PCR testi ile ilgili araştırmalar hızlandı. Korona virüsle mücadelede kullanılan yöntemler arasında PCR testi de yer alıyor. PCR bir tanı testi olarak bilinmektedir ve korona virüste de virüse ait RNA'yı göstermektedir. Yani korona virüs sürecinde, vücuttaki virüsün kimliğini göstermek için yapılan bir testtir. Peki, PCR testi nasıl yapılır? İşte konu ile ilgili detaylar…
PCR nasıl kullanılır
PCR’nin en önemli uygulaması ya DNA’yı çoğaltmak, nicelendirmek ya da aynı reaksiyonda her ikisini birden yapmaktır. Konvansiyonel PCR’de, ilgilenilen DNA, birden fazla kopyasını almak için amplifiye edildi çünkü tek veya çift DNA molekülü aşağı akış analizleri için yeterli değildir. Bununla birlikte, geleneksel PCR kullanılarak gen ölçümü mümkün değildir, bu nedenle gen ekspresyonu ve nükleik asit ölçümü, geleneksel PCR ile yapılamaz.
Gerçek zamanlı PCR artık sitokinlerin kantifikasyonu için altın standart bir yöntemdir ve hatta TB tespiti için en güvenilir kantifikasyon makinesidir. Yine de, gerçek zamanlı PCR’nin çeşitli sınırlamaları nedeniyle, nükleik asidin kantifikasyonu için gelişmiş, sağlam ve daha doğru bir yönteme ihtiyaç vardır. Gerçek zamanlı PCR’yi kullanarak bilim adamları, bir numunede bulunan DNA veya RNA miktarını tahmin edebilir. Bununla birlikte, reaksiyon hazırlığı sırasında kullanılan büyük hacim nedeniyle, istenmeyen nükleik asitlerin miktarının belirlenmesine de yol açabilir. Buna ek olarak, fazlalık çok büyük olmasa da birkaç molekülün miktarı belirlenmez. Bu sorunun üstesinden gelmek için dijital PCR icat edilmiştir. Dijital PCR ilkesi, bir numuneyi daha küçük mikro hacimlere bölerek mutlak nicelendirmesine dayanır. Numuneyi daha küçük bir hacme bölmenin genel fikri, o mikro hacimde bulunan tek bir molekülü ölçmektir, böylece ölçümün kesinliğini arttırır.
Dijital PCR Nedir
Dijital PCR kavramı 1992’de Sykes ve arkadaşları tarafından çıkarılmıştır. Yöntem, nadir alellerin tespiti ve nokta mutasyonlarının tespiti için sıklıkla kullanılmaktadır. Ayrıca, NGS sırasında klonal amplifikasyonda kullanılır.
Nükleik asidin kantifikasyonu için mevcut altın standart yöntem, floresan kimyasına dayanan gerçek zamanlı PCR’dir. Hidroliz bazlı floresan prob veya DNA interkalasyon boyası nükleik asit miktarının belirlenmesinde kullanılır. Özetle, floresan etiketli prob, diziye bağlandığı bir numunede tamamlayıcı ipliğini bulduğunda, hidrolize prob, makine tarafından tespit edilen floresan yaymaktadır. Katmanlı boya bazlı yöntemde, floresan boya yalnızca dsDNA’ya bağlanır ve floresan yayar. Yayılan floresan miktarı makine tarafından ölçülür. Ancak, “geleneksel qPCR” uygulaması standartlar gerektirmektedir. Standartlar, numuneyi ölçmek için temel olarak kullanılır, ayrıca numune hacminin aynı miktarda olması gerekir.
Buna ek olarak, çoğullama kantifikasyon testini gerçekleştirmek uzmanlık gerektirmektedir. Çoklama tahlillerinin gerçekleştirilmesi, rekabetçi tahlil doğası nedeniyle kolay bir iş değildir. Gerçek zamanlı PCR, nadir alellerin veya heterojen örneklerin saptanmasında genellikle uygulanamaz çünkü iki örnek arasındaki kantifikasyon sınırı 2 kattır. Bu problemler, bir numuneyi mikro hacimlere bölerek dijital formattaki toplam DNA molekül sayısını sayan dijital PCR adı verilen yeni nesil nükleik asit kantifikasyon yöntemi kullanılarak aşılır. Dijital PCR’nin iş akışı benzerdir, qPCR aynı reaktifleri ve benzer ısıl döngüleyici koşullarını kullanır. Kimya, saptama için floresan moleküllerin kullanımına dayanır (qPCR ile aynı). PCR reaksiyonunun hazırlanmasında dNTP’ler, primer seti, PCR reaksiyon tamponu, şablon DNA, Taq DNA polimeraz ve diğer PCR güçlendiriciler kullanılır.
Dijital PCR Uygulamaları
Dijital PCR uygulamalarının kullanıldığı pek çok alan vardır. Bu alanlardan bazıları şunlardır:
• Nadir alel tespiti ve ayrıca nadir dizi tespiti.
• Doğru kopya numarası varyasyon çalışmaları
• Doğru NGS kitaplık ölçümü
• Viral yük algılama
• Patojen tespiti
• Tek hücreli gen ifade analizi
• Dizileme ile belirlenen düşük frekanslı mutasyonların doğrulanması.
• Gen ifadesi ve mikroRNA araştırması
DPCR’nin en büyük avantajlarından biri, dijital PCR, % 30’dan daha az gen ekspresyonundaki farkı tespit edebilir, sadece tek bir kopya sayısı varyasyonu doğru bir şekilde ayırt edilebilir. Buna ek olarak, alelik frekansları % 0.1’den az olan alelleri belirleyebilir.
Dijital PCR’nin Avantajları
• Basit kurulum, kantitatif PCR’de olduğu gibi daha yüksek uzmanlık gerektirmez.
• Daha yüksek hassasiyet
• Daha yüksek tekrarlanabilirlik
• Düşük numunelerde hedefi ölçün
• Geliştirilmiş çoklama kapasitesi
• PCR inhibitörlerine karşı yüksek tolerans kapasitesi
• Düşük frekanslı genotiplerin erken ve doğru tespiti.
Damlacık Dijital PCR
Su-yağ emülsiyon tekniği süreci boyunca, reaksiyonu bölmek için nano hacim boyutunda yağ damlacığı oluşturulur. Bu teknik kullanılarak DNA miktarının belirlenmesi damlacık dijital PCR olarak adlandırılır. Bununla birlikte, damlacık dijital PCR’nin temel prensibi dPCR’ye benzemektedir. DdPCR, mutlak ölçüm için 20.000’den fazla mikro hacimli bölüm üretir. Reaksiyon bölünmüşse, daha fazla sayıda mikro hacimli reaksiyon ise, mikro hacimli reaksiyon bölmesinde sıfır veya bir şablona sahip olma şansı daha yüksektir, bu nedenle sayım daha doğru hale gelir. Bu nedenle, ddPCR (su-yağ emülsiyon tekniği kullanılarak) nadir alel ve düşük frekanslı genotip tespiti için tavsiye edilir. Dijital PCR, nükleik asidin miktar tayini için kullanılan en doğru yöntemlerden biridir. Tek bir aleli bile tespit etme gücü, kanser araştırmalarında ve kanser gelişiminde nadir mutasyonların ve nadir alellerin tespitinde daha büyük doğruluk payı ile sonuçlar alınmasını sağlamaktadır.