Numune hazırlama; kromatografi sistemlerinde analitik süreçin önemli bir aşamasıdır. Doğru numune hazırlık basamakları kontaminasyonun önlenmesine yardımcı olur, doğruluğu artırır ve hatalı sonuç riskini azaltır.
Laboratuvarda analiz edilmek istenen yüzlerce farklı örnek çeşidi olabilir. Yüzlerce farklı örnek ise yüzlerce farklı maktis demektir. Farklı matrisler, farklı numune hazırlama teknikleri gerektirir.
Analistler için sıvı-sıvı ekstraksiyonu (LLE), katı faz ekstraksiyonu (SPE), katı-sıvı ekstraksiyonu (SLE) ve diğerleri gibi kromatografik yöntemler kullanan çeşitli numune hazırlama yöntemleri mevcuttur. Makalemizde sizler için bu teknikleri derledik.
Numune Hazırlama Yöntemleri;
Liquid-Liquid Extraction / Sıvı-Sıvı Ekstraksiyonu (LLE);
LLE numune hazırlama tekniği (sıvı-sıvı ekstraksiyonu) diğerlerine göre en çok bilinen ve yaygın olarak kullanılan yöntemdir. Çoğumuz üniversitede LLE yöntemini sıklıkla kullanmışızdır. LLE, sıvı bir çözücü kullanılarak sıvı bir matristen bir analit elde etmek için kullanılır. LLE, iki farklı çözücüde farklı çözünürlüklere sahip bileşikleri ayırmaya odaklanır. Ayırma için ayırma hunisi kullanılır. Ayırma hunisi, farklı polariteye sahip bileşikleri ayırır. Bu yöntem genellikle damıtma işlemini etkileyen bir azeotropik oluşumu nedeniyle damıtma imkânsız olduğunda kullanılabilir.
LLE yöntemi antibiyotikler, vitaminler, kokular, tuzlar ve petrol ürünleri gibi numuneleri hazırlamak için kullanılabilir. Bu nedenle LLE yöntemi, GC veya HPLC cihazları için numune hazırlamakta kullanılan en yaygın yöntemlerden birisi olmuştur.
LLE yönteminin avantajlarından bazıları şunlardır: ekstraksiyon yöntemi oldukça basittir, cam eşya ucuzdur, organik çözücüler tekrar kullanılabilir ve ekstrakt edilen karboksilik asitler çok saftır.
Ayrıca; bu yöntemin zayıf yanı, numuneyi çözmenin çok zaman almasıdır. Karıştırma işlemi nedeniyle çok güçlüyse, kırılması giderek zorlaşan bir emülsiyon oluşturur. Ayrıca çok fazla organik çözücü kullanılır, çok fazla cam eşya kullanılır ve çok fazla atık üretilir.
Solid-Liquid Extraction / Katı-Sıvı Ekstraksiyonu (SLE);
Katı bir matrisin sıvı bir çözücü tarafından çözüldüğü bir ayırma işlemidir. SLE’nin çalışma prensibi, kafein bileşiğini üretmek için kahve telvelerinin sıcak suda çözüldüğü kahve demleme ile aynıdır.
Bu arada laboratuvarda, analitleri numuneden çıkarmak için bir Soxhlet ekstraktörü kullanıyoruz. LLE numune hazırlama gibi, SLE de HPLC veya GC ekipmanı için uygundur. SLE genellikle gıda, ilaç ve kimya endüstrilerinde kullanılmaktadır. Ayrıca yağı petrol cevherlerinden ayırmak ve cevherlerden metalik tuzları yıkamak için de kullanılır
SLE’nin avantajları, çözünme işleminde karışma olmadığı için emülsiyon oluşamamasıdır. Ayrıca, ucuz reaktif maliyetleri, yüksek verim, doğru sonuçlar, yüksek numune verimi, LLE’ye kıyasla daha az solvent kullanılır.
Bununla birlikte, SLE’nin birkaç dezavantajı vardır. Sert dokulu numuneler için uygun değildir ve kalın bir ekstrakt elde etmek için döner bir buharlaştırıcıda buharlaştırılması gerektiğinden karmaşık bir işlemdir.
Solid-Phase Extraction / Katı Faz Ekstraksiyonu (SPE);
SPE numune hazırlama teknolojisinin (katı faz ekstraksiyonu) ortaya çıkışı, LLE yönteminde devrim yarattı. SPE’de analit ayırma ilkesi, SPE kolonunun durağan fazının analitleri solüsyonda tutmasıdır. Analit daha sonra daha konsantre bir konsantrasyon elde etmek için bir çözücü kullanılarak ayrılır.
SPE’nin avantajlarından bazıları şunlardır: SPE ekstraksiyonu için gereken süre nispeten hızlıdır, yalnızca yaklaşık 30 dakikadır, süreç de basittir ve sistem manuel veya otomatik yürütülebilir. Ayrıca SLE ve LLE’den daha iyi geri kazanım sağlanır, emülsiyon oluşumunu ortadan kaldırır, daha az organik çözücü kullanır ve seçiciliği ve tekrarlanabilirliği artırır.
SPE, analitin ayrılmasında LLE’den farklıdır. SPE’de analitler, katı durağan bir faz ile etkileşime girerek ayrılır. Üç tip SPE mevcuttur: normal faz, ters faz ve iyon değişimi. Bu üç faz polar, polar olmayan ve yüklü bileşikler için kullanılır.
SPE yöntemleri çevre, endüstriyel, ilaç, gıda ve denizcilik sektörlerindedir. Sıklıkla idrar, kan, yumurta, bal, anne sütü ve kırmızı şarabı matrikslerden ayırmak için kullanılır. Bu ekstraksiyon, GC veya HPLC ekipmanı kullanılarak daha fazla analiz yapılmadan önce kullanılabilir. Bazı araştırmacılar, SPE prosedürünün zayıf yönlerine, zaman alıcı ve karmaşık bir yöntem olduğuna ve kartuş değiştirmenin zahmetli olduğuna dikkat çekmişlerdir.
QECCHERS;
Aşırı cam eşya kullanımı, yüksek işçilik gereksinimleri ve düşük verimle ilgili endişeler, araştırmacıları daha verimli ekstraksiyon yöntemleri bulmaya yöneltiyor.
QuEChERS, Hızlı, Kolay, Ucuz, Etkili, Dayanıklı ve Güvenli anlamına gelir. Bu yöntem, başta kartuş maliyeti olmak üzere SPE’nin sorunlarının üstesinden gelen dağıtıcı SPE’dir.
QuEChERS çeşitli avantajlar sunar: yüksek geri kazanım, doğru sonuçlar, büyük numune hacmi, düşük çözücü ve cam malzeme kullanımı, daha az işçilik ve daha düşük reaktif maliyetleri. Bununla birlikte, düşük nem veya yüksek yağ içeriğine sahip numuneler için temizleme etkisi ideal değildir, ekstraksiyon verimliliği düşüktür ve temizleme işleminin eksiklikleri vardır. Bu test hazırlığı kan gıdalarında, zeytinyağında, tahıllarda, sütte, balıkta ve ilaçlarda pestisit kalıntılarının tespiti için uygundur. QuEChERS, GC analizi yapmak için tasarlanmıştır.
Accelerated Solvent Extraction / Hızlandırılmış Solvent Ekstraksiyonu (ASE);
ASE, organik bileşikleri katı veya yarı katı bir matristen sıvı bir çözücü ile ekstrakte eden bir ekstraksiyon yöntemidir. Bal, pestisitler, TPH, portakal kabuğundaki hesperidin ve dioksin içeren numuneler ekstraksiyon için uygundur.
ASE numune hazırlamanın avantajları; otomatik sistem, Soxhlet ve ultrasonik ekstraksiyona göre daha hızlı ekstraksiyon süresi, kullanım kolaylığı, diğer ekstraksiyon yöntemlerine göre daha az P – 90 solventi ve daha az insan kaynağı ihtiyacıdır.
Uçucu Maddeler İçin Numune Hazırlık Yöntemleri;
Static Headspace / Statik Üst Boşluk (SHS);
Üst boşluk (Headspace); kapalı kromatografi şişesindeki numunenin gaz fazı veya buhar kısmıdır.
SHS, uçucu ve yarı uçucu analitleri sıvılardan ayırmak için kullanılır. SHS yöntemi, GC ekipmanında katı veya sıvı numunelerin ayrılmasına uygulanabilir.
SHS’de, numune kapalı bir şişeye konur ve ısıtılır. Uçucu bileşenler numune matrisinden şişenin üst boşluğuna geçer. Headspace’in bir kısmı daha sonra örneklenir ve analiz için GC’ye iletilir. Bu yöntemi kullanarak kandaki alkol içeriğini, ilaç çözücü kalıntılarını, yiyecek ve içeceklerin tadını, parfüm ve deterjanların aromalarını tespit edebilirsiniz. Öte yandan, SPS genellikle çok yoğun numuneler için ek bir tarama yöntemi olarak kullanılır. Bu numune hazırlama işlemi kolay ve hızlıdır. Bu nedenle, kullanılan solvent ve reaktif miktarı nispeten azdır.
Purge and Trap / Temizleme ve Yakalama (P+T);
Temizle ve yakala tekniği, GC ekipmanı kullanarak VOC’leri analiz eder. PT, 1970’lerde Cincinnati’de geliştirildi.
PT’de üç ana süreç vardır, yani ekstraksiyon (saflaştırma), birlikte adsorpsiyon (tutma), ardından desorpsiyon (ısıtma). PT, uçucu organik bileşikler (VOC’ler) içeren bir numuneden bir inert gazın bir adsorban tuzağına atılmasını içerir. VOC’ler daha sonra analitin ısıtılması ve GC kolonuna aktarılması yoluyla tuzak tarafından emilir.
Bu teknoloji, VOC’leri sudan, topraktan ve çamurdan uzaklaştırmak ve yoğunlaştırmak için idealdir. P-T, SHS’den daha hassastır. Daha fazla numune de analiz edilebilir. Bu nedenle, ppb’den ppt’ye kadar tespit limitleri nedeniyle iz analizi için uygundur. Ancak PT donanımı, SHS’den daha karmaşıktır.
Solid-Phase Micro Extraction / Katı Faz Mikro Özütleme (SPME);
SPME, 1987’de Pawliszyn ve Liu tarafından keşfedildi. SPME numune hazırlama tekniği, SLE hazırlamanın bir varyasyonudur. SPME solventsiz numune hazırlamadır. SPME, kan, serum, kanalizasyon, yeraltı suyu ve kas gibi numunelerden uçucu ve yarı uçucu bileşikleri hedeflemek için silika lifleri silika lifi katmanları kullanır.
Bu ekstraksiyon yönteminin uygulamaları arasında çevresel, biyolojik, farmasötik, yiyecek ve içecek, tatlar ve parfümler, adli tıp ve toksikoloji yer alır. Bu ekstraksiyon yönteminin avantajlarından bazıları solvent içermemesi, otomatikleştirilmesinin kolay olması, numuneye zarar vermemesi, hemen hemen tüm matrislere uygulanabilmesi, kullanılan liflerin tekrar kullanılabilir ve ucuz olması, küçük boyutlu liflerin onları saha çalışmasına uygun hale getirmesi ve GC veya HPLC ile uyumlu olmasıdır.
Numune hazırlama ve aksesuarlarla ilgili başka sorularınız varsa, lütfen email@example.com adresinden ekibimizle görüşebilirsiniz.
Referanslar:
aurorabiomed.com
chromatographyonline.com
affinisep.com
labmate-online.com
analyteguru.com