This translation into Turkish was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages
Unitat Biologia Cellular (Facultat de Biociències), Universitat Autonoma de Barcelona
This article is a part ofJoVE General. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.Recommend JoVE to Your Librarian
Current Access Through Your IP Address
Current Access Through Your Registered Email Address
Costa-Borges, N., González, S., Ibáñez, E., Santaló, J. Collection and Cryopreservation of Hamster Oocytes and Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (25), e1120, doi:10.3791/1120 (2009).
Hayvan bakım ve prosedürleri, Barselona, İspanya Universitat Autonoma Hayvan ve İnsan Araştırma Etik Komitesi tarafından onaylanmış kurallar ve düzenlemelere göre yapılmıştır.
I. Oosit toplama
Fare embriyo toplanması için, dişi farelerde (Mus musculus; 6-8 hafta eski) daha sonra 5 IU hCG 48 saat takip ve erkek fareler ile evlendirilen PMSG 5 IU intraperitoneal superovulate indüklenen. Dişiler 24-26 servikal dislokasyon ile sakrifiye pronükleer, 2-hücre veya 4-hücreli aşamada embriyoların sırasıyla obtention hCG uygulandıktan sonra 44-46 veya 54-56 saat. Pronükleer embriyoların toplanması tam bir hamster oosit açıklandığı gibi yapılır. 2-hücre ve 4-hücreli aşamada Embriyolar KSOM-H orta [6] siyon hatası kızarma toplanır.
Not: Bu protokol sonrasında yaklaşık olarak 20 ila 30 oosit / embriyoların her kadın alınacak .
II. Dondurma ve çözme çözümler hazırlanması
Not: Çözüm I ve çözümler dondurma ve çözme sadece kendi kullanmadan önce hazır olmalıdır. Ancak, donma ve çözülme çözümler hazırlanması için kullanılacak sakaroz belirtilen miktarlarda avans ağırlıklı ve birkaç ay için 3 ml tüpler oda sıcaklığında muhafaza edilebilir.
III. Donma protokol
IV. Protokol Çözülme
Not: 6. ve 7. adımları sırasında çözülmüş oosit / embriyoların yavaş rehidrasyon için nedeniyle şişer göreceksiniz.
V. Temsilcisi Sonuçlar
Kriyoprezervasyon protokol burada bir hamster oosit için yaklaşık% 95 ve>% 90,% 85 ve fare B6CBAF1 embriyolar pronükleer, 2-hücre ve 4-hücreli aşamaları sırasıyla% 80, sağ kalım oranı sonuçlar bildirdi. Fare embriyoları çözme sonrası KSOM in vitro kültür, en az 70 ila% 80, en iyi kültür koşullarında blastosist aşamasına ulaşması gerekir.
(Saman) ve oosit / embriyo dondurma her deneyde bir kontrol grubu yer almasını tavsiye ederiz oosit / embriyo geri kalanında daha fazla manipülasyonları için kullanılan önce bu grup Çözülme. Kontrol grubunda sağkalım oranları beklenenden daha düşük ise, aynı partinin diğerine saman Çözülme. Bu ikinci grup için sağkalım oranları da düşük ise, bu dondurma çok kalan payet atın.
Bu protokol, bir hamster oosit ve fare embriyoları ile başarıyla Kriyoprezerve olabilir. Bir kez dondurulmuş, oosit / embriyoların sıvı nitrojen tanklarında süresiz saklanır ve istenilen herhangi bir yerde veya zamanda telafi edilebilir. Bu ihtiyaç duyulduğunda kullanmak örneklerin neredeyse hazır sahip olmanın avantajını sunar. Öte yandan, bu protokol de, canlı hayvan kolonileri bakımı, ekonomik ve güvenli bir alternatif olarak değerli fare suşları (transgenik hatları gibi), embriyo cryobanks oluşturmak için kullanılır. Bu protokol bir hamster oosit ve melez B6CBAF1 fare embriyoları cryopreserve optimize olduğunu not etmek önemlidir. -Çözülme sonrası sağkalım oranları farklı genetik geçmişleri olan fare embriyoları arasında farklılıklar dolayısıyla bakım, her tür veya oosit / embriyo gerginlik dondurulması koşulları değerlendirmek ve oosit nesil önce uygun protokol kurmak için alınmalıdır, 8,9 tarif edilmiştir veya embriyo cryobanks.
Hamster oosit sperm penetrasyon testi için ya da sperm kromozom analizi 10 ya da malzeme intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu (ICSI) yeni başlayanlar için pratik olarak insan yardımlı üreme kliniklerinde kullanılabilir . Öte yandan, fare B6CBAF1 hibrid embriyolar pronükleer veya 2-hücreli aşamada embriyo kültür ortamları veya kuluçka düzgün işleyişini kalitesini kontrol etmek için insan Yardımla üreme merkezleri ya da araştırma laboratuvarlarında kullanılır.
Bu çalışma, İspanyol Ministerio de educacion y Ciencia (BIO 2.006-11.792) ve Generalitat de Catalunya (2005-SGR00437) tarafından desteklenmiştir . Yazarlar medya hazırlanmasında Marc Puigcerver ve Jonatan Lucas kendi teknik yardım için teşekkür etmek istiyorum. Servei d'Estabulari tüm personeli, hayvan barınağı için kabul ve özellikle bu video kayıt ek katkı Juan Jose Martin ve Javier Benito. NCB Ciencia e Tecnologia ve SG, Portekizce Fundação para İspanyolca Ministerio de educacion y Ciencia bir adam bir adam .
|Name||Type||Company||Catalog Number||Comments|
|Material Name||Type||Company||Catalogue Number||Comment|
|French type mini-straw 0.25 ml||Mini-tub||13407/0010|
|hCG||Farma-Lepori, Spain||749036.4|
|Hyaluronidase||Sigma||H-3884|
|KSOM-H medium||Ref. [11]|
|Liquid Nitrogen||Air Liquide|
|Plastic plugs||Mini-tub||19046|
|PMSG||Intervet, Spain||1.614/8447|
|Propilenglycol||Fluka||82280|
|Sucrose||Merck||107687|
|Surgical Scissors||Aesculap||BC-060R; BG-061R|
|Thermo-sealer||SIZ||220|
|35 and 90 mm culture dishes||Nunc||153066; 150350|
|10 ml tubes||Greiner Bio-one||163160|
|Nitrogen tank||MVE, Cryogenics||XC 43/28|
|Programmable Freezer||Planner Products Ltd.||Kryo-10 Series III|
|Forceps||Aesculap||BD-331R; BD-053R; OC-020R|