ELISA ile İlgili Temel Bilgiler
ELISA, enzime bağlı immünosorbent deneyi anlamına gelir ve sıklıkla enzim immünoassay (EIA) olarak da adlandırılır. Diğer immünoassay türleri gibi, bir ELISA’nın da oldukça spesifik antikor-antijen etkileşimleri kullanarak, hedef bir antijeni saptamak için antikorlara ihtiyacı vardır. Bir ELISA deneyinde, antijen, katı bir yüzeye sabitlenmelidir. Bu ya doğrudan ya da yüzey üzerinde sabitlenmiş bir yakalama antikorunun kullanılması yoluyla yapılır. Antijen daha sonra bir enzim veya bir florofor gibi deteksiyona uygun bir molekülle konjuge edilmiş bir deteksiyon antikoruyla bileşik oluşturur.
Bir ELISA deneyi, genel olarak birden çok kuyucuklu bir plakada (96- veya 384-kuyucuklu) gerçekleştirilir. Bu birden çok kuyucuklu plaka, antijeni sabitlemek için katı bir yüzey sağlar. Analitlerin sabitlenmesi, antijenin numunedeki geri kalan bileşenlerden ayrılmasını kolaylaştırır. Bu özellik, ELISA’yı, aynı anda birden fazla numune üzerinde gerçekleştirilmesi en kolay deneylerden biri yapar.
ELISA’nın Avantajları ve Dezavantajları


Avantajlar


Dezavantajlar
|Yüksek hassasiyet ve özgüllük: ELISA’ların, antikorların kullanımı nedeniyle, antijenleri pikogram seviyesinde çok spesifik bir şekilde saptaması yaygın bir durumdur.||Kısa süreli okumalar: deteksiyon, enzim/substrat reaksiyonlarına dayalıdır ve bu nedenle çıktı kısa bir süre içinde elde edilmelidir.|
|Yüksek verimlilik: ELISA kitleri, genellikle 96 kuyucuklu bir plaka biçiminde mevcuttur. Ancak deney, 384 kuyucuklu plakalara kolaylıkla uyarlanabilir.||Sınırlı antijen bilgisi: numunedeki antijen miktarı veya varlığına ilişkin sınırlı bilgi.|
|Uygulaması kolay: protokolleri takip etmek kolaydır ve çok az uygulamalı zaman gerektirir.|
|Kantitatif: Bir numunedeki antijen konsantrasyonunu belirleyebilir.|
|Çeşitli numune türlerini test etme imkânı: diğerlerinin yanı sıra serum, plazma, hücresel özler ve doku özleri, idrar ve tükürük.|
Bunlar, genel ELISA avantajları ve dezavantajlarıdır. Kullanılan ELISA türüne bağlı olarak başka avantaj ve dezavantajlar da vardır.
ELISA türleri
ELISA deneyleri, her biri kendi avantaj ve dezavantajlarına sahip olan farklı biçimlerde bulunabilir. Aşağıdaki şema, dört adet farklı başlıca ELISA türünü göstermektedir.
Direkt ELISA
Antijen, birden çok kuyucuklu plakanın yüzeyine sabitlenir ve antijene özgü ve doğrudan HRP’ye veya diğer deteksiyon moleküllerine konjuge edilmiş bir antikor ile saptanır.
Dolaylı ELISA
Doğrudan ELISA deneylerine benzer şekilde, antijen çok kuyucuklu plakanın yüzeyine sabitlenir. Bununla birlikte, deteksiyon için, antijene özgü bir primer antikorun hedefe bağlandığı ve primer antikorun konak türlerine karşı etiketlenmiş bir sekonder antikorun deteksiyon için primer antikora bağlandığı iki aşamalı bir süreç gereklidir.
Yöntem ayrıca, serumu primer antikorun yerine koyarak, bir serum numunesindeki spesifik antikorları saptamak için de kullanılabilir.
ABCAM’deki tüm dolaylı ELISA kitlerine buradan göz atabilirsiniz.
Sandviç ELISA
Sandviç ELISA (veya sandviç immünoassay) en yaygın kullanılan biçimdir. Bu tür, antijenin farklı epitoplarına özgü iki antikor gerektirir. Bu iki antikor genellikle, eşleşen antikor çiftleri olarak adlandırılır. Antikorlardan biri, birden çok kuyucuklu plakanın yüzeyi üzerinde kaplanır ve antijenin sabitlenmesini kolaylaştırmak için bir yakalama antikoru olarak kullanılır. Diğer antikor konjuge edilir ve antijenin deteksiyonunu kolaylaştırır.
ABCAM’deki tüm sandviç ELISA kitlerine buradan göz atabilirsiniz.
SimpleStep ELISA® Kitleri
SimpleStep ELISA® kitleri markamız, geleneksel bir ELISA kitinin bilinen sürecini ve standart veri çıkışını koruyarak gelişmiş hız ve performans sağlar. SimpleStep ELISA® kitleri, sandviç kompleksi oluşumunu sıralı bir şekilde değil, tek adımda sağlayarak yıkama adımlarının sayısını azaltır. Gereken toplam süre iki saatten azdır.
ABCAM’deki tüm SimpleStep ELISA® kitlerine buradan göz atabilirsiniz.
Kompetitif ELISA
İnhibisyon ELISA veya kompetitif immünoassay olarak da bilinen bu deney, sinyal müdahalesini saptayarak bir antijenin konsantrasyonunu ölçer. Önceki türlerin her biri kompetitif türe uyarlanabilir. Numune antijen, belirli bir miktarda etiketlenmiş antikora bağlanmak için bir referans antijenle rekabet eder. Referans antijen, birden çok kuyucuklu bir plaka üzerinde önceden kaplanmıştır. Numune, etiketli antikorla önceden inkübe edilir ve kuyucuklara eklenir. Numunedeki antijen miktarına bağlı olarak, referans antijeni bağlamak için aşağı yukarı bağımsız antikor mevcut olacaktır. Bu, numunede ne kadar çok antijen varsa, o kadar az referans antijenin saptanacağı ve sinyalin o kadar zayıf olacağı anlamına gelir.
Bazı kompetitif ELISA kitleri, etiketli antikor yerine etiketli antijen kullanır. Etiketli antijen ve (etiketlenmemiş) numune antijeni, primer antikora bağlanmak için rekabet eder. Numunedeki antijen miktarı ne kadar düşükse, kuyucukta daha çok etiketli antijen bulunduğu için sinyal o kadar güçlüdür.
ABCAM’deki tüm kompetitif ELISA kitlerine buradan göz atabilirsiniz.
ELISA’nın farklı türlerinin avantajları ve dezavantajları
|Avantajlar||Dezavantajlar|
|Doğrudan ELISA||Kısa protokol: zamandan ve reaktiflerden tasarruf sağlar. Sekonder antikordan kaynaklanan çapraz reaktivite yoktur.||Potansiyel yüksek arka plan: numunedeki bütün proteinler yüzeye bağlanır. Sinyal amplifikasyonu yoktur. Düşük esneklik: primer antikor konjuge edilmelidir.|
|Dolaylı ELISA||Sinyal amplifikasyonu: birkaç sekonder antikor, primer antikora bağlanır. Yüksek esneklik: aynı sekonder antikor, birkaç primer antikor için kullanılabilir.||Doğrudan ELISA ile karşılaştırıldığında uzun protokol. Sekonder antikordan kaynaklanan potansiyel çapraz reaktivite.|
|Sandviç ELISA||Yüksek özgüllük: aynı antijen üzerinde farklı epitopları saptayan iki antikoru içerir. Kompleks numuneler için uygundur. Yüksek esneklik ve hassasiyet: hem doğrudan hem de dolaylı yöntemler kullanılabilir.||Zahmetli tasarım: Aynı hedefe karşı, farklı epitopları tanıyan ve birlikte iyi çalışan iki antikor bulmak bazen zor olabilir.|
|Kompetitif ELISA||Seçilen temel ELISA’ya bağlıdır. Küçük antijenler için uygundur.||Seçilen temel ELISA’ya bağlıdır.|
SimpleStep ELISA Kitleri
Performanstan ödün vermeden zamandan tasarruf edin. ELISA’nızı, tek bir yıkama protokolüyle, spesifik ve hassas sonuçlar için güncelleyin.
-
- Tek yıkama protokolü, deney süresini 90 dakikaya veya daha aza indirir.
-
- Rakip deneylerle kıyaslanabilir veya daha iyi hassasiyete sahiptir.
-
- Geçerliliği, biyolojik numunelerle tamamen onaylanmıştır.
-
- Özel malzeme gerektirmez.
Tek yıkamalı 90 dakikalık protokol
SimpleStep ELISA kitleriyle, solüsyon içinde, bir analit yakalama ve dedektör antikor sandviç kompleksi oluşturulur. Sadece tek bir inkübasyon ve yıkama aşamasında, tam sandviç kompleksi kuyucukta oluşur ve bir immünoafinite etiketiyle plakaya sabitlenir.
Hassasiyetten ödün vermez
SimpleStep ELISA kitleri, performanstan ödün vermeden deney sürelerini büyük ölçüde azaltır. SimpleStep ELISA kitlerinin hassasiyetini, 75 adet yaygın insan ve fare proteini için, ELISA kitlerinin en popüler rakip markasıyla karşılaştırdık. SimpleStep ELISA, 75 vakanın 56’sında üstün hassasiyet göstermektedir.
Biyolojik numunelerde test edilmiştir
Her SimpleStep ELISA® kiti, deney özgüllüğü için birçok biyolojik numune kullanılarak doğrulanmıştır. Salgılanan tüm serum veya plazma temelli hedefler test edilir ve Dünya Sağlık Örgütü’nün kan değerleri referans aralıklarında yer alır. Hazır olduğunda, SimpleStep ELISA® kitleri, bilinen NIBSC uluslararası standartlarına göre kalibre edilir ve veri karşılaştırması için bir çevirme faktörü içerir.
Geniş analit çeşitliliği
Şu anda, PD-L1, GFP ve fibrinojen gibi yaygın proteinler dahil olmak üzere yaklaşık 600 hedefe uygun SimpleStep ELISA® kitimiz mevcuttur ve sürekli olarak kataloğa yenilerini ekliyoruz.
ABCAM’deki tüm SimpleStep ELISA® kitlerine buradan göz atabilirsiniz.
CatchPoint SimpleStep ELISA® kitleri
CatchPoint SimpleStep ELISA® kitleri, kolorimetrik ELISA kitleri ile karşılaştırıldığında, genişletilmiş bir dinamik aralık üzerinde, gelişmiş doğrusallığı sağlamak için bir floresan substrat kullanılarak geliştirilmiştir. Genişletilmiş dinamik aralık, eğrinin hem alt hem de üst ucunda daha iyi miktar ölçümü sağlar.
Buradan daha fazlasını keşfedebilirsiniz.
Eşleşen antikor çifti kitleri
Yüksek performanslı antikor çiftleriyle kendi ELISA’nızı oluşturun.
Eşleşen antikor çifti kitleri ve reaktifler, tutarlı, spesifik ve hassas sonuçlar verir.
-
- Partiden partiye tutarlılık: eşleşen antikor çiftlerimizde, yalnızca rekombinant monoklonal antikorlar kullanılır.
-
- Özgüllük: antikor çiftleri, karışık numunelerde özgüllüğü sağlamak için plazma ve serumda taranır.
-
- Hassasiyet: kompetisyon ile karşılaştırılan eşdeğer veya üstün performansı sağlamak için, piyasada bulunan antikor çiftleriyle kıyaslanarak değerlendirildi.
Eşleşen antikor çifti kitleri, titre edilmiş bir yakalama ve biyotinlenmiş dedektör antikor çifti ve kalibre edilmiş bir protein standardı içerir. Kitler, standart bir sandviç ELISA kullanan 2 veya 10 x 96 kuyucuklu plakalar için yeterli reaktifleri içerir ve iki boyutta mevcuttur.
İnsan IL-1Ra eşleşen antikor çifti kiti (ab210888), insan IL-1Ra standart proteini, bir sandviç ELISA kullanarak ölçüldüğünde, bir tavşan poliklonal antikor çiftinden 10 kat daha hassastır.
ABCAM kataloğundaki tüm eşleşen antikor çiftlerine buradan göz atabilirsiniz.
Doğru ELISA kitini seçin
Deney performansının dikkatli bir şekilde değerlendirilmesi, yeni bir ELISA kiti seçmek konusunda önemli bir ilk adımdır. Önemli parametreler, çoğu ELISA kiti için bahsedilen hassasiyeti, dinamik aralığı ve kesinliği kapsar. Diğer parametreler, tipik numune türlerine dair ELISA performansı konusunda daha belirleyicidir. Dilüsyonun yüzde (%) geri kazanımı ve doğrusallığı, plazma, serum veya hücre kültürü medyumu gibi gerçek numunelerdeki hedef proteini ölçer.
Bu bölüm, numuneniz için doğru ELISA kitini bulmanıza yardımcı olmak üzere farklı parametrelerin nasıl yorumlanacağını açıklamaktadır.
ELISA hassasiyeti
Hassasiyet, ELISA kitinde kullanılan antikor çiftinin saptayabildiği en düşük protein düzeyidir.
ELISA dinamik aralığı
Dinamik aralık, testin doğru bir şekilde ölçebildiği hedef proteinin üst ve alt konsantrasyonları olarak tanımlanır.
* Belli bir ELISA kitinin hassasiyetinin ve dinamik aralığının uygun olup olmadığını kontrol etmek için, bir numunede hedef proteinin hangi seviyelerinin beklendiğini bilmek önemlidir. Hedef proteinin yüksek konsantrasyonlarına sahip olan numuneler, ham sinyalin, testin dinamik aralığı içinde kalabilmesi için seyreltilebilir.
Bu iki parametre için bildirilen değerler yanıltıcı olabilir çünkü bunlar genellikle basit tamponlarda standart protein kullanılarak belirlenir. Bu, biyolojik bir numunede endojen bir proteinin saptanma kinetiğini yansıtmayabilir.
ELISA Değişim Katsayısı
CV (%) veya değişim katsayısı, deneyin ne kadar tutarlı olduğunu gösterir.
CV, genellikle, çalışmalar arası kesinliği veya plakadan plakaya tutarlılığı ve çalışma içi kesinliği veya aynı deneyde işlem gören eşler arasındaki tutarlılığı değerlendirmek için hesaplanır.
-
- Çalışmalar arası % değişim katsayılarının 15’in altında olması genellikle kabul edilebilir.
-
- Çalışma içi % değişim katsayıları 10’dan az olmalıdır.
ELISA özgüllüğü
ELISA kitinde kullanılan antikorların hedef olmayan proteinlerle çapraz reaksiyona girmemesi önemlidir. Bunlar, türler arasında yüksek homolojiye sahip proteinler olabilir.
Örneğin, İnsan Faktör IX SimpleStep ELISA® Kiti (ab188393), insan Faktör IX’a özgüdür ve fare, sıçan, tavşan, keçi, gine domuzu, hamster, inek, köpek veya domuz numunesi ile reaksiyona girmez.
ELISA yüzde geri kazanımı
Yüzde (%) geri kazanımı, belli bir miktarda saflaştırılmış hedef proteinin bir biyolojik numune türüne (numune matrisi olarak da adlandırılır) eklenmesiyle belirlenir. Sitokinler gibi salgılanan proteinler için, tipik numune matrisleri plazma ve serumdur; kinazlar gibi hücre içi proteinler için, numuneler hücre kültürü lizatlarıdır.
Eklenmiş numune ELISA’da ölçülür ve konsantrasyon standart eğriden hesaplanır. Hesaplanan bu konsantrasyon, bilinen protein konsantrasyonu ile karşılaştırılır ve yüzde olarak ifade edilir. Örneğin %100 geri kazanım, gözlemlenen konsantrasyonun numunedeki eklenmiş proteinin asıl konsantrasyonu ile aynı olduğu anlamına gelir. Numune türündeki diğer proteinlerin ve moleküllerin, hedef proteinin miktarının belirlenmesine müdahale etmediğini belirtir.
Belli bir numune türü için % geri kazanımı, %80’den azsa, miktar belirleme için farklı bir ELISA kiti seçilmelidir.
ELISA dilüsyonun doğrusallığı
Dilüsyonun doğrusallığı, biyolojik numunelerde eklenmiş protein yerine doğal proteini ölçtüğünden % geri kazanımı için iyi bir ortaktır. Dilüsyonun doğrusallığı, bilinen pozitif numunelerin dilüsyonunun ELISA ile ölçülmesiyle belirlenir. Hedef proteinin konsantrasyonu, dilüsyon faktörü ile hesaplanan konsantrasyon çarpılarak belirlenir. En iyi sonuçlar için, numunelerin konsantrasyonu tüm dilüsyonlar yönünden benzer olmalıdır. Seyreltilmemiş numunede %20’den fazla bir fark gözlenirse, doğru miktarı belirleme için farklı bir ELISA kiti seçilmelidir.
ELISA numune hazırlanması
Bir ELISA’yı çalıştırmadan önce numunenizi hazırlamak için ipuçları
Numune hazırlamaya ve uyumlu numune türlerine ilişkin ürüne özgü detaylar için lütfen kitinizle birlikte verilen protokole başvurun.
Bu yönergelerin, ELISA deneylerinde kullanılmak üzere, yaygın olarak test edilen numuneleri hazırlamak için bir eğitim kaynağı olması amaçlanmaktadır. En uygun numune hazırlama prosedürleri, ilgili hedef ve teste bağlı olarak değişecektir. Yeni bir deney geliştirirken, sizinkine benzer deneysel örnekler için literatüre başvurmak her zaman iyi bir uygulamadır.
Numune hazırlama yöntemleri
Hücre kültürü süpernatantı
-
- Hücre kültürü medyumunu bir santrifüj tüpünün içine pipetleyin ve 1500 rpm’de 10 dakika boyunca 4°C’de santrifüjleyin.
-
- Süpernatanttan hemen alikot alın ve numuneleri -80°C’de saklayın. Donma/çözülme döngülerini en aza indirin.
Hücre ekstraktı
-
- Doku kültürü plakalarını buzun üzerine yerleştirin.
-
- Medyumu aspire edin ve hücreleri bir kez çok soğuk PBS ile nazikçe yıkayın.
-
- PBS’yi aspire edin ve 100 mm plaka başına 0,5 mL tam ekstraksiyon tamponu ekleyin.
-
- Hücreleri eğimli plakada toplamak için kazıyın ve önceden soğutulmuş tüpe taşıyın.
-
- Kısa bir süre vorteksleyin ve 15–30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
-
- Çözünmeyen içerikleri peletlemek için 4°C’de 10 dakika boyunca 13.000 rpm’de santrifüjleyin.
-
- Temiz, buz üzerinde soğutulmuş tüplere süpernatanttan alikot alın (bu, çözünebilen hücre ekstraktıdır) ve numuneleri -80°C’de saklayın. Donma/çözülme döngülerini en aza indirin.
Şartlandırılmış medyum
-
- Hücreleri tam (serum içeren) büyüme medyumuna yerleştirin ve hücrelerin istenen birleşme seviyesine kadar çoğalmasına izin verin.
-
- Büyüme medyumunu çıkarın ve birkaç mL ılık PBS ile çok yavaş bir şekilde yıkayın. Yıkama adımını tekrarlayın.
-
- Son PBS yıkamayı çıkartın ve çok yavaş bir şekilde serumsuz büyüme medyumunu ekleyin.
-
- 1-2 gün inkübe edin.
-
- Medyumu bir santrifüj tüpüne pipetleyin ve 1500 rpm’de 10 dakika boyunca 4°C’de santrifüjleyin.
-
- Süpernatanttan hemen alikot alın ve numuneleri -80°C’de saklayın. Donma/çözülme döngülerini en aza indirin.
Süt
-
- Numuneleri toplayın ve 10.000 x g’de 2 dakika boyunca 4°C’de santrifüjleyin.
-
- Süpernatanttan alikot alın ve numuneleri -80°C’de saklayın. Donma/çözülme döngülerini en aza indirin.
Plazma
-
- Tüm kanı pıhtılaşma önleyici içeren tüpe alın veya 1/10 son hacme, 0,1 M sodyum sitrat ekleyin.
-
- 4°C’de 10 dakika boyunca 3.000 rpm’de santrifüjleyin.
-
- Süpernatanttan (plazma) hemen alikot alın ve numuneleri -80°C’de saklayın. Donma/çözülme döngülerini en aza indirin.
İdrar
-
- Numuneleri toplayın ve 10,000 x g’de 2 dakika boyunca 4°C’de santrifüjleyin.
-
- Süpernatanttan alikot alın ve numuneleri -80°C’de saklayın. Donma/çözülme döngülerini en aza indirin.
Tükürük
-
- Numuneleri toplayın ve 10,000 x g’de 2 dakika boyunca 4°C’de santrifüjleyin.
Serum
-
- Tüm kanı, işlem görmemiş deney tüpüne veya örneğin, pıhtılaşma önleyici içermeyen bir tüpe alın.
-
- 20 dakika boyunca oda sıcaklığında doğal haliyle inkübe edin.
-
- 10 dakika boyunca 4°C’de 3.000 rpm’de santrifüjleyin.
-
- Süpernatanttan (serum) hemen alikot alın ve numuneleri -80°C’de saklayın. Donma/çözülme döngülerini en aza indirin.
Doku ekstraktı
-
- İlgili dokuyu temiz aletlerle, tercihen buz üzerinde ve proteazların neden olduğu bozulmayı önlemek için mümkün olan en kısa sürede kesin.
-
- Dokuyu yuvarlak dipli mikrofüj tüplerine yerleştirin ve anında dondurmak için sıvı nitrojene daldırın. Numuneleri daha sonra kullanmak üzere -80°C’de saklayın veya anında homojenleştirme için buz üzerinde tutun.
-
- ~5 mg’lık bir doku parçası için, tüpe ~300 µL tam ekstraksiyon tamponu ekleyin (hücre/doku ekstraksiyon tamponu tarifine bakın) ve elektrikli bir homojenleştirici ile homojenleştirin.
-
- Her durulama işlemi için, 300 µL tam ekstraksiyon tamponu kullanarak bıçağı iki kez durulayın, ardından 4°C’de 2 saat boyunca devamlı olarak çalkalamayı sürdürün (örn. soğuk odada bir orbital çalkalayıcıya yerleştirin).
-
- – 4°C’de 13.000 rpm’de 20 dakika boyunca santrifüjleyin. Buz üzerine yerleştirin, süpernatanttan, yeni, soğutulmuş bir tüpe alikot alın (bu, çözünebilir protein ekstraktıdır) ve numuneleri -80°C’de saklayın. Donma/çözülme döngülerini en aza indirin.
Liziz tamponu hacimleri, mevcut doku miktarına göre belirlenmelidir. Son protein ekstraktının tipik konsantrasyonu >1 mg/mL’dir.
Hücre/doku ekstraksiyon tamponu tarifi
-
- 100 mM Tris, pH 7.4
-
- 150 mM NaCl
-
- 1 mM EGTA
-
- 1 mM EDTA
-
- 1% Triton X-100
-
- 0.5% Sodyum deoksikolat
Tam ekstraksiyon tamponu üretmek için gereken ek reaktifler.
-
- Fosfataz inhibitörü karışımı
-
- Proteaz inhibitörü karışımı
-
- PMSF
Hücre ekstraksiyon tamponunu, kullanmadan hemen önce, üretici tarafından açıklandığı gibi, fosfataz ve proteaz inhibitörü karışımlarıyla tamamlayın ve PMSF’yi 1 mM’ye tamamlayın.
Genel öneriler
-
- Tavsiye edilen protein ekstraktı konsantrasyonu, en az 1–2 mg/mL’dir.
-
- Genel olarak, serum, plazma, hücre ve doku ekstraktları, bağlama tamponu ile %50 oranında seyreltilir.
-
- Çözdükten sonra kullanmadan önce, numuneleri, çökeltiyi gidermek için 10.000 rpm’de 5 dakika boyunca 4°C’de santrifüjleyin.
ELISA için gereken kontrol numuneleri
Gerekli kontrolleri yerine getirmek, doğru pozitif sonuçları, olası yanlış sonuçlardan kesin bir şekilde ayırmanıza yardımcı olur. Pozitif ve negatif kontroller, protokolünüzde sorun gidermeniz gerektiğinde de faydalı olacaktır. Burada, bir ELISA çalıştırırken kullanmanız gereken çeşitli kontrol numunesi türlerini açıklıyoruz.
Pozitif Kontrol
Tespit ettiğiniz proteini içerdiği bilinen endojen bir çözülebilir numune veya kullandığınız antikor için immünojen dizisini içerdiği bilinen saflaştırılmış bir protein veya peptit kullanın. Pozitif kontrolden alınan pozitif bir sonuç, numuneler negatif olsa bile, uygulanan işlemin optimize edildiğini ve çalıştığını gösterir. Bu, herhangi bir negatif sonucun geçerli olduğunu doğrulayacaktır.
Önerilen bir pozitif kontrolü sıklıkla sağlayacak olan antikor veri sayfasını gözden geçirmenizi öneririz. Herhangi bir kontrol önerilmiyorsa, aşağıdakileri öneririz:
– Antikor için herhangi bir Abreviews® olup olmadığını kontrol edin. Başarılı bir şekilde kullanılmış herhangi bir doku, hücre veya lizat, uygun bir pozitif kontrol olarak kabul edilebilir.
– Veri sayfasındaki Swiss-Prot veya Omnigene veri tabanı bağlantılarına bakmayı deneyin. Bu veri tabanlarında genellikle proteinin açığa çıkarıldığı dokuların bir listesi bulunur. Ayrıca bunlar da uygun pozitif kontroller olarak kabul edilebilir.
– Protein için GeneCards girişini kontrol edin. Bu genellikle size çeşitli dokularda göreceli ekspresyon seviyeleri sağlayacaktır.
– Hala uygun bir kontrol bulmakta güçlük çekiyorsanız, hangi doku ve hücrelerin ilgili proteini açığa çıkardığını görmek için PubMed’de hızlı bir literatür taraması yapmanızı öneririz.
Negatif Kontrol
Bu, saptadığınız proteini açığa çıkarmadığını bildiğiniz bir numunedir ve spesifik olmayan bağlanmayı ve yanlış pozitif sonuçları kontrol etmenizi sağlar. Kullandığınız her plaka, sonuçları doğrulamak için bir negatif kontrol numunesi içermelidir.
Standart
Bu, standart eğrinin elde edilebileceği hedef proteinin bilinen bir konsantrasyonunu içeren bir numunedir. Örneğin aşağıda, Fare IL-6 ELISA kitimizin (ab46100), 15.6 ila 500 µg/mL arasında değişen konsantrasyona sahip tipik bir standart eğrisi bulunmaktadır. Zayıf bir standart eğri, antikorun düzgün bağlanmadığı veya protein standardını yakalamadığı anlamına gelir. Eğim çizgisinin R2 değeri >0,99 olmalıdır.
Numune kontrolünde (spike kontrolü) standart
ELISA’da serum numunelerini test ederken, her zaman olduğu gibi normal seyreltici tampona bir standart ekleyin.
Ancak, test ettiğiniz türlerden, serumda seyreltilmiş bir standart da eklemenizi öneririz. Bu ikisi daha sonra, serumdaki diğer proteinlerin, standart eğri üzerinde hiçbir etkisinin olmadığından emin olmak için karşılaştırılabilir. Bu, bir spike kontrolü olarak bilinir ve size bir hedef proteinin bir matrise eklendikten sonra geri kazanılabilir olduğunu söyler. Kabul edilebilir sonuçlar %80–120’dir.
Endojen pozitif kontrol
Bir rekombinant protein numunesini test ediyorsanız, bir endojen pozitif kontrol eklemenizi öneririz. Bu, deneyinizin temel bir bileşeni olmalıdır.
Dikkate alınması gereken rekombinant proteinlerin antikor deteksiyonunun kendinde var olan zorlukları bulunmaktadır. Rekombinant proteinin katlanması, endojenin doğal formundan farklı olabilir ve antikorun epitopa erişimini engelleyebilir. Bu, özellikle etiketli proteinler için geçerlidir. Her zaman etiketlerin, rekombinant proteinin N veya C-terminal ucuna yerleştirildiğinden emin olun.
En önemlisi, her zaman rekombinant proteinin, kullandığınız antikorun immünojen dizisini içerdiğinden emin olun. Endojen bir pozitif kontrol, sonuçları doğrulamak ve ayrıca reaktiflerin (örn. antikorlar) ve uygulanan işlemin ne kadar iyi çalıştığını göstermek için önemlidir.
Sandviç ELISA Protokolü
Giriş
Bir sandviç ELISA, antikorların iki katmanı (yakalama ve deteksiyon antikoru) arasındaki antijeni ölçer. Hedef antijen, antikorlara bağlanabilen en az iki antijenik alan içermelidir.
Monoklonal veya poliklonal antikorlar, sandviç ELISA sistemlerinde, yakalama ve deteksiyon antikorları olarak kullanılabilir. Monoklonal antikorlar, küçük antijen farklılıklarının miktarını belirlemeyi sağlayan tek bir epitop tanırlar. Poliklonal antikor genellikle, mümkün olduğu kadar çok antijeni çekmek için yakalama antikoru olarak kullanılır.
Sandviç ELISA’lar, analizden önce numune saflaştırma adımını ortadan kaldırır ve hassasiyeti yükseltir (doğrudan ya da dolaylı olandan 2-5 kat daha hassastır).
Sandviç ELISA işlemlerini optimize etmek zor olabilir ve test edilmiş eşleşen antikor çiftleri kullanılmalıdır. Bu, antikorların hedef protein üzerinde farklı epitopları saptamasını ve diğer antikor bağlanmalarına müdahale etmemesini sağlar. Spesifik olarak test edilmedikçe, sandviç ELISA’daki antikorlarımıza garanti veremeyiz.
Test edilen uygulama bilgileri için antikor veri sayfalarını inceleyin.
Yakalama antikoru ile kaplama
-
- PVC mikrotitre plakasının kuyucuklarını, karbonat/bikarbonat tamponunda (pH 9.6), 1–10 μg/mL konsantrasyonda yakalama antikoru ile kaplayın.
-
- Saflaştırılmamış antikorlar (örn. asit sıvısı veya antiserum), spesifik antikorun düşük konsantrasyonunu telafi etmek için numune protein konsantrasyonunun arttırılmasını (10 μg/mL deneyin) gerektirebilir.
-
- Plakayı yapışkan plastikle örtün ve gece boyunca 4°C’de inkübe edin.
-
- Kaplama solüsyonunu çıkarın ve kuyucukları 200 μL PBS ile doldurarak plakayı iki kez yıkayın. Solüsyonlar veya yıkamalar, plakayı bir lavabonun üzerine hafifçe vurarak giderilir. Bir kâğıt havlu üzerinde, plakaya hafifçe vurularak kalan damlalar alınır.
Numuneleri bloklama ve ekleme
-
- Kuyucuk başına 200 μL bloklama tamponu (%5 yağsız süt tozu/PBS) ekleyerek, kaplanmış kuyucuklardaki kalan protein bağlama alanlarını bloklayın.
-
- Plakayı yapışkan plastikle kapatın ve oda sıcaklığında en az 1–2 saat veya 4°C’de gece boyunca inkübe edin.
-
- Plakayı 200 µL PBS ile iki kez yıkayın.
-
- Her kuyucuğa 100 μL seyreltilmiş numune ekleyin. Her zaman, bilinmeyen numunelerin sinyalini, bir standart eğrinin sinyalleriyle karşılaştırın. Standartları (iki aynı eş veya üç aynı eş) çalıştırın ve her bir plaka ile üzerini kapatın. 37°C’de 90 dakika boyunca inkübe edin.
Standartların konsantrasyonunun, antikor bağlanmasının en dinamik deteksiyon aralığını kapsadığından emin olun. Uygun bir standart eğrisi elde etmek için konsantrasyon aralığını optimize etmeniz gerekebilir. Numuneleri ve standartları her zaman ikili veya üçlü eşler halinde çalıştırın.
5. Numuneleri çıkarın ve plakayı 200 μL PBS ile iki kez yıkayın.
Deteksiyon ve sekonder antikorla inkübasyon
-
- Her kuyucuğa 100 μL seyreltilmiş deteksiyon antikoru ekleyin.
Deteksiyon antikorunun, yakalama antikoruna göre, hedef protein üzerinde farklı bir epitop tanıyıp tanımadığını kontrol edin. Bu, antikor bağlanmasına müdahaleyi önler. Mümkün olduğunda, test edilmiş eşleşen bir çift kullanın.
-
- Plakayı yapışkan plastikle kapatın ve 2 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
-
- Plakayı dört kez PBS ile yıkayın.
-
- Kullanmadan hemen önce, bloklama tamponunda seyreltilmiş, 100 μL konjuge sekonder antikor ekleyin.
-
- Plakayı yapışkan plastikle kapatın ve oda sıcaklığında 1–2 saat inkübe edin.
-
- Plakayı dört kez PBS ile yıkayın.
Deteksiyon
Yaban turpu peroksidaz (HRP) ve alkalin fosfataz (ALP), ELISA deneylerinde deteksiyon için kullanılan en yaygın iki enzimdir.
Bazı biyolojik ürünlerin yüksek düzeyde endojen enzim aktivitesine (alveolar hücrelerde yüksek ALP, kırmızı kan hücrelerinde yüksek peroksidaz gibi) sahip olduğunu ve bunun da spesifik olmayan sinyale neden olabileceğini göz önünde bulundurun. Gerekirse, (ALP için) levamisol veya (peroksidaz için) metanol içinde %0,3 H2O2 ile ek bir bloklama işlemi gerçekleştirin.
ALP substratı
P-Nitrofenil-fosfat (pNPP), çoğu uygulama için en yaygın kullanılan substrattır. Oda sıcaklığında 15–30 dakikalık inkübasyondan sonra, 405 nm’de nitrofenolün sarı rengini ölçün ve eşit hacimde 0.75 M NaOH ekleyerek reaksiyonu durdurun.
HRP kromojenleri
HRP için substrat hidrojen peroksittir. Hidrojen peroksidin bölünmesi, reaksiyon esnasında renk değiştiren bir hidrojen donörünün oksidasyonu ile birleştirilir.
TMB (3,3′,5,5′-tetrametilbenzidin)
Her kuyucuğa TMB solüsyonu ekleyin, 15–30 dakika boyunca inkübe edin, eşit hacimde durdurma solüsyonu (2 M H2SO4) ekleyin ve 450 nm’de optik yoğunluğu okuyun.
OPD (o-fenilendiamin dihidroklorür)
Son ürün 492 nm’de ölçülür. Işığa duyarlı olduğu için substratı karanlıkta tutun ve saklayın.
ABTS (2,2′-azino-di- [3-etilbenzotiazolin-6 sülfonik asit] diamonyum tuzu)
Son ürün yeşildir ve optik yoğunluk 416 nm’de ölçülebilir.
Bazı enzim substratları tehlikeli (potansiyel karsinojenler) olarak kabul edildiğinden, her zaman dikkatli olun ve eldiven giyin.
Veri analizi
X ekseninde konsantrasyon (log ölçeği) ve Y ekseninde (doğrusal) absorbans ile seri dilüsyon verilerinden standart bir eğri hazırlayın. Bu standart eğriden numunenin konsantrasyonunun ara değerini hesaplayın.
ELISA analizleri
ELISA deneyleri, elde edilen verinin türüne göre, aşağıdaki gibi sınıflandırılabilir:
-
- Kalitatif ELISA: sadece, numunede antijenin var olup olmadığını belirler. Antijen veya ilgisi olmayan bir kontrol antijeni içermeyen boş bir kuyucuk gerektirir.
-
- Yarı kantitatif ELISA: numuneler arasındaki antijen düzeylerinin göreceli karşılaştırmasına olanak sağlar.
-
- Kantitatif ELISA: numunede bulunan antijen miktarının hesaplanmasına olanak sağlar. Bilinen bir konsantrasyonda saflaştırılmış bir antijenin seri dilüsyonundan hazırlanan bir standart eğri ile numuneler için ölçülen değerlerin karşılaştırılmasını gerektirir. Bu, en yaygın olarak bildirilen ELISA verileridir.
ELISA standart eğrisi
Standart veya kalibrasyon eğrisi, numunedeki antijen konsantrasyonunun hesaplanmasına olanak sağlayacak olan kantitatif ELISA’nın bir ögesidir.
Standart eğri, bir referans antijenin bilinen konsantrasyonlarının her konsantrasyon için elde edilen değere (genellikle 450 nm’de optik yoğunluk) karşı eğri çizilmesinden elde edilir.
Çoğu ELISA plaka okuyucusu, eğri ayarlama ve veri analizi için bir yazılım içerecektir. Numunedeki antijen konsantrasyonu, standart eğrinin doğrusal kısmından ekstrapolasyon yapılarak hesaplanır.
Eğri ayarlama yazılımı, verilerinizi çizmek için farklı modeller kullanmanıza izin verir.
– Doğrusal çizim: bir eksende antijen konsantrasyonunu ve diğerinde okumayı gösterir. R2 değerleri burada normalde, çok iyi bir uyum gösteren 0.99’dan daha yüksek değerlerle, uygunluğu belirlemek için kullanılır. Ancak, doğrusal çizimler, eğrinin alt ucundaki veri noktalarını sıkıştırma eğilimindedir ve bu da çözünürlüğün azalmasına neden olur.
– Yarı logaritmik çizim: doğrusal çizimlerin neden olduğu alt uçtaki sıkıştırmaya karşı koymaya yardımcı olur. Yarı logaritmik çizimler, veriye dayalı konsantrasyonun logaritmasını kullanır. Bu yöntem genellikle, veri noktalarını daha eşit bir şekilde dağıtan bir sigmoid eğrisiyle sonuçlanır.
– Log/logaritmik çizim: konsantrasyonların düşük ile orta aralığı için iyi bir doğrusallık sağlar. Aralığın daha yüksek ucu doğrusallığı kaybetme eğilimindedir.
– 4- veya 5-parametreli lojistik (4PL veya 5PL) eğriler: maksimum ve minimum gibi diğer parametreleri hesaba katan ve dolayısıyla daha karmaşık hesaplamalar gerektiren daha gelişmiş yöntemlerdir. 4PL, bükülme noktası etrafında simetri varsayarken, 5PL, normalde immüno-assayler için daha uygun olan asimetriyi hesaba katar.
Yazılımınız bunu sağlıyorsa, 4-PL ve 5-PL, çoğu ELISA kalibrasyon standart eğrisine uyacaktır. Yazılımınız bunu sağlamıyorsa, en iyi seçenek, yarı logaritmik veya log/logaritmik bir çizim kullanmaktır.
ELISA verisini hesaplama ve değerlendirme
ELISA verisinden elde edilen sonuçların hesaplanması ve deneyin istatistiksel olarak doğrulanması hakkında tavsiye edilen genel bilgiler.
Hesaplama sonuçları
ELISA numunelerini her zaman iki aynı eş veya üç aynı eş halinde çalıştırın. Bu, sonuçların istatistiksel olarak doğrulanması için yeterli veri sağlayacaktır. ELISA sonuçlarını bu şekilde işlemeye yardımcı olan birçok bilgisayar programı artık mevcuttur.
Yinelenen standartların ve yinelenen numunelerin her bir seti için ortalama absorbans değerlerini hesaplayın. Yinelenenler, ortalamanın %20’si içinde olmalıdır.
Standart eğri
Protein konsantrasyonuna (x ekseni) karşı ortalama absorbansı (y ekseni) çizerek hedef protein için standart bir eğri oluşturun. Grafikteki noktalar üzerinden en uygun eğriyi çizin (bunun için uygun bir bilgisayar programının kullanılmasını öneririz).
Kullanılan her plaka için standart bir eğri sağlamak üzere, her bir ELISA plakasına bir standart eklenmesini öneririz.
Aşağıdaki şekilde, insan HIF1 alfa SimpleStep ELISA® kitinden (ab171577) temsili bir standart eğri gösterilmektedir. Grafikteki her bir nokta, üç paralel titrasyonun ortalamasını temsil eder.
Bir pozitif kontrol olarak, bilinen bir konsantrasyon numunesi kullanmanızı öneririz. Geçerli ve doğru sonuçlar elde etmek için, pozitif kontrol numunesinin konsantrasyonu, standart eğrinin doğrusal kesiti içinde olmalıdır.
Numunedeki hedef proteinin konsantrasyonu
Her bir numunede hedef protein konsantrasyonunu belirlemek için, öncelikle numunenin ortalama absorbans değerini bulun. Standart eğri grafiğinin Y ekseninden, bu absorbans değerinden standart eğriye yatay bir çizgi uzatın.
Örneğin, absorbans okuma 1 ise, Y ekseni (a) üzerindeki bu absorbans noktasından çizgi uzatın:
Kesişim noktasında, X eksenine dikey bir çizgi uzatın ve karşılık gelen konsantrasyonu okuyun (b):
Standart eğri aralığında ortaya çıkan bir absorbans değerine sahip numuneler
Doğru bir sonuç elde etmek için, bu numuneler, ELISA boyama ile işlem görmeden önce seyreltilmelidir. Bu numuneler için, sonuçlar analiz edilirken standart eğriden elde edilen konsantrasyon, dilüsyon faktörüyle çarpılmalıdır.
Değişim katsayısının hesaplanması
Değişim katsayısı (CV), standart sapmanın σ, ortalamaya µ oranıdır:
Bu, ortalamaya göre, değişimin yüzdesi olarak ifade edilir ve sonuçlarda meydana gelen herhangi bir tutarsızlığı ve hatayı gösterir. Daha büyük değişim, daha büyük tutarsızlık ve hata gösterir. Bazı bilgisayar programları, ELISA sonuçlarından CV değerlerini hesaplayabilir.
-
- Yüksek CV, aşağıdakilerle sonuçlanabilir:
-
- Hatalı pipetleme; pipet uçlarının kullanımdan önce pipete mühürlenmiş olduğundan emin olun, böylece doğru hacimde sıvı çekerler
-
- Reaktiflerin kuyucuklar arasında sıçraması
-
- Tarama numunelerinin veya reaktiflerin bakteri veya mantar kontaminasyonu
-
- Reaktifler arasında çapraz kontaminasyon
-
- Plaka boyunca sıcaklık değişimleri; plakaların hava akımlarından uzakta sabit bir sıcaklık ortamında inkübe edildiğinden emin olun
-
- Bazı kuyucukların kuruması; inkübasyon adımlarında plakların her zaman kapalı olduğundan emin olun
Spike geri kazanımı
Spike geri kazanımı, numune bileşenlerinin, antijenin antikor tarafından deteksiyonu üzerindeki etkisini belirler. Örneğin, doku kültürü süpernatantında bulunan birçok protein, antikor bağlanmasına engel olabilir ve sinyali, gürültü oranına yükseltir. Bu, hedef konsantrasyonun eksik tahmin edilmesine yol açabilir.
Bilinen protein konsantrasyonları hem numune matrisine hem de standart bir seyrelticiye katılabilir. Eklenen proteinin miktarı, test kullanılarak belirlenir ve numune matrisinden ve standart seyrelticiden elde edilen sonuçlar karşılaştırılır.
Sonuçlar aynıysa, o zaman numune matrisi, deney süreci boyunca doğru olarak Kabul edilir. Geri kazanım farklıysa, o zaman numune matrisindeki bileşenler, analit deteksiyonuna müdahale ediyordur.
Bir spike geri kazanım deneyi, numune matrisinin sonuçları etkilediğini gösteriyorsa ne olur?
Numune matrisinde seyreltilen standart kullanarak, standart eğri oluşturmanızı öneriyoruz. Numune matrisinden elde edilen sonuçlar üzerindeki herhangi bir etki, standartta da mevcut olacaktır ve bu yüzden standart eğri ve numuneler arasındaki karşılaştırma daha doğrudur. ELISA kitlerimizin birçoğu, bu amaçla, standart bir serum seyreltici içermektedir.
Başka bir çözüm, numune matrisini değiştirmektir. Örneğin, saf biyolojik numune kullanılırsa, bunu, standart seyrelticide seyreltmeyi deneyin. Ancak, bu seçenekle, sonuçları analiz ederken, dilüsyon faktörünün hesaba katıldığından ve konsantrasyonun, standart eğrinin doğrusal kesiti içinde kaldığından emin olmanız gerekecektir.
ELISA sorun çözme ipuçları
Zayıf standart eğri
|Sorun||Çözüm|
|Uygun olmayan standart solüsyon||Dilüsyonların doğru bir şekilde yapıldığını teyit edin.|
|Uygun olmayan bir şekilde sulandırılmış standart||Şişeyi açmadan önce kısa bir süre çevirin; sulandırdıktan sonra maddenin çözünüp çözünmediğini kontrol edin.|
|Bozulan standart||Standardı tavsiye edildiği şekliyle saklayın ve kullanın.|
|Eğri ölçeğe uymuyor||Farklı ölçekler kullanarak çizmeyi deneyin; örn. log-logaritmik, 5 parametreli lojistik eğri uyumu.|
|Pipetleme hatası||Kalibre edilmiş pipetleri ve uygun pipetleme tekniklerini kullanın.|
Sinyal yok
|Sorun||Çözüm|
|İnkübasyon süresi çok kısa||Numuneleri gece boyunca 4°C’de inkübe edin veya üreticinin talimatlarını takip edin.|
|Hedefin, testin deteksiyon limitlerinin altında olması||Dilüsyon faktörünü azaltın veya numuneleri konsantre edin.|
|Uyumsuz numune türü||Deteksiyon, test edilmemiş numune türlerinde azaltılabilir veya olmayabilir. Deneyin bir pozitif kontrol olarak saptadığı bilinen bir numune ekleyin.|
|Plakaya adsorpsiyonla engellenen epitopun tanınması||Doğrudan veya dolaylı ELISA ile bir peptit deteksiyonunu geliştirmek için, peptiti mikrotitre plakası üzerinde kaplamadan önce büyük bir taşıyıcı proteine konjuge edin.|
|Deney tampon uyumluluğu||Deney tamponunun, ilgili hedefle uyumlu olduğundan emin olun (örn. enzimatik aktivite korunur, protein etkileşimleri korunur).|
|Deteksiyon reaktifi yeterli değil||Üreticinin talimatlarını takip ederek, deteksiyon reaktifinin konsantrasyonunu veya miktarını arttırın.|
|Numune yanlış bir şekilde hazırlanmış||Uygun numune hazırlama/ dilüsyon sağlayın. Numuneler, mikrotitre plaka deney biçimiyle uygun olmayabilir.|
|Yetersiz antikor||Antikorun farklı konsantrasyonlarını/ dilüsyonlarını deneyin.|
|İnkübasyon sıcaklığı çok düşük||İnkübasyonların doğru sıcaklıkta uygulandığından emin olun. İşlemden önce, plaka içeren tüm reaktifler, oda sıcaklığında veya üretici tarafından tavsiye edilen şekilde olmalıdır.|
|Yanlış dalga boyu||Dalga boyunu doğrulayın ve plakayı tekrar okuyun.|
|Plaka yıkamaları çok şiddetli||Otomatik yıkama sisteminde doğru basıncı kontrol edin ve sağlayın. Yıkamalar elle yapılıyorsa, yıkama tamponunu çok yavaşça pipetleyin.|
|Kuruyan kuyucuklar||Deney başladıktan sonra, kuyucukların kurumasına izin vermeyin. Tüm inkübasyonlar için sızdırmaz film veya bant kullanarak plakayı kapatın.|
|Enzimatik reaksiyonun yavaş renk gelişimi||Substrat solüsyonunu, kullanımdan hemen önce hazırlayın. Stokta bulunan solüsyonun tarihinin geçmediğinden ve kontamine olmadığından emin olun. Daha uzun inkübasyona izin verin.|
Büyük değişim katsayısı (CV)
|Sorun||Çözüm|
|Kuyucuklardaki baloncuklar||Plaka okumasından önce hiç baloncuk bulunmadığından emin olun.|
|Eşit derecede/ tamamen yıkanmayan kuyucuklar||Plaka yıkayıcının tüm girişlerinin tıkanıp tıkanmadığını kontrol edin. Kuyucukları tavsiye edildiği gibi yıkayın.|
|Tamamlanmamış reaktif karışımı||Tüm reaktiflerin tamamen karıştığından emin olun.|
|Tutarsız pipetleme||Doğru pipetleme sağlamak için, kalibre edilmiş pipetleri ve uygun tekniği kullanın.|
|Kenar etkileri||Plakanın ve tüm reaktiflerin oda sıcaklığında olduğundan emin olun.|
|Uyumsuz numune hazırlama veya saklama||Uyumlu numune hazırlama ve optimal numune saklama koşullarını sağlayın (örn. donma/çözünme döngülerini en aza indirin).|
Yüksek arka plan
|Sorun||Çözüm|
|Kuyucuklar yetersiz bir şekilde yıkanıyor||Protokol önerilerine uygun olarak kuyucukları yıkayın.|
|Kontamine yıkama tampon||Temiz su tampon hazırlayın.|
|Çok fazla deteksiyon reaktifi||Reaktifin düzgün bir şekilde seyreltildiğinden emin olun veya deteksiyon reaktifinin tavsiye edilen konsantrasyonunu azaltın.|
|Etkisiz bloklama tamponu (örn. deteksiyon reaktifi bloklayıcıyı bağlar; kuyucuklar tamamen bloklanmaz||Farklı bloklama reaktifi deneyin ve/veya yıkama tamponuna bloklama reaktifi ekleyin.|
|İnkübasyon/ yıkama tamponlarının tuz konsantrasyonu||Artan tuz konsantrasyonu, spesifik olmayan ve/veya zayıf hedef dışı etkileşimleri azaltır.|
|Durdurma solüsyonu eklendikten sonra, plaka okumak için çok uzun süre beklenmesi||Durdurma solüsyonu ekledikten hemen sonra plakayı okuyun.|
|Spesifik olmayan antikor bağlanması||Uygun bloklama tamponlarını kullanın, örn. BSA veya %5-10 normal serum- doğrudan konjuge bir deteksiyon antikoru kullanılıyorsa primer antikorla aynı tür veya konjuge sekonder kullanılıyorsa sekonder ile aynı tür. Spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için kuyucukların önceden işlem gördüğünden emin olun.|
|Yüksek antikor konsantrasyonu||Optimal sonuçlar için farklı dilüsyonlar deneyin.|
|Işıkta uygulanan substrat inkübasyonu||Substrat inkübasyonları karanlıkta veya üretici tarafından tavsiye edilen şekilde uygulanmalıdır.|
|Substrat ilavesi üzerine kuyucuklarda oluşan çökelti||Numunenin dilüsyon faktörünü arttırın veya substrat konsantrasyonunu azaltın.|
|Kirli plaka||Plakanın altını temizleyin.|
Düşük hassasiyet
|Sorun||Çözüm|
|ELISA kitini uygun olmayan bir şekilde saklama||Bütün reaktifleri tavsiye edildiği gibi saklayın. Bütün reaktiflerin aynı saklama koşullarına sahip olmayabileceğine lütfen dikkat edin.|
|Hedef yeterli değil||Numuneyi konsantre edin veya numune dilüsyonunu azaltın.|
|Pasif deteksiyon reaktifi||Raportör enzim/floroforun beklenen aktifliğe sahip olduğundan emin olun.|
|Plaka okuyucu ayarları yanlış||Plaka okuyucunun floresan deteksiyonu için doğru absorbans dalga boyunu veya eksitasyon/emisyon dalga boylarını okuyacak şekilde ayarlandığından emin olun.|
|Deney format yeterince hassas değil||Daha hassas bir deteksiyon sistemine geçin (örn. kolorimetrik kemilüminesans/ floresan). Daha hassas bir deney türüne geçin (örn. doğrudan ELISA’dan sandviç ELISA’ya). İnkübasyon sürelerini uzatın veya sıcaklığı arttırın.|
|Hedef mikrotitre plakaya zayıf bir şekilde tutunuyor||Hedefi miktortitre plakaya kovalent olarak bağlayın.|
|Substrat yeterli değil||Daha fazla substrat ekleyin|
|Uygun olmayan numune türü (örn. serum ve hücre ekstraktı)||Test edilmemiş numune türlerinde, deteksiyon azaltılabilir veya olmayabilir. Deneyin bir pozitif kontrol olarak saptadığı bilinen bir numune ekleyin.|
|Etkileşen tamponlar veya numune bileşenleri||Reaktifleri, etkileşen kimyasallar yönünden kontrol edin. Örneğin, antikorlardaki sodyum azit, HRP enzimini engeller ve plazma toplanması için antikoagülan olarak kullanılan EDTA, enzimatik reaksiyonları engeller.|
|Farklı kitlerden reaktifleri karıştırma veya yerlerini değiştirme||Farklı kitlerden bileşenleri karıştırmaktan kaçının.|
Matris etkisi
Plazma ve serum miktarının ELISA ile ölçümü, zaman zaman matris etkisinden kaynaklanan sorunlarla karşılaşır. Matris etkisi, aşağıdakileri içeren ancak bunlarla sınırlı olmayan bazı matris unsurlarından kaynaklanabilir: fosfolipitler, karbonhidratlar ve endojen metabolitler (bilirubin) gibi endojen biyolojik bileşenler arasındaki etkileşim veya plazma proteinlerine kovalent bağlanma gibi ilgili analit ile matris arasındaki bir etkileşim. Bu, hatalı numune okumalarına neden olur.
Numuneleri sadece 2-5 kat seyreltmek matris etkisini azaltır, numuneleri seyreltirken standart eğri için kullanılanla aynı seyrelticiyi kullanmayı unutmayın.
KAYNAK: Bilgiler buradan alınmıştır.