İçindekiler
- ELISA Çalışma Prensibi
- Doğrudan ELISA Testi
- Dolaylı ELISA Testi
- Sandviç ELISA Testi
- Rekabetçi ELISA Testi
ELISA bir antijen antikor reaksiyonudur. 1971’de ELISA, İsveç’teki Stockholm Üniversitesi’nde Peter Perlmann ve Eva Engvall tarafından tanıtıldı. Genellikle kandaki antikor veya antijen konsantrasyonunu ölçmek için kullanılan yaygın bir laboratuvar tekniğidir.
ELISA, peptitler, proteinler, antikorlar ve hormonlar gibi maddelerin saptanması ve ölçülmesi için kullanılan bir plaka bazlı analiz tekniğidir. Bir antikor ile konjuge edilen bir enzim, renkli bir ürün elde etmek için renksiz substratla reaksiyona girer. Bu tür substrat kromojenik substrat olarak adlandırılır. ELISA için alkalin fosfataz, peroksidaz ve beta galaktosidaz gibi bir dizi enzim kullanılmıştır. Renkli son ürün vermek için orto-fenildiamin dihidroklorür (peroksidaz için), paranitrofenil fosfat (alkalin fosfataz için) gibi spesifik substratlar kullanılır.
ELISA Çalışma Prensibi
ELISA’lar tipik olarak 96 oyuklu polistiren plakalarda gerçekleştirilir. Serum bir kuyucuk içinde inkübe edilir ve her oyuk farklı bir serum içerir. Test edilen 96 örnek arasında bir pozitif kontrol serumu ve bir negatif kontrol serumu yer alacaktır. Serumda bulunan antikorlar veya antijenler, karşılık gelen antijen veya katı yüzeye kaplanan antikor ile yakalanır.
Bir süre sonra, plaka bir dizi yıkama tamponu ile serum ve bağlanmamış antikorları veya antijenleri çıkarmak için yıkanır. Bağlı antikorları veya antijenleri tespit etmek için, her bir oyuğa peroksidaz veya alkalin fosfataz gibi bir enzime bağlanan bir ikincil antikorlar eklenir. Bir inkübasyon periyodundan sonra, bağlanmamış ikincil antikorlar yıkanır. Uygun bir substrat eklendiğinde, enzim bir renk üretmek için onunla reaksiyona girer. Bu renk, verilen örnekte bulunan antijen veya antikorların bir fonksiyonu veya miktarı olarak ölçülebilir. Renk / optik yoğunluğu 450nm’de ölçülür. Rengin yoğunluğu, antijen veya antikor miktarının bir göstergesidir.
Sıklıkla Antikor ve Antijen arasındaki bağlanma yapısı temelinde 4 tip ELISA vardır.
Doğrudan ELISA Testi
Doğrudan Elisa, tek bir antijen seti ve reaksiyona girecek bir dizi antikorun bulunduğu bir tiptir. Bu ELISA yönteminde, Elisa plakalarına sabitlenen hasta numunesinden gelen antijenler, bir işaretleyici enzime etiketlenmiş bir antikor numunesi ile reaksiyona sokularak hazırlanır. Testte antijene direkt olarak enzim bağlantılı bir antikor eklenir, böylece dışsal olarak eklenen substrat yani Elisa reaktifi ile bir renk reaksiyonu elde edilir.
Dolaylı ELISA Testi
Antikor dolaylı ELISA ile tespit edilebilir veya kantitatif olarak belirlenebilir. Bu teknikte, antijen mikrotitre kuyucukta kaplanır. Primer antikor içeren serum veya başka bir numune mikrotitre kuyusuna ilave edilir ve kaplanmış antijen ile reaksiyona girmesine izin verilir. Herhangi bir serbest primer antikor yıkanır ve antijene bağlanan antikor, birincil antikora bağlanan bir enzim konjuge ikincil antikoru ekleyerek saptanır. Bağlanmamış ikincil antikor daha sonra yıkanır ve enzim için spesifik bir substrat eklenir. Enzim, renkli ürünleri oluşturmak için substratı hidrolize eder. Renkli son ürünün miktarı, 96 gözlü plakanın tüm kuyucuklarının absorbansını ölçebilen spektrofotometrik plaka okuyucuları tarafından ölçülür.
Dolaylı ELISA Testinin Prosedürü
- Mikro titre plaka kuyucuklarını antijenle kaplayın.
- Yanlış pozitif sonuçları önlemek için tüm ilişkisiz siteleri engelleyin.
- Tüplere antikor içeren örnek (örneğin tavşan monoklonal antikoru) ekleyin ve plakayı 37 ° C’de inkübe edin.
- Plakayı yıkayın, böylece bağlanmamış antikor çıkarılır.
- Bir enzime konjuge edilmiş ikincil antikor ekleyin (örn. Anti-fare IgG).
- Plakayı yıkayın, böylece bağlanmamış enzim bağlantılı antikorlar çıkarılır.
- Renkli bir ürün üretmek için enzim tarafından dönüştürülen substrat ekleyin.
- Bir substratın enzim ile reaksiyona girmesiyle renkli bir ürün elde edilir.
Dolaylı ELISA Testinin Avantajları
- Artmış duyarlılık, birden fazla etiketli antikor birincil antikor başına bağlıdır.
- Çok çeşitli etiketli ikincil antikorlar ticari olarak temin edilebilir.
- Birincil antikorun maksimum immünoreaktivitesi, etiketlenmediği için korunur.
- Çok yönlü olduğundan, birçok tür antikor bir tür içerisinde üretilebilir ve aynı etiketli ikincil antikor tespit için kullanılabilir.
- Esneklik, çünkü farklı birincil tespit antikorları tek bir işaretli ikincil antikor ile kullanılabilir.
- Daha az etiketli antikorlar gerekli olduğundan maliyeti düşüktür.
- Aynı birincil antikor ile farklı görselleştirme belirteçleri kullanılabilir.
Dolaylı ELISA Testinin Dezavantajları
- Çapraz reaktivite, sekonder antikor ile ortaya çıkabilir ve nonspesifik bir sinyale neden olur.
- Prosedürde ek bir inkübasyon adımı gereklidir.
Sandviç ELISA Testi
Antijen, sandviç ELISA ile tespit edilebilir. Bu teknikte, antikor mikrotitre kuyucukta kaplanır. Tüplere bir antijen içeren bir numune eklenir ve tüpe eklenen antikor ile reaksiyona girerek antijen-antikor kompleksi oluşturur. Tüp yıkandıktan sonra, antijen üzerindeki farklı bir epitopa özgü ikinci bir enzim-bağlantılı antikor eklenir ve bağlı antijen ile reaksiyona girmesine izin verilir. Sonra bağlanmamış ikincil antikor yıkandıktan sonra. Son olarak, substrat, renkli ürünler oluşturmak için enzim tarafından hidrolize edilen plakaya eklenir.
Sandviç ELISA Testinin Prosedürü
- Bilinen bir miktar antikorun bağlandığı bir yüzey hazırlayın.
- Antijeni içeren numuneyi plakaya ekleyin ve plakayı 37 ° C’de inkübe edin.
- Plakayı yıkayın, böylece bağlanmamış antijen çıkarılır.
- Antijene özgü olan ve daha sonra 37 ° C’de inkübe olan enzim bağlantılı antikorları ekleyin.
- Plakayı yıkayın, böylece bağlanmamış enzim bağlantılı antikorlar çıkarılır.
- Renkli bir ürün üretmek için enzim tarafından dönüştürülen substrat ekleyin.
- Bir substratın enzim ile reaksiyona girmesiyle renkli bir ürün elde edilir.
Sandviç ELISA Testinin Avantajları
- Yüksek özgüllük, iki antikor kullanıldığı için antijen özel olarak yakalanır ve tespit edilir.
- Antijen, ölçümden önce saflaştırmaya ihtiyaç duymadığından karmaşık örnekler için uygundur.
- Esneklik ve duyarlılık, hem doğrudan hem de dolaylı tespit yöntemleri kullanılabilir.
Sandviç ELISA Testinin Dezavantajı
- Antikor kombinasyonu optimizasyonu zor olabilir. Her bir antikor, hedef protein üzerindeki spesifik bir epitop ile reaksiyona girmeli ve partner antikoru ile çapraz reaksiyona giremez.
Rekabetçi ELISA Testi
Bu test, bir numunedeki bir antijenin konsantrasyonunu ölçmek için kullanılır.
Bu testte, antikor ilk olarak solüsyonda antijen içeren bir örnekle inkübe edilir. Antijen-antikor karışımı daha sonra antijen ile kaplanmış olan mikrotitre kuyucuklarına eklenir. Numunede bulunan antijen ne kadar fazla olursa, antijen kaplı kuyuya bağlanmak için daha az serbest antikor mevcut olacaktır. Tüp yıkandıktan sonra, kuyuya bağlanan birincil antikor miktarını belirlemek için birincil antikorun izotipine özgü enzim eşlenik ikincil antikoru eklenir. Örnekte antijen konsantrasyonu ne kadar yüksek olursa, absorbans azalır.
Rekabetçi ELISA Testinin Prosedürü
- Antikor, antijen içeren örnekle inkübe edilir.
- Antijen-antikor kompleksi, antijen ile önceden kaplanmış olan mikrotitre kuyucuklarına eklenir.
- Bağlanmamış antikoru çıkarmak için plakayı yıkayın.
- Birincil antikora özgü enzim bağlantılı ikincil antikor eklenir.
- Plakayı yıkayın, böylece bağlanmamış enzim bağlantılı antikorlar çıkarılır.
- Enzim tarafından bir floresan sinyaline dönüştürülen substrat ekleyin.
Rekabetçi ELISA Testinin Avantajları
- Yüksek duyarlılık, hem doğrudan hem de dolaylı tespit yöntemleri kullanılabilir.
- Antijen, ölçümden önce saflaştırmaya ihtiyaç duymadığından karmaşık örnekler için uygundur.