizması yoluyla yanlış nükleotitlerin yanlış birleştirilmesi ile tamir etmeye çalışır, ancak bazı hatalar tespit edilmeden kaçar. Bazların kaybı gibi rastgele hasarlar değil, aynı zamanda doğal ve doğal olmayan kimyasallar ve radyasyon da DNA’nın omurgasını kırar ve kimyasal bazlar oluşturabilir. Basitçe söylemek gerekirse, replikasyondaki hatalar ve genetik materyalin çevreden zarar görmesi kaçınılmazdır. Replikasyon ve DNA hasarında iki hata sonucu vardır. Birincisi, elbette, DNA’daki kalıcı değişiklikler (mutasyonlar). İkinci sonuç ise DNA’daki bazı kimyasal değişikliklerin replikasyon ve transkripsiyon için bir şablon olarak kullanılmasını engellemesidir.
- Direkt Tamir Mekanizmaları
1. Fotoreaktivasyon
Fotoreaktivasyon, güneş ışığında ultraviyole (UV) dalga boylarının neden olduğu biyolojik hasardan geri kazanılan onarım sistemlerinden biridir. Foto-aktivasyonda, ultraviyole ışınlarının neden olduğu doğrudan pirimidin dimerlerinin, özellikle timin dimerinin (T<>T) oluşumu gözlenir (Figür 1). Ayrıca, pirimidinler pürinlerden on kat daha duyarlıdır ve bu nedenle birincil hasar alanlarıdır. Bu onarım tipi, insanlar dahil plasental memeliler hariç virüsler dahil tüm taksonomik sınıflarda bulunur.
Figür 1: Timin Dimer Oluşumu
1958’de, enerjiyi ışıktan yakalayan ve ışığı komşu pirimidinleri bağlayan kovalent bağları kırmak için kullanan DNA fotoliyaz enzimi Claud Rupert tarafından keşfedildi (Figür 2). Cold Spring Harbor ise UV ışığının bakteriler için öldürücü olduğu ve bakterilerin görünür ışığa maruz kaldığında ölü bakterileri hayata döndürmeyi başardı. Daha sonra Rupert, UV’nin bakterilerin DNA’larına zarar vererek öldürdüğünü ve DNA hasarını onarmak için görünür ışıkta mavi ışık enerjisi kullanan bir enzime (fotoliyaz) sahip olduğunu kanıtladı (1).
Figür 2: Fotoreaktivasyon Mekanizması
2. O6-Metilguanin Tamiri
Diğer bir direkt tamir mekanizması, metil grubunun metillenmiş baz O6-metilguaninden çıkarılmasıdır. Bu durumda metiltransferaz enzimi, O6-metilguanin üzerindeki metil grubunun enzim üzerindeki bir sistein kalıntısına transferini katalize eder, böylece DNA’daki normal G’yi (Guanin) geri yükler (2). (Figür 3).
Figür 3: Metil grubunun ayrılması
B) Baz eksizyon tamiri (BER)
Baz eksizyonunda, glikosilaz adı verilen bir enzim hasarlı bazı tanır ve ortadan kaldırır. Glikosilaz, bir AP bölgesinden (apurinik veya apirimidinik bölge) ayrılarak hasarlı bazın DNA omurgasından salınması için glikozidik bağı hidrolize eder. AP endonükleaz, AP omurgasının 5′ pozisyonunda DNA omurgasını kırarak 3′ OH bırakır; eksonükleaz, AP bölgesinin 3′ pozisyonunda keserek 5′-fosfat bırakır. Elde edilen boşluk DNA Pol I ile doldurulur ve DNA Ligaz ile yeni bir fosfodiester bağı oluşumu gerçekleştirilir (Figür 4).
Figür 4: Baz ekzisyon tamiri mekanizması
DNA glikosilazları DNA’yı tararken hasarlı bazları nasıl bulur ve tanır? Son çalışmalar, glikosilaz gibi bu enzimlerin, spesifik bir tür lezyon saptanana kadar DNA’nın küçük oluğu (minor groove) boyunca yanal olarak yayıldığını gösterdi. Eğer enzim DNA sarmalı içine gömülüyse, enzimin hasarlı baza nasıl etki edebileceğinin sırrına bakarsak? Cevap DNA’nın esnekliğinde gizlidir. X-ışını kristalografik çalışmaları, hasarlı bazın glikosilazın özgüllük cebinde yer aldığı çift sarmaldan uzağa fırlatıldığını ortaya koymaktadır. İlginç bir şekilde, düşük enerji kaybı nedeniyle, çift sarmal yapısında sadece bozulma ile bazın çevrilmesine izin verebilir. Ancak, bu enzimlerin hasarlı bazları taradığı mekanizma hala gizemini korumaktadır; çünkü, glikosilazların DNA ile birlikte yayıldıklarında anormallikleri kontrol etmek için her üssü ters çevirme olasılığı düşüktür (3).
C) Yanlış eşleşme eksizyon tamiri (MER)
Yanlış eşleşme onarım mekanizması, prokaryotlar ve ökaryotlarda oldukça farklılıklar içerir. Prokaryotlarda yanlış eşleşmeşler, Escherichia coli’de onarım proteini olan bir homodimer MutS tarafından tespit edilir. MutS, tüm DNA’yı tarar ve DNA omurgasındaki uyumsuzluğu bulur. Yani, MutS yanlış eşleşmeyi tespit etmek için DNA’yı kapsar ve ATPase aktivitesine ihtiyaç duyar. MutS ve yanlış eşleşme içeren DNA kompleksi, başka bir onarım proteini olan MutL’yi devreye sokar.
MutL, MutH’yi, uyumsuzluğun bulunduğu yere yakın bir iplikçikte bir nicke (kesik) neden olan bir enzim olarak aktive eder. Nicking (kesik) işleminden sonra, mekanizmaya MutU (UvrD) adı verilen spesifik bir helikaz ve üç ekzonükleaz dahil edilir. Helikaz DNA’yı çözer ve eksonükleaz, yer değiştirmiş tek iplikçik aşamalı olarak sindirilir, bu da yanlış eşleşmiş nükleotidin bulunduğu yere uzanır. Daha sonra, meydana gelen tek iplikli boşluk DNA Pol III ile doldurulur ve DNA Ligaz ile kapatılır.
Ökaryotik hücrelerde de yanlış eşleşme onarımı vardır, ancak prokaryotlarda gerçekleşen mekanizmadan bazı farklılıkları vardır. Memeli hücrelerinde, örneğin, baz-baz uyuşmazlıkları iki MutS homologundan biri olan MutSα (MSH2 / MSH6 heterodimeri) veya MutSβ (MSH2 / MSH3 heterodimeri) tarafından tanınır. MutSα esas olarak baz uyumsuzluklarına veya 3 nükleotit boyutuna kadar küçük eklemelere veya silmelere bağlanırken, MutSβ büyüklükleri 13 nükleotit boyutuna kadar büyük indellere (bazların eklenmesi veya silinmesi) bağlanır. Eksizyon aşamasında, MutSα veya MutSβ MutLα’yı devreye sokar ve tetramerik bir kompleks oluşturur. Ökaryotik hücreler, E. coli MutH’ye benzer bir protein express etmezler; bununla birlikte, ökaryotik MutLα’nın, hücre nükleer antijeninin (PCNA) çoğalmasıyla stokastik olarak (rastgele belirlenmiş olay dizisini içeren bir süreç) aktive edildiği düşünülen gizli bir endonükleaz vardır. Aktive edilmiş MutLα’nın her iki DNA ipliğinde çentikler oluşturabilmesine rağmen, DNA’ya bağlı PCNA’nın asimetrisinin, MutLα tarafından ortaya çıkan DNA şeridinin ipliğe spesifik insizyonunu yönlendirdiği düşünülmektedir. DNA insizyon aşamasından sonra, Exonuclease 1 (EXO1) MSH2 ve / veya MLH1 tarafından alınır ve aktive edilir, aktive edilmiş EXO1 yeni sentezlenen DNA zincirini eksize eder ve DNA eksizyon boşluğu (Polδ) ile doldurulur (tekrar sentezlenir). DNA yeniden sentezi tamamlandığında, kalan nick (kesik) DNA ligazı I ile bağlanır (Figür 5) (4).
Figür 5: Ökaryot MER mekanizması
D) Transkripsiyona kenetlenmiş tamir mekanizması (Tr-bağlı NER)
Nükleotid eksizyon onarımı sadece genom boyunca hasarı düzeltebilir, ancak ilerlemesi genin transkripsiyonlu (şablon) şeridinde bir lezyon varlığı ile durdurulan RNA polimerazı da kurtarabilir. Transkripsiyona bağlı onarım olarak bilinen bu fenomen, nükleotid eksizyon onarım proteinlerinin durmuş RNA polimerazına görevlendirilmesini içerir. Transkripsiyona bağlı onarımın önemi, aktif olarak transkripsiyon gösteren DNA üzerindeki onarım enzimlerine odaklanmasıdır. RNA polimeraz, hücredeki başka bir hasara duyarlı protein için çalışır. Ökaryotlarda transkripsiyon-bağlı onarımın merkezi, genel transkripsiyon faktörü TFIIH’dir (5). TFIIH, transkripsiyonun başlatılması sırasında DNA şablonunu açar. TFIIH alt birimleri, DNA sarmalı açma proteinleri XPA ve XPD’yi içerir. Bu nedenle, TFIIH iki farklı fonksiyondan sorumludur: helikazları transkripsiyona bağlı onarım sırasında bir lezyonun etrafında DNA’yı eritir ve ayrıca gen transkripsiyon işlemi sırasında DNA şablonunun açılmasına yardımcı olur (Figür 6). Prokaryotlarda onarımın transkripsiyona bağlanması için sistemler de mevcuttur (1).
Figür 6: NER ve Tr-bağlı NER mekanizmalarının karşılaştırılması
E) Serbest uçların homolog olmayan bağlanması tamiri (NHEJ)
En sitotoksik DNA hasar tipi DSB’dir (Double Strand Break). Oluşan hasar onarılmazsa, replikasyonu bloke etme ve kromozom kaybına neden olma gibi ciddi sonuçlar olabilir, ki bu da hücre ölümüne neden olur. Rekombinasyon bazlı DSB onarım mekanizması, kırık DNA moleküllerini onarmak için kardeş bir kromozomdaki DNA dizisi bilgisine bağlıdır. Bu onarım için etkili bir stratejidir çünkü kardeş kromozomu, orijinal dizinin önceden onarılması için bir şablon sağlar. Hala çoğaltılmamış bir kromozom kırıktan zarar görüyorsa, rekombinasyon bazlı DSB onarım yolunda bir şablon olarak hizmet etmek için hiçbir kardeş kromozomu mevcut değildir. Bu koşullar altında, homolog olmayan birleştirme veya NHEJ olarak bilinen alternatif bir DSB onarım sistemi devreye girer. Daha gelişmiş hücrelerde NHEJ, kırıkların onarıldığı ana yoldur. Şimdiye kadar, toplamda yedi NHEJ proteini tanımlanmıştır. Bu proteinler Ku70, Ku80, DNA-PKcs, Artemis, XRCC4, Cernunnos-XLF ve DNA ligaz IV’tür. Ana bileşenler Ku70 ve Ku80’dir. DNA uçlarına bağlanan ve bir protein kinaz olan DNA-PKcs’leri toplayan bir heterodimer oluştururlar (6). Sırayla, DNA-PKcs Artemis ile bir kompleks oluşturur. Artemis, hem 50 ila 30 ekzonükleaz hem de DNA-PKcs tarafından fosforilasyon ile aktive edilen gizli bir endonükleazdır. Daha sonra Ligaz IV, XRCC4 ve Cernunnos-XLF ile bir komplekste ligasyonu gerçekleştirir (Figür 7). NHEJ her hücrede fazlasıyla bulunur, ancak bakterilerde daha az görülür denebilir.
Figür 7: Serbest uçların homolog olmayan bağlanması mekanizması
DNA Tamir Mekanizmaları Karşılaştırması ve Önemli Farklar
Her DNA birçok endojen ve eksojen hasara maruz kalabilir. Saatte ~3×1017 DNA’nın hasar gördüğü tahmin edilmektedir! En sık karşılaşılan hasar tek iplikçik kopukluklarıdır (Single Strand Breaks) ve en sitotoksik ve daha az sıklıkla meydana gelen çift iplik kopuşlarıdır. Bu hasarlarla savaşmak ve onarmak için farklı onarım mekanizmaları vardır. Mekanizmalar arasındaki en belirgin ve en büyük fark enzimlerdir. Her mekanizmanın kendine özgü bir enzimi vardır ve her enzim kendi onarım mekanizmasına özgüdür (3).
Tablo 1: DNA tamir mekanizmaları ve enzimleri
Temel olarak, onarım sistemleri doğrudan ve doğrudan olmayan olarak ikiye ayrılır. Doğrudan DNA hasarı, baz delesyonları ve ayrıca tek ve çift zincirli kopmalar şeklinde ortaya çıkar. Doğrudan olmayan hasarlar radyasyon, serbest radikaller üreten ve daha sonra DNA’ya zarar veren su moleküllerini iyonlaştırdığında ortaya çıkar.
Mekanizmalar arasındaki farklılıklara ayrıntılı olarak bakarsak, Metiltransferazın bir onarım enzimi olarak bir handikabı vardır ve hücre için pahalıya mal olur. Metiltransferaz, diğer tamir enzimleri gibi katalitik olmadığından; bir kere bir metil grubunu kabul ettikten sonra tekrar kullanılamaz (2). DNA glikosilazı diğerlerinden ayıran en önemli özellik ise lezyona özgü olmasıdır. Bu nedenle hücrelerin farklı spesifikliklere sahip birden fazla DNA glikosilazı vardır. İnsan hücrelerinde toplam 11 farklı DNA glikosilazı tanımlanmıştır.
DNA kendini onardığı sırada aynı zamanda çoğalması gerekir; fakat hasarlı bir baz DNA replikasyonu öncesinde baz eksizyonu ile çıkarılmazsa ne olur? Lezyon mutasyona neden olabilir mi? Cevap, fail-safe sistemi ile açıklanabilir. İlginç bir şekilde, fail-safe sistem, G’nin karşısından T’yi kaldıran bir glikosilazdır. Böyle bir T:G uyuşmazlığı, omurgalıların DNA’sında sıklıkla meydana gelen 5-metilsitozinin kendiliğinden deaminasyonu ile ortaya çıkabilir. Peki hücre hangisinin yanlış baz olduğunu nasıl anlayabilir? Glikosilaz sistemi, bir T:G uyuşmazlığındaki T’nin 5-metilsitozinin deaminasyonundan kaynaklandığını varsayar ve T’yi bir C ile değiştirilebilecek şekilde seçici olarak uzaklaştırır (3,4). Ayrıca, yanlış eşleşme onarım sistemi iki zorlukla karşı karşıyadır. Her şeyden önce, yanış eşleşmeleri bulmak için DNA’yı taraması gerekir. Uyuşmazlıklar geçici olduğundan uyuşmazlıklar hızlı bir şekilde bulmak ve onarmak zorundadır. İkincisi, mekanizma doğru ve hassas onarım yapmalıdır; yani, baz eksizyon onarımını uyumsuzluk sisteminden ayıran önemli bir fark olan, parental sentezindeki doğru nükleotidi değil, yeni sentezlenmiş iplikteki yanlış bağlanmış nükleotidin yerini almalıdır.
Ayrıca ökaryotlarda farklı spesifisitelere sahip çoklu MutS benzeri proteinler bulunur. Örneğin, biri basit uyumsuzluklara özgüdür, diğeri ise DNA replikasyonu sırasında “kayma” dan kaynaklanan küçük eklemeleri veya silmeleri tanır. Son çalışmalar, yanlış eşleşme onarımının yüksek organizmalarda kritik bir rol oynadığını göstermiştir. Çünkü, MutS’nin (özellikle MSH2) ve MutL’nin insan homologlarının genlerindeki mutasyona bağlı olan kolon kanserine genetik bir yatkınlık vardır.
BER ve NER onarım sistemi arasındaki asıl fark, aksine, baz eksizyon onarımının, nükleotit eksizyon onarım enzimlerinin herhangi bir özel lezyonu tanımamasıdır. Aksine, bu sistem timin dimerinin neden olduğu gibi çift sarmalın şeklindeki bozulmaları tanıyarak çalışır.
DNA Tamir Mekanizmalarından Hangisi İnsan Sağlığında Daha Çok Etkilidir?
Çift zincirli kopmaların hücrelerdeki en sitotoksik ve tehlikeli hasar türü olduğu açıktır; bu durum NHEJ onarım sisteminin yaşamsal öneme sahip olduğunu anlamayı sağlar. İlginç bir şekilde NHEJ, tamamen normal hücre içi kaynaklı uyarlanabilir bağışıklık sürecinde de kullanılır. Bağışıklık sistemi, hafif ve ağır polipeptit zincirlerinden oluşan çeşitli bir grup antikor molekülü üretir. İmmünoglobulin genleri, fonksiyonel bir gen oluşturmak için somatik rekombinasyon veya V (D) J Rekombinasyonu adı verilen bir işlemle bir araya gelen ayrı DNA segmentlerinden oluşur. Ağır zincir genlerinde, değişken (V), bir çeşitlilik (D) ve birleştirme (J) gen segmenti olmak üzere üç gen segmenti vardır. Hafif zincir genleri, V ve J segmentleri olarak sadece iki gen segmentidir. Rekombinasyona tabi tutulabilen gen segmentleri, komşu rekombinasyon sinyal dizisi veya RSS motifleri olarak adlandırılan belirli dizilim motiflerine sahiptir. Rekombinasyon aktivatör genleri RAG1 ve RAG2’nin ürünlerini içeren bir protein kompleksi spesifik olarak RSS motiflerine bağlanır. Örneğin, bir V gen segmentinin ve bir J gen segmentinin kuşatılması, kuşatıcı RSS motiflerinin RAG protein komplekslerinin bağlandığı bireysel gen segmentleri, her gen lokusunda bulunan birçok kopyadan rastgele seçilir. RAG protein kompleksleri, yeniden birleştirilecek olan gen segmentlerini bir araya getirir ve DNA’yı tam olarak gen segmentinin birleşme noktasında klivaj eder ve RAG protein kompleksleri bitişik RSS motifidir (7). Bölünme, gen segmentlerinin sonunda bir DNA saç tokası ve RSS motiflerinin uçlarında çift iplikli kopmalar oluşturur. Ek proteinler DNA-PK, Ku, Artemis ve bir DNA ligaz ve XRCC4 dimeri (NHEJ bileşenleri) RAG proteinleri ile büyük bir komplekse dahil edilir. Bu RSS uçları, rekombinasyon işleminde daha fazla rol oynamayan kapalı bir DNA çemberi oluşturmak için sinyal eklemi olarak adlandırılan şeyi oluşturarak birleştirilir. Gen segmentlerinin uçlarındaki DNA saç tokaları daha sonra ek bir enzim parçalanır Terminal deoksinükleotidil transferaz (TdT) alınır ve DNA ipliklerinin uçlarına ilave nükleotitler ekler. Kompleks içindeki diğer enzimler, rekombinasyon işlemini tamamlayan gen segmentlerinin iki ucunu birbirine bağlar (6) (Figür 8).
NHEJ ayrıca T hücresi reseptörleri adı verilen ek bir immünolojik polipeptit kategorisinin üretimini yöneten ikinci V (D) J rekombinasyon örneğine katılır. NHEJ’nin insan biyolojisindeki önemini anlamak, iyonlaştırıcı radyasyona ve DNA’ya zarar veren ajanlara aşırı duyarlılık ve kusurlu V (D) J rekombinasyonuna atfedilen immün yetmezlik ile karakterize edilen nadir görülen kalıtsal sendromlardır. Açıkçası, bu sendromu gösteren hastalar, NHEJ mekanizmasının Artemis, Ligase IV veya Cernunnos-XLF parçaları için genlerinde mutasyonlar barındırır (6).
Figür 8: Bu figür, tam bir V-D-J eksonu oluşturmak için bir V gen segmenti ile yeniden düzenlenmiş bir DJ gen segmenti arasında meydana gelen bir V (D) J rekombinasyon olayının bir örneğini gösterir.
REFERANSLAR
- Aziz Sancar, Mechanisms of DNA Repair by Photolyase and Excision Nuclease (Nobel Lecture), 2016
- Fang Qi, Zhiqi Yin1, Guangping Wang, Sanwu Zeng, Clinical and Prognostic Significance of O6-Methylguanine-DNA Methyltransferase Promoter Methylation in Patients with Melanoma: A Systematic Meta-Analysis, 2018.
- Nicholas C. Bauer, Anita H. Corbett, and Paul W. Doetsch, The current state of eukaryotic DNA base damage and repair, 30 October 2015.
- Thomas A. Kunke and Dorothy A. Erie, Eukaryotic Mismatch Repair concerning DNA Replication, 2015.
- Ogun Adebali, Aziz Sancar, and Christopher P. Selby, Mfd translocase is necessary and sufficient for transcription-coupled repair in Escherichia coli (2017)
- Howard H. Y. Chang, Nicholas R. Pannunzio, Noritaka Adachi, Michael R. Lieber, Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair, 2017 August
- Rahul Arya and Craig H. Bassing V(D)J Recombination Exploits DNA Damage Responses to Promote Immunity, 2017.
YAZAR:
- Kahraman Küpcük