1 Serbest radikaller ve reaktif oksijen cisimleri Yrd. Doç .Dr. Omca DEMİRKOL
2 Oksijen toksik bir gazdır Oksijen toksik bir gazdır. Bu toksiditenin birincil sebebi oksijenin hücre içi redüksiyonlarla oldukça reaktif cisimlere veya serbest radikallere dönüşmesidir. Ancak serbest radikaller aerobik metabolizmanın doğal bir ürünüdür.
3 Hücre tarafından kullanılan oksijenin 2-3% si serbest radikallere dönüştürülür.
4 Organizmada normal metabolik yolların işleyişi sırasında veya çevresel ajanlar (pestisidler, aromatik hidrokarbonlar, toksinler, çözücüler vb.), stres, radyasyon gibi çeşitli dış faktörlerin etkisiyle serbest radikaller meydana gelmektedir.
5 Serbest radikaller dış orbitallerinde ortaklanmamış elektron bulunduran, kısa ömürlü, reaktif moleküllerdir.
6 Serbest radikallerin en önemlileri süperoksit radikali (O2 ●-), hidroksil radikali (OH ●), singlet oksijen (1O2) ve radikalik olmayan hidrojen peroksit (H2O2) ve peroksinitrit (ONOO-) dir.
7 Hücrede oluşan reaktif oksijen türleri (ROT), "antioksidan savunma sistemleri" veya kısaca "antioksidanlar" olarak bilinen mekanizmalarla ortadan kaldırılırlar
8 Ancak bazen hücresel savunma mekanizması vasıtasıyla ortadan kaldırılandan daha fazla ROT oluşabilir. Organizmada Hücresel savunma mekanizması vasıtasıyla ortadan kaldırılandan daha fazla ROT meydana gelmesi oksidatif stres olarak tanımlanır.
10 ROT’lar organizmada lipidler, nükleik asitler, proteinler ve karbonhidratlar gibi biyolojik moleküllerle kolayca reaksiyona girebilirler. Bu yüzden yaşlanma, kanser, kardiyovasküler hastalıklar, immün sistem hastalıkları, katarakt, diyabet, böbrek ve karaciğer hastalıkları gibi pek çok hastalıktan sorumlu tutulurlar
11 Oksitatif stres çalışmalarında serbest radikallerin artışı veya antioksidan savunma sistemlerinin yetersizliği araştırılmaktadır. Bunun için plazma, serum, eritrosit, doku örnekleri gibi çeşitli materyallerde analiz yapmaya uygun yöntemler geliştirilmiştir.
12 Serbest radikaller son derece reaktif ve kısa ömürlüdürler Serbest radikaller son derece reaktif ve kısa ömürlüdürler. Bu yüzden direkt olarak ölçülmeleri zordur. Serbest radikalleri direkt olarak ölçen tek analitik teknik spin rezonans spektrometresidir.
13 Spin rezonans spektrometresi ileri teknik donanım gerektirir, ayrıca çok duyarlı olmaması ve mikromolar düzeyde sabit konsantrasyonlarda serbest radikaller gerektirmesi nedeniyle kullanımı yaygın değildir.
14 Serbest radikal üretimi artışının belirlenmesi için bunların lipidlerle, proteinlerle ve DNA ile reaksiyonları sonucu oluşan çeşitli ürünlerin ölçümü gibi indirekt yöntemler kullanılır. Bu yöntemler arasında lipid peroksidasyonunun son ürünlerinin ölçümü en çok kullanılan yöntemdir.
15 Oksijen ToksisitesiOksijenin canlılardaki toksik etkileri başlıca iki tür mekanizma ile gerçekleşir:Moleküler oksijenin bazı enzimleri inhibe etmesiSerbest oksijen radikalleri
16 Oksijen bazı enzimleri reaktif türlerinden bağımsız olarak doğrudan inhibe edebilir. Örneğin nitrojen fiksasyonunu katalizleyen nitrojenaz enzimleri ve CO2 fiksasyonunu katalizleyen enzim olan ribuloz bifosfat karboksilaz, oksijen tarafından inhibe edilirler.
17 Aerobik hayat için gerekli olan oksijen molekülü solunum ve enerji metabolizması için zorunlu olmasının yanında birçok olumsuz sonuçlar da meydana getirmektedir. Aerobik organizmalar oksijenin bu olumsuz etkileriyle de savaşmak zorundadırlar.
18 Fakat oksijenin esas toksik etkisi reaktif türevlerinden kaynaklanmaktadır. Oysaki bazal düzeyindeki moleküler oksijen reaktif değildir ve organik moleküllerle rahatlıkla birlikte bulunabilir.
19 Sadece insan ve diğer aerob canlılar elekron transport zincirleri geliştirdiği ve diğer enzim sistemleri bunu kullandığı için oksijenin bu toksik etkisini tolere edebilir.
20 Bu özelliği, moleküler oksijenin eşleşmemiş iki elektronunun paralel dönmesiyle açıklanır ve bu dönme sınırlaması radikal olmayan bileşiklerle onun reaksiyona girmesine etkili bir engel oluşturur.
21 Bir serbest radikal herhangi bir kimyasal yapıda (atom, iyon, veya molekül) olabilir. Bu kimyasallar, eşleşmemiş veya tek sayılı elektron içerirler.
22 Radikaller Nasıl Oluşur? Radikaller başlıca 3 temel mekanizma ile oluşur:Kovalent bağların homolitik kırılması ile: Yüksek enerjili elektromanyetik dalgalar ve yüksek sıcaklık ( °C) kimyasal bağların kırılmasına neden olur. Kırılma sırasında bağ yapısındaki iki elektronun her biri ayrı ayrı atomlar üzerinde kalıyorsa, bu tür kırılmaya homolitik kırılma denir ve her iki atom üzerinde de paylaşılmamış elektron kalır. Organik moleküllerdeki bağların heterolitik kırılması durumunda zıt yüklü iyon çiftleri oluşur ve bu türler de reaktiftir.
23 Normal bir molekülün elektron kaybetmesi ile: Radikal özelliği bulunmayan bir molekülden elektron kaybı sırasında dış orbitalinde paylaşılmamış elektron kalıyorsa, radikal formu oluşur. Örneğin; askorbik asit, glutatyon ve tokoferoller gibi hücresel antioksidanlar, radikal türlere tek elektron verip radikalleri indirgerken, kendilerinin radikal formu oluşur.Normal bir moleküle elektron transferi ile: Örneğin, moleküler oksijenin tek elektron ile indirgenmesi, radikal formu olan süperoksidin oluşumuna neden olur.
24 Son yıllarda oksijenden türemiş serbest radiklaller ile çeşitli hastalıklar arasındaki ilişki üzerine yapılan çalışmaların sayısı giderek artmaktadır.
25 En basit serbest radikal hidrojen elementinin bir atomudur En basit serbest radikal hidrojen elementinin bir atomudur. Serbest radikal olarak sınıflandırılan hidrojen atomu bir proton ve bir eşleşmemiş elektron taşır.
26 Moleküler oksijenin özellikleri Moleküler oksijen (O2), paralel spin durumlu iki ortaklanmamış (eşleşmemiş) elektrona sahiptir.
27 Ortaklanmamış (eşleşmemiş) elektron içeren atom, atom grubu veya moleküller serbest radikal olarak tanımlanırlar.Serbest radikal tanımına göre moleküler oksijen, bir biradikal (diradikal) olarak değerlendirilir. Biradikal oksijen, radikal olmayan maddelerle yavaş reaksiyona girdiği halde diğer serbest radikallerle kolayca reaksiyona girer.
28 Ortaklanmamış (eşleşmemiş) elektron içeren atom, atom grubu veya moleküller serbest radikal olarak tanımlanırlar. Ancak Fe3+, Cu2+, Mn2+ ve Mo5+ gibi geçiş metalleri de ortaklanmamış elektronlara sahip oldukları halde serbest radikal olarak kabul edilmezler, fakat serbest radikal oluşumunda önemli rol oynarlar.
29 Serbest radikaller pozitif yüklü (katyon), negatif yüklü (anyon) veya elektriksel olarak nötral olabilirler.
30 Bu maddelerin başka maddelerden elektron kazanma eğilimi göstermesi, maddeyi ileri derecede reaktif hale getirir.Bununla beraber singlet oksijen, H2O2 ve NO gibi maddeler serbest radikal değildir.“Reactive Oxygen Species” terimi (ROS) hem O2. – (süperoksid) ve OH. (hidroksil) gibi serbest radikalleri hem de H2O2 (hidrojen peroksid) ve HOCl (hipokloröz asit) gibi nonradikal oksijen derivelerini tanımlar
32 Reaktif oksijen türleri 3 major tip ROT vardır. Bunlar:1-Superoksit (O2•-),2-Hidrojen perosit (H2O2)3-Hidroksil (OH•)
33 SüperoksitSüperoksit, ATP üretimi sırasında oluşur ve immün sistemde üretildiğinde virüs, bakteri ve kanser hücrelerini yok ettiği için faydalıdır.Büyük miktarda üretildiğinde ise lipit, protein ve DNA hasarına neden olur.
34 Süperoksit radikali (O2⋅−) Süperoksit radikali (O2⋅−) hemen tüm aerobik hücrelerde moleküler oksijenin (O2) bir elektron alarak indirgenmesi sonucu oluşur. İndirgenmiş geçiş metallerinin otooksidasyonu, süperoksit radikali meydana getirebilir.
35 Elektron transfer reaksiyonlarıyla oksidantların oluşumu
40 Süperoksit radikali kendisi direkt olarak zarar vermez Süperoksit radikali kendisi direkt olarak zarar vermez. Bu radikal anyonun asıl önemi, hidrojen peroksit kaynağı olması ve geçiş metalleri iyonlarının indirgeyicisi olmasıdır.Süperoksit radikali düşük pH değerlerinde daha reaktifdir, perhidroksi radikali (HO2•) oluşturmak üzere protonlanır.
41 Süperoksit radikali ile perhidroksi (HO2•) radikali birbirleriyle reaksiyona girince biri okside olur diğeri indirgenir. Bu dismutasyon reaksiyonunda moleküler oksijen ve hidrojen peroksit meydana gelir.
42 Süperoksit radikalinin fizyolojik bir serbest radikal olan nitrik oksit (NO•) ile birleşmesi sonucu bir reaktif oksijen türü olan peroksinitrit (ONOO−) meydana gelir. Peroksinitrit, nitrit (NO2−) ve nitrat (NO3−) oluşturmak üzere metabolize edilir. Peroksinitrit, azot dioksit (NO2•), hidroksil radikali (OH•), nitronyum iyonu (NO2+) gibi toksik ürünlere dönüşebilir ki nitrik oksitin (NO•) zararlı etkilerinden peroksinitrit sorumludur.
44 2-Hidrojen peroksit (H2O2) Süperoksitin dismutasyonu hidrojen peroksit formasyonuyla sonuçlanır.Bazı oksidazlar direk olarak hidrojen peroksitleri genere ederler.
45 Hidrojen peroksit (H2O2) Hidrojen peroksit (H2O2), süperoksidin çevresindeki moleküllerden bir elektron alması veya moleküler oksijenin çevresindeki moleküllerden iki elektron alması sonucu oluşan peroksitin iki proton (H+) ile birleşmesi sonucu meydana gelir.
48 Biyolojik sistemlerde hidrojen peroksidin asıl üretimi, süperoksidin (O2⋅−) dismutasyonu ile olur. İki süperoksit molekülü, süperoksidin dismutasyonu reaksiyonunda iki proton alarak hidrojen peroksit ve moleküler oksijeni oluştururlar.
49 Bu reaksiyon, radikal olmayan ürünler meydana geldiğinden dismutasyon reaksiyonu olarak bilinir, ya spontan gerçekleşir ya da süperoksit dismutaz (SOD) enzimi tarafından katalizlenir. Spontan dismutasyon pH 4,8'de en hızlıdır, enzimatik dismutasyon ise spontan dismutasyonun nispeten yavaş olduğu nötral ya da alkali pH'da daha belirgindir.
50 Hidrojen peroksit bir serbest radikal olmadığı halde ROT kapsamına girer ve serbest radikal biyokimyasında önemli bir rol oynar. Çünkü Fe2+ veya diğer geçiş metallerinin varlığında Fenton reaksiyonu sonucu, O2⋅− varlığında Haber-Weiss reaksiyonu sonucu en reaktif ve zarar verici serbest oksijen radikali olan hidroksil radikali (OH•) oluşturur.
51 Haber-Weiss reaksiyonu süperoksidin direkt olarak H2O2 ile reaksiyonudur, katalizörsüz reaksiyon oldukça yavaş ilerler. Demirle katalizlenen ikinci şekli ise çok hızlıdır. Bu reaksiyonda önce ferri demir (Fe3+) süperoksit tarafından ferro demire (Fe2+) indirgenir. Sonra Fenton reaksiyonu ile H2O2’den OH● ve OH- üretilir.
54 Süperoksit radikalinin lipid solubilitesi sınırlı olduğu halde hidrojen peroksit lipid solubldur. Bu nedenle hidrojen peroksit kendisinin oluştuğu yerden uzakta olan fakat Fe2+ içeren membranlarda hasar oluşturabilir.
55 Hidroksil iyonlarıOldukça reaktif olan hidroksil iyonları pürin ve pirimidinlerde değişikliğie sebep olabilir, DNA iplikçiklerini kırarak hasar oluşturur.
56 Hidroksil radikali (OH•) Hidroksil radikali (OH•) Fenton reaksiyonu ve Haber-Weiss reaksiyonu sonucu hidrojen peroksitten oluşmaktadır.Son derece reaktif bir oksidan radikaldir, büyük olasılıkla ROT ların en güçlüsüdür. Oluştuğu yerde tiyoller ve yağ asitleri gibi çeşitli moleküllerden bir proton kopararak tiyil radikalleri (RS•), karbon merkezli organik radikaller (R•), organik peroksitler (RCOO•) gibi yeni radikallerin oluşmasına ve sonuçta büyük hasara neden olur.
57 Suyun yüksek enerjili iyonlaştırıcı radyasyona maruz kalması sonucu da oluşur.
59 Singlet Oksijen (1O2)Moleküler oksijen (atmosferik oksijen) dış orbitallerinde paylaşılmamış iki elektron içerir. Bu elektronlar, spinleri aynı yönde ve farklı orbitallerde iken minimum enerji seviyesindedirler.
60 Diradikal oksijenin elektronlarından birinin enerji alarak kendi spininin ters yönünde olan başka bir orbitale yer değiştirmesiyle singlet oksijen oluşur. Singlet oksijen, eşleşmemiş elektronu olmadığı için radikal olmayan reaktif oksijen molekülüdür, delta ve sigma olmak üzere iki şekli vardır.
69 Serbest oksijen radikallerinin etkileri Reaktif oksijen türlerinin (ROT) oluşumu enflamasyon, radyasyon, yaşlanma, ozon (O3) ve azot dioksit (NO2•), kimyasal maddeler ve ilaçlar gibi bazı uyarıların etkisiyle artar.
70 Serbest radikaller hücrelerin lipit, protein, DNA, karbonhidrat ve enzim gibi tüm önemli bileşiklerine etki ederler.
71 Süperoksit radikali (O2⋅−) ve hidroksil radikali (OH•) sitoplazma, mitokondri, nükleus ve endoplazmik retikulum membranlarında lipid peroksidasyonunu başlatır. Membranlarda lipid peroksidasyonu meydana gelmesi sonucu membran permeabilitesi artar.
72 Serbest radikallerin etkisiyle proteinlerdeki sistein sülfhidril grupları ve diğer amino asit kalıntıları okside olarak yıkılır, nükleer ve mitokondriyal DNA okside olur.
73 Serbest oksijen radikallerinin tüm bu etkilerinin sonucunda hücre hasarı olur. Hücrede reaktif oksijen türlerinin (ROS) ve serbest radikallerin artışı hücre hasarının önemli bir nedenidir
76 Serbest radikallerin lipidlere etkileri Lipidler serbest radikallerin etkilerine karşı en hassas olan biyomoleküllerdir. Hücre membranlarındaki kolesterol ve yağ asitlerinin doymamış bağları, serbest radikallerle kolayca reaksiyona girerek peroksidasyon ürünleri oluştururlar.
77 Poliansatüre yağ asitlerinin oksidatif yıkımı lipid peroksidasyonu olarak bilinir. Lipid peroksidasyonu kendi kendini devam ettiren zincir reaksiyonu şeklinde ilerler ve oldukça zararlıdır
78 Hücre membranlarında lipid serbest radikalleri (L•) ve lipid peroksil radikallerinin (LOO•) oluşması, reaktif oksijen türlerinin (ROS) neden olduğu hücre hasarının önemli bir özelliği olarak kabul edilir.
79 Serbest radikallerin sebep olduğu lipid peroksidasyonuna "nonenzimatik lipid peroksidasyonu" denir.
80 Hücre membranlarında lipid peroksidasyonuna uğrayan başlıca yağ asitleri poliansatüre yağ asitleridir. Lipid peroksidasyonu genellikle yağ asitlerindeki konjuge çift bağlardan bir elektron içeren hidrojen atomlarının çıkarılması ve bunun sonucunda yağ asidi zincirinin bir lipid radikali niteliği kazanmasıyla başlar.
82 Lipid radikali (L•) dayanıksız bir bileşiktir ve bir dizi değişikliğe uğrar. Lipid radikallerinin (L•) moleküler oksijenle (O2) etkileşmesi sonucu lipid peroksil radikalleri (LOO•) oluşur. Lipid peroksil radikalleri (LOO•), membran yapısındaki diğer poliansatüre yağ asitlerini etkileyerek yeni lipid radikallerinin oluşumuna yol açarken kendileri de açığa çıkan hidrojen atomlarını alarak lipidperoksitlerine (LOOH) dönüşürler ve böylece olay kendi kendini katalizleyerek devam eder.
85 Lipid peroksidasyonu sonucu oluşan lipid peroksitlerinin (LOOH) yıkılımı geçiş metalleri iyon katalizini gerektirir. Plazma membranı ve subsellüler organel lipid peroksidasyonu serbest radikal kaynaklarının hepsiyle uyarılabilir ve geçiş metallerinin varlığında artar. Lokal olarak hidrojen peroksitten (H2O2) Fenton reaksiyonu sonucu hidroksil radikali (OH•) oluşması zincir reaksiyonunu başlatabilir.
86 Lipid peroksitleri (LOOH) yıkıldığında çoğu biyolojik olarak aktif olan aldehitler oluşur. Bu bileşikler ya hücre düzeyinde metabolize edilirler veya başlangıçtaki etki alanlarından diffüze olup hücrenin diğer bölümlerine hasarı yayarlar.
87 Üç veya daha fazla çift bağ içeren yağ asitlerinin peroksidasyonunda malondialdehit (MDA) meydana gelir.Malondialdehit (MDA)
88 MDAMalondialdehit (MDA) kanda ve idrarda ortaya çıkar, yağ asidi oksidasyonunun spesifik ya da kantitatif bir indikatörü olmamakla beraber lipid peroksidasyonunun derecesiyle iyi korelasyon gösterir..
89 Stabil olmayan lipit peroksitlerinin indirgenmiş ürünüdür Stabil olmayan lipit peroksitlerinin indirgenmiş ürünüdür. Bu lipit peroksidasyon yan ürünü oksidatif stresin neden olduğu lipit peroksidasyon derecesini gösterdiği için oksidatif stres çalışmalarında ölçülür