Pasteur, 1854’te profesör oldu ve Lille’de yeni açılan Fen Fakültesinin dekanlığına atandı. Pancar suyundaki alkolün neden uzun süre dayanmayıp bozulduğunu öğrenmek isteyen Lille’li bir sanayicinin talebi üzerine, mayalanma konusunu incelemeye girişti. O dönemde, Alman kimyacı Justus vonLiebig, mayalanmaların, oksijenin bulunduğu ortamlarda koyulan alkolden ileri gelen kimyasal tepkimeler (asetik mayalanma) olduğunu düşünüyordu. Moleküllerde simetri bozukluğu üzerine, Pasteur’den önce yapılmış olan çalışmalar, onu, mayalanmayı sadece basit bir kimyasal tepkime değil, aslında, canlılığa özgü bir olay olarak düşünüp ele almaya yöneltti: amilik alkol (şekerin mayalanmasından meydana gelen alkol) simetri bozukluğu gösteren bir organik moleküldü. Kimyasal mayalanma kuramına göre, maya mantarları, albüminli maddeler içerdikleri için oluşmaktaydılar. Pasteur, maya mantarlarının alkol şekerindeki mayalanmalardaki özel rollerini kanıtladı ve onların yaşayan mikroorganizmalar olarak özel karakterlerini ortaya koydu.
Pasteur, Bilimler Akademisi’ne girebilmesinin olmazsa olmaz koşulunu 1857’de gerçekleştirdi ve Paris’e yerleşti. Yüksek Öğretmen Okulu’nda fen bölümü müdür yardımcılığına atandı. Başkente gelişinden hemen sonra sirke ve şarap konularını incelemeye başladı. 1859 yılında, sütte de mayalanmanın söz konusu olduğunu ve bu olayın, mayalanmanın gerçekleşmesi için vazgeçilmez olduğu varsayılan albümini temin eden amonyum iyonunun Hjj bulunmadığı hallerde dahi gerçekleştiğini kanıtladı. Havanın bulunmadığı koşullarda gerçekleşen bazı mayalanmaları (alkolik, laktik veya bütirik) gözlemleyerek, oksijen bulunmasının zorunlu bir koşul olmadığım ortaya koydu. Yürüttüğü çalışmalar sonucunda, ta eski çağlardan beri genel kabul görmüş olan kendiliğinden üreme düşüncesini çürüteceği araçları aynı yıl içersinde bulup ortaya koydu.
Pasteur, 1860 yılında, kızgın bir havayla temas ettirilerek kaynatılan mayalanabilir bir sıvının, ancak içinde bulunduğu şişenin boğazına pamuk tozları içeren bir tıkaç yerleştirilmesi halinde mayalanabildiğini gösterdi. Böylelikle, 1858 yılında yayımladığı bir bildiriyle, maya mantarlarının kendiliklerinden ürediklerini kanıtlayabileceğini ileri süren Fransız hekim Felix Archimede Pouchet’ye de karşı çıktı. Çok hararetli geçen tartışmalar basına da geniş ölçüde yansıdı; çünkü bu soru, bütün bir kuşağın üzerinde yetiştiği felsefi temelleri sarsıyordu ve nitekim, Bilimler Akademisi, bu konuyu 1860 yılında giriş sınavları programına aldı. Pasteur, 1862 yılında tek aday olarak, «Atmosferde Mevcut Canlı Cisimcikler» (Corpuscules organises quiexistent dans la atmosphere) üzerine yaptığı çalışmayla bu sınavı kazandı. Burada, her türlü canlının üremesinin başlangıcında zorunlu olarak bir tohumun bulunduğunu kanıtlıyor ve kendiliğinden üreme olasılığını kökten çürütüyordu. 1860 yılında tamamladığı deneylerinde, Balard laboratuvarında geliştirdiği kuğu boyunlu denilen kıvrık ağızlı cam kapları kullanmıştı: Uzun ve kıvrık bir tüp şeklindeki ağızda ilerlerken genişleyen hava, giderek tüm tozlarından arınıyor ve bu koşullar altında da mayalanma gerçekleşmiyordu. Pasteur’ün, 1862 yılında Bilimler Akademisi’ne girmesi, tartışmaların sona ermesine yetmedi; çünkü kendiliğinden üremenin olanaksızlığını ancak bir laboratuvarın alışılagelmiş koşulları ve ortamı içerisinde kanıtlayabilmişti. Bunun üzerine, Pasteur, Pouchet ile yaptığı bilimsel tartışmayı sona erdirmek için, aralarında Jean Baptiste Dumas’nın ve A. J. Balard’ın da bulunacakları bir bilim komisyonu kurulmasını istedi. Komisyon, Pasteur’ün haklılığına karar verince, Londra’daki University of College’ın profesörlerinden biri olan Henry Charlton Bastion, 1876’da bilimsel bir makale yayımlayarak yeniden saldırıya geçti: ona göre, kaynatılmış potasla karıştırılan kaynatılmış sidik bulanıklaşıyordu. Bunun üzerine, deneyi yeniden ele alan Pasteur, Bastian’ın deneylerinin ne doğru araçlarla, ne de doğru kaynama ısısında yapılmadıklarını kanıtladı.
Bu arada, Pasteur, bir yandan da Ulusal Güzel Sanatlar Okulu’nun kimya profesörlüğüne atandı. 1867 yılında, Yüksek Öğretmen Okulu’ndaki yöneticilik görevi sona erdi: sertliği ve katılığı, ilgili Bakan Victor Duruy’nin talebi üzerine, derslerin yeniden düzenlenmesi gerekçesiyle görevden uzaklaştırıldı. Gerçek sebep, Pasteur’ün, Senato’da özgürlük üzerine bir söylev veren Sainte-Beuve’e bir tebrik mektubu yazdığı için, ödüllendirilmek üzere, kendisine gönderilen bir öğrenciyi sınava almayı reddetmesiydi. Hemen, Sorbonne’da profesörlüğe atanmasına karşın, kendisini tümüyle çalışmalarına ve araştırmalarına vermek istediğinden, bu görevi, hiç düşünmeden geri çevirdi. 1868’de bir felç geçirdi ve ölene kadar sol tarafını ancak yarı yarıya kullanabildi. Mayalanma üzerine yürüttüğü çalışmaları, 1870 yılında, öğrencisi Emile Duclaux ile birlikte tamamladı ve en başta, özellikle, bira mayası olmak üzere, mayaların özgüllüklerini ve rollerini açıkça ortaya koyarak kanıtladı. Pasteur, mayalanma üzerine yürüttüğü çalışmalar ve elde ettiği bulgularla, Liebig ve öldüğü 1877 yılma kadar sürekli olarak alkoldeki maya mantarlarının kendiliklerinden ürediklerine inanan ve mayalanmada maya mantarlarının rollerinden kuşku duymayı sürdüren Claude Bernard ile zıtlaşmasını sürdürecekti. III. Napoleon, Pasteur’ü ulusa yaptığı hizmetlerden ötürü yaşam boyu senatörlüğe atadı; ama Sedan Savaşı (1870) yüzünden, imparatorluk kararnamesi yürürlüğe konulamadı.