Kroeger, K., Collins, M., Ugozzoli, L. The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation. J. Vis. Exp. (23), e1026, doi:10.3791/1026 (2009).
Elektroporasyon birincil hücre içine plazmid DNA veya siRNA tanıtmak için en etkili yolu olduğu giderek daha belirgin hale gelmektedir. Gene Verici MXcell elektroporasyon sistemi ve Gen Verici elektroporasyon tampon, özellikle memeli hücrelerinde ve birincil ve kök cells.This video gibi zor-transfect hücreleri, nükleik asitlerin transfect geliştirilmiştir birincil fare kemik iliği hematopoetik hücre kültürleri nasıl kurulacağını gösteren ve sonra MXcell sistemi elektroporasyon için hazırlamak. Biz femur ve tibia izole ederek başlar. Femur ve tibia hem de kemik iliği biçilir ve kültürler kurulur. Kültüre kemik iliği hücreleri daha sonra transfekte ve analiz edilir.
Femur ve süresince tibialar itibaren Kemik İliği Hasat
- 12-haftalık fare (BALB / c farelerde kullanarak ancak herhangi bir fare suşu ile bu işlemi yapabilirsiniz) - 6 femur ve süresince tibialar kemik iliği hasat prosedürün ilk adımı. Başlamak için, CO 2 inhalasyon (gösterilmeyecektir) fare euthanize. Hasat femur ve her birinin arka ayakları süresince tibialar. Sonra, bir tıraş bıçağı ile, kalça ve diz eklemleri kaldırmak için her iki ucunda femur kesmek ve kemik iliği maruz.
- Benzer bir şekilde, diz ve ayak bileği komşu bölgeleri kaldırmak ve süresince tibialar iliği açığa çıkarmak için her iki ucundaki kesti.
- 26-gauge iğne ile 3 ml şırınga alın ve RPMI takviye ile% 10 FBS, penisilin, streptomisin ve beta-mercaptoethanol (BME = 100 um) ile doldurun. Cımbız kullanarak, kemik RPMI medya içeren Petri üzerinde tutun. Şırınga iğnesi kemiğin bir ucunu takın ve kemik iliği dışarı atılması için piston bastırın. Şırınga iğnesi artık iliği dışarı floş kemik içinde yukarı ve aşağı hareket ettirilebilir.
- Tüm kemikler için prosedürü tekrarlayın ve sonra kültürler kurulması ile devam.
Kültürler kurulması
- Kemik iliği kültürleri kurmak için, bir hücre süspansiyonu doku kırmak için birkaç kez aşağı kızarmış kemik iliği pipet ve.
- 50 ml konik tüpün üstüne bir 70 mikron filtre koyun ve hücre süspansiyonu filtre ekleyin.
- Petri kabı RPMI ile bir kez yıkayın, sonra 70 mikron filtre durulama ekleyin.
- 1 ml şırınga pistonu kauçuk ucunu kullanarak, 70 mikron filtre üstünde kalan kemik iliği adet eziyet.
- RPMI ile filtre bir kez yıkayın.
- Filtre yıkadıktan sonra, hücre süspansiyonu için 1200 rpm'de 5 dakika santrifüj.
- PBS içinde resuspending hücre pelletini yıkayın.
- Hemasitometre kullanarak hücrelerin güvenin. Biz genellikle bir fare kemikleri (iki femurları artı iki süresince tibialar) ~ 90 milyon hücre edinin. Hücrelerinin sayımı sonra, onları tekrar 1200 rpm'de 5 dakika santrifüj.
- RPMI ve kısım son konsantrasyon ml başına 1 milyon hücre olduğunu yeterince RPMI içeren doku kültürü şişeleri içine küçük bir miktar hücrelerin tekrar
- Ilgi hücre tipi kalkınmayı teşvik etmek sitokinler ekleyin. Bu durumda, sitokin interlökin-3 (IL-3 = 10 ng / ml), bazofil ve mast hücrelerinin gelişimini teşvik etmek eklenir. Bazofiller edinmek için, 10 gün boyunca kuluçkaya yatmaktadır. Mast hücreleri için, 5 hafta boyunca kuluçkaya yatmaktadır. Mast hücreleri oluştururken, medya ve IL-3 haftada bir kez değişmiş olmalıdır.
- Burada mast hücreleri sadece kaplama sonra nasıl görünmelidir bir bakış. Bu görüntü, bazofil ve mast hücreleri interlökin-3 ilave edildikten sonra 10 gün mast iliği hücreleri farklılaşma göstermektedir.
- İstenen hücre tipi bir kere elde edildiğinde, elektroporasyon adım ile devam edin.
Electroporating Hücreler
- Elektroporasyon adım başlamak için, kültür şişelerinde hücrelerinin sayısını belirlemek.
- Hücreler genellikle mL başına 10 milyon bir yoğunluk electroporated, bu yüzden konik tüpler için gerekli hücre sayısı transfer tüpler ve 1200 rpm'de 5 dakika santrifüj.
- Santrifüj sonra, medya aspirat, 1X PBS ile hücreleri yıkayın ve tekrar 1200 rpm'de 5 dakika santrifüj.
- PBS aspire ml başına 10 milyon hücre hücre süspansiyonu yapmak için Bio-Rad Gene Verici elektroporasyon tampon ekleyin.
- Hücrelerin resuspending sonra, son bir konsantrasyonda ml başına 10 ila 20 mikrogram istenen plazmid DNA ekleyin.
- 96-iyi elektroporasyon plaka üzerinde seçtiğiniz kuyu içine hücre süspansiyonu kısım 150 mikrolitre.
- MXcell plaka odasında elektroporasyon plaka koyun ve kapağını kapatın.
- Mast hücrelerinin transfeksiyon önce bir ön ayar veya saklanan bir protokol kullanarak sürece, elektroporasyon protokol MXcell içine programlanmış olmalıdır. Optimizasyonu deneyler sayesinde mast hücrelerinin yüksek transfeksiyon verimliliği kare dalga darbe protokolleri kullanarak ortaya keşfettiler. Biz 2000uF ve 1000 ohm 300V/20ms, 350/15ms, 350V/20ms ve 350V/10ms kare dalga darbeleri teslim plaka üzerinde elektroporasyon koşulları değişecektir. Protokol ve cihaz üzerine yüklendikten sonra, hücrelerin electroporate "Darbe" tuşuna basın.
- Elektroporasyon tamamlandıktan sonra, bir doku kültürü plakası hücrelere aktarın. Biz genellikle interlökin-3 ml başına 10 nanogram 300 mikrolitre RPMI (% 10 FCS, penisilin, streptomisin ve beta-mercaptoethanol ile desteklenmiş) içeren bir 48-iyi doku kültürü plakası sıra her 150 mikrolitrelik elektroporasyon örnek aktarın. Hücreler 37 gece inkübe ° C, daha sonra ifade ve bastırılması için 24 saat sonra çalışılmalıdır.
Transfection Sonuçlar
Plazmid ml GFP başına 20 mikrogram kullanarak başarılı elektroporasyon sonra hücreler florasan mikroskobu görüntüsü, video gösterilir. Yaklaşık% 30 MXcell elektroporasyon sistem transfeksiyon verimliliği kullanılarak elde edilebilir. Sistem, hücre canlılığını korurken, transfeksiyon verimliliğini en üst düzeye çıkarmak için şartlarda değişiklik sağlar.
Daha genomik bilgi ortaya çıkıyor ve böyle bir siRNA olarak yeni araçlar geliştirilmiştir, fizyolojik ilgili hücrelerin kullanımı, hastalık yolları, protein-protein etkileşimleri, ve sinyal iletimi anlayışımızı ilerletmek için her zamankinden daha önemli hale gelmiştir. İlköğretim hücreleri, dokuları veya sıvıları doğrudan elde edilen ve in vitro olarak yetiştirilmektedir. Bu hücreler, genetik materyalin eksojen tanıtım yoluyla yolları da dahil, bir dizi manipüle edilebilir. Bu plazmid DNA veya birincil hücre içine siRNA tanıtmak için en etkili yolu elektroporasyon olduğunu giderek daha belirgin hale gelmektedir.
Elektroporasyon geçici böylece ekzojen nükleik asitlerin hücre girmesine izin verir, hücre zarının geçirgenliğini artırmak amacıyla elektrik darbeleri hücreleri ortaya koyar. Transfeksiyon Bu yöntem, farklı hücre türleri / hatları ve, böylece mast hücrelerinin transfect kullanılabilir yanı sıra, diğer kemik iliği kaynaklı hücre arasındaki farklılıkların karşılamak için optimize edilebilir. Ayrıca, viral aracılı transfeksiyon aksine, elektroporasyon transfekte DNA boyutu sınırlar empoze, ne de kapsamlı bir hazırlık gerektirir değildir. Elektroporasyon lipid aracılı transfeksiyon aksine, daha az toksik olabilir ve transfekte nükleik asit endosomal yakalama sonuç vermez.
Bio-Rad, bu hücrelerin MXcell elektroporasyon sistemi için özel olarak geliştirilmiştir. MXcell transfeksiyon verimliliği ve hücre canlılığı en üst düzeye çıkarmak için şartlarda değişiklik sağlar. Transfeksiyon verimliliği optimize etmek ve hücre ölümü, voltaj elektroporasyon parametreleri de dahil olmak üzere bir çok en aza indirmek için, kondansatör, direnç ve nabız uzunluğu ayarlanabilir ve değerlendirilmelidir.