Hücre kültürü, ökaryotik veya prokaryotik hücrelerin fizyolojik koşullarda büyümesini sağlayan laboratuvar yöntemlerini ifade eder. Kökeni, doku büyümesi ve olgunlaşması, virüs biyolojisi ve aşı gelişimi, hastalık ve sağlıkta genlerin rolü ve biyofarmasötikler üretmek için büyük ölçekli hibrit hücre dizilerinin kullanımı incelemek üzere tanıtıldığı 20. yüzyılın başlarında bulunabilir.
Kültürlenmiş hücrelerin deneysel uygulamaları, laboratuvar ortamında büyütülebilen hücre tipleri kadar çeşitlidir. Bununla birlikte klinik bir bağlamda hücre kültürü, en yaygın olarak temel hücre biyolojisini inceleyen, hastalık mekanizmalarını kopyalayan veya yeni ilaç bileşiklerinin toksisitesini araştıran model sistemleri oluşturmakla bağlantılıdır. Bu uygulamalar için hücre kültürü kullanmanın avantajlarından biri, genleri ve moleküler yolları manipüle etmenin fizibilitesidir.
İçindekiler
- 1 Hücre Kültürü Nasıl Yapılır?
- 2 Aseptik Hücre Kültürü Çalışmaları
Hücre Kültürü Nasıl Yapılır?
Biyomedikal araştırmalarda hücre kültürü tekniklerinin heyecan verici uygulaması, kültürlenmiş hücreler (örneğin, HBV veya HIV) tarafından barındırılan enfeksiyöz ajanlarla bağlantılı potansiyel tehlikelerin yönetimini, aynı zamanda toksik, aşındırıcı veya mutajenik yapıda olabilen reaktiflerin kontrolünü gerektirir. Bu potansiyel tehlikeler vücuda girdiğinde (örneğin deri ve mukoza zarlarının katılar, sıvılar veya aerosollerle teması yoluyla) laboratuvar çalışanlarının sağlığını tehlikeye atabilir ve uygun olmayan şekilde kullanıldıklarında çevreyi tehdit edebilir.
Herhangi bir hücre kültürü çalışmasına başlamadan önce, potansiyel olarak tehlikeli maddelere maruziyetin azaltılması veya ortadan kaldırılması, enfeksiyonu, patojenliği, alerjik reaksiyonları ve salınan toksinlerle teması en aza indirmek için önemlidir. Bu, laboratuar personelinin sıkı eğitimi ve standart hücre kültürü uygulamalarının uygulanmasıyla sağlanabilir. Laboratuvar üyeleri ve enstitünün güvenlik komitesi tarafından düzenli olarak gözden geçirilmesi ve revize edilmesi gerekir. Ek olarak, doğrudan insan dokusundan izole edilen birincil hücrelerle çalışırken, hastalığa neden olan patojenler için hücrelerin türetildiği donörleri taramak önemlidir. Hepatit B gibi bulaşıcı hastalıklara karşı güncel aşılamalar, birincil hücrelerle çalışan laboratuvar personeli için de önemlidir.
Hücre Kültürü Çalışmaları Yönergeleri
|● Her laboratuvar çalışanı, kendi sağlık ve güvenliğinden ve hücre kültürü laboratuvarında yapılan çalışmadan etkilenebilecek diğer kişilerin güvenliğinden sorumludur.|
|● Hücre kültürü laboratuvarına girerken kişisel koruyucu ekipman giyilmeli ve herhangi bir kişisel koruyucu ekipmanı terk ederken veya kontamine ederken çıkarılmalıdır. Tehlikeli maddelerle çalışıldıktan sonra, kontamine olma olasılığı bulunan eldivenler derhal çıkarılmalı ve biyolojik atık kutusuna atılmalıdır.|
|● Açık parmaklı ayakkabılar, kısa pantolonlar ve etekler tavsiye edilmez.|
|● Hücre kültürü laboratuarında yiyecek, içecek tüketimine, yiyeceklerin saklanmasına, sigara içilmesine, kozmetik uygulamasına veya kontakt lens kullanımına izin verilmez.|
|● Hücre kültürü laboratuarında çalışırken cep telefonları kullanılmamalıdır.|
|● İşe başlamadan önce bol giysiler (örn. Eşarplar, sarkan kolyeler) çıkarılmalı ve saçlar geri bağlanmalıdır.|
|● Hücre kültürü laboratuvarı düzenli tutulmalı ve bir dezenfektanla (örn. İnkübatörler, laminer akış başlıkları ve çalışma yüzeyleri) rutin olarak temizlenmelidir.|
|● Olası bulaşıcı veya tehlikeli maddelerle temas halinde olan tüm laboratuvar aletleri, onlarla çalışmadan önce ve sonra dekontamine edilmelidir. Potansiyel olarak bulaşıcı ve tehlikeli materyal dekontamine edilmeli ve önerilen yolla atılmalıdır.|
|● Keskin nesneler (örn. Pipet uçları) derhal imha edilmelidir.|
|● Hücre kültürü laboratuvarından çıkmadan önce eller yıkanmalıdır.|
|● Bulaşıcı veya tehlikeli ajanların maruz kalması durumunda, laboratuarın güvenlik görevlisi, kontrol altına alma ve dekontaminasyon için uygun bir strateji konusunda tavsiyede bulunacak şekilde bilgilendirilmelidir.|
Aseptik Hücre Kültürü Çalışmaları
Bir önceki bölüm, tehlikeli maddelerin laboratuvar çalışanına maruziyetini azaltmayı amaçlayan yöntemleri araştırırken, bu bölüm kültürlenmiş hücreleri korumak için laboratuvar çalışanları tarafından yerine getirilmesi gereken uygulamaları ele alacaktır. Nitekim, mikrobiyolojik enfeksiyonlar, laboratuvar ortamında üretilmiş hücrelerin muhafazası için ana problemdir. Bakteriler gibi bulaşıcı maddeler ökaryotik hücreler için toksiktir ve nihayetinde hücre ölümüne yol açar. Ayrıca, düşük seviyelerde kirlenme bile anormal sonuçlara neden olabilir ve yanlış bilimsel yorumlara yol açabilir. Araştırmacılar, hücre kültürü laboratuvarında asepsi sağlayan çeşitli tekniklere bağlı kalarak kontaminasyonların sıklığını ve kapsamını azaltabilir. Böylece hücre, kaynak ve zaman kaybı azaltılabilir.
Aseptik Çalışma Ortamı Yaratmak
Atmosferik havanın potansiyel olarak bulaşıcı nitelikte mikropartiküller ile yüklü olduğu göz önüne alındığında, biyogüvenlik kabini, steril olmayan aerosollerin ve havada taşınan bileşenlerin kültürlenmiş hücreleri kontamine etmesini engellemek için en önemli ekipmandır. Biyogüvenlik kabini, dış rüzgar kaynaklarından (örneğin, pencere veya kapılardan gelen hava akımları) hava akışını kesintiye uğratmayan bir laboratuar alanına yerleştirilmelidir. Çoğu biyogüvenlik kabini bir ısınma süresi gerektirir, ardından çalışma yüzeyinin antifungal bir deterjanla (örn. %5 Trigene) ve ardından %70 etanol ile dekontamine edilmesi gerekir. Biyogüvenlik kabinine giren tüm ekipmanın da %70 etanol ile püskürtülmesi ve silinmesi gerekir. Bununla birlikte, biyogüvenlik kabininde kullanılan öğe sayısı, hava akışının herhangi bir şekilde engellenmesini önlemek için minimumda tutulmalıdır. Biyogüvenlik kabini yalnızca günlük kullanımı tamamlandıktan sonra kapatılmalıdır ve ultraviyole lamba, maruz kalan yüzey alanlarını gece boyunca sterilize etmek için açılabilir. Düzenli bakım ayrıca, medyanın ızgaradan dökülebileceği çalışma yüzeyinin altındaki alanın temizlenmesini de içerir. Ayrıca, biyogüvenlik kabini mühendisleri aracılığıyla yapılan rutin servisler, bu önemli hücre kültürü ekipmanı parçasının doğru hava akışını ve tam filtre kapasitesini sağlayabilir.
Hücre kültürü kapları veya ortam bileşenleri ile temas halinde olan tüm diğer yüzeylerin temiz tutulması çok önemlidir. Buna inkübatör, santrifüj, mikroskop, su banyosu, buzdolabı ve derin dondurucu dahildir. Paslanmaz çelik inkübatörler kolay temizlemeye izin verir ve yüzeyleri nemli ortamın korozyonundan korur. Mikropların büyümesini önlemek için su banyolarına arıtma solüsyonları eklenebilir. Daha büyük ölçekte, hücre kültürü alanında depolanan ekipman tozdan arındırılmalıdır. Hücre kültürü zeminlerinin düzenli olarak temizlenmesi tavsiye edilir.
Hücre Kültürü için Aseptik Reaktifler ve Ortam Kullanımı
Kontaminasyonun ana kaynakları laboratuvar personeli, çevre ve kültür ortamıdır. Ticari kaynaklı ortam ve tamamlayıcı hücre kültürü ürünleri genellikle steril durumda sağlanır. Ek olarak, filtre ile sterilizasyon, steril olmayan kültür reaktiflerine dayanan hücre kültürü ortamının oluşturulmasına izin verirken, kültürlenmiş hücrelerle temas halinde olan ekipmanı sterilize etmek için geleneksel olarak otoklavlama kullanılır. Sıvıların filtre sterilizasyonu, sıvının bir vakum pompası kullanılarak 0.22 μM polietersülfon düşük bağlayıcı filtre sisteminden geçirilmesiyle sağlanabilir. Antibiyotiklerin eklenmesi (ör. Penisilin / Streptomisin), açıldıktan sonra ortam şişelerinde ve hücre kültürü kaplarında bakteri üreme riskini daha da sınırlar.
Kontaminasyonlar
Kontaminasyonlardan genel olarak tamamen kaçınılamadığından, kontaminantların diğer hücrelere veya hücre kültürü ürünlerine yayılmasını önlemek için hücre kültürü laboratuvarı personelinin erken belirtileri tanıması için eğitilmesi önemlidir. Kirleticiler çoğunlukla biyolojik yapıdadır ve şunları içerir: bakteriler, mantarlar, virüsler ve parazitler. Besinler için rekabet, alkali, asidik veya toksik yan ürünlerin sentezi ve viral bileşenlerin hücre kültürü genomu ile potansiyel etkileşimi yoluyla kültürlenmiş hücre hattının fenotipini ve genotipini değiştirebildikleri için biyolojik kirletici maddelerin sınırlandırılması önemlidir. Diğer kirleticiler, istenmeyen kimyasal katışkıların (örneğin, hücre kültürü kaplarındaki plastikleştiriciler) veya laboratuvarda birlikte kültüre alınan diğer hücre tiplerini içerebilir.
Bakteriyel Kontaminasyon
Bakteri alemi, çapı birkaç mikrometre büyüklüğünde, morfolojilerinde geniş çeşitlilik ve eşeysiz üreme yoluyla hızlı iki katına çıkma süreleri ile karakterize edilen oldukça yaygın, prokaryotik mikroorganizmaları içerir. İkinci özellik, enfeksiyondan kısa bir süre sonra hücre kültürü süpernatanlarında hazır saptamaya izin verirken, aynı zamanda hızlı yayılmayı da kolaylaştırır. Bakteriyel kontaminasyondan etkilenen hücre kültürleri genellikle bulanık görünür. Ayrıca, bakterilerin yüksek metabolik hızları, kültür ortamının pH’ını değiştirebilir ve böylece fenol kırmızısının rengini sarıya değiştirebilir. Bakteriler düşük mikroskop büyütmede küçük partiküller olarak tespit edilebilirken, farklı şekilleri genellikle daha yüksek büyütmede tespit edilir. E. coli gibi bakteri suşlarının boyutları (~ 2 μM) ve flagella kaynaklı hareketlilik nedeniyle oldukça kolay bir şekilde ortaya çıkarılabilir, Mycoplasma gibi diğer suşlar boyut olarak daha küçüktür (<1 μM), hareketsizdir ve bu nedenle kolayca tespit edilemez. Sonuç olarak, Mycoplasma enfeksiyonları daha uzun süre fark edilmeyebilir ve genellikle yalnızca kültürlenmiş hücrelerin kalitesinin düşmesiyle belirginleşir. Bu, azalmış hücre proliferasyonu ve hücre ölümü olarak ortaya çıkabilir. Mikoplazma ile potansiyel enfeksiyonlar için hücre kültürlerini izlemek için, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) veya immün boyama kullanarak kültürlerin mevcudiyetine yönelik rutin olarak test edilmesi önerilir .
Mantar Kontaminasyonu
Mayalar, eşeysiz üreme sırasında çok hücreli dizi benzeri yapılar oluşturan tek hücreli ökaryotlardır. Bu tomurcuklanan hücreler yumurta şeklinde görünür, yaklaşık 4 μM boyuta kadar büyüyebilir ve bu nedenle düşük mikroskop büyütmelerinde kolayca tespit edilebilir.
Küfler, hücre kültürlerinde bulunabilen mantar aleminin ek üyeleridir. Büyümeleri, çok hücreli, oldukça bağlantılı, ince filamentlerin (hif) üretimi ile işaretlenir.
Mayalar veya küflerle kontamine olmuş hücre kültürü süpernatanları bulanık görünür ve pH enfeksiyonun ilk aşamalarında sabit kalmasına rağmen, yüksek kontaminant konsantrasyonlarında artar. Maya kontaminasyonlarına farklı bir koku da eşlik edebilir. Mantar türleri havadaki sporlar yoluyla yayılabildiğinden, bu tür kontaminasyonların hızlı bir şekilde belirlenmesi ve kontrol altına alınması özellikle önemlidir.
Viral Kontaminasyon
Virüsler, kendi replikasyonları için konakçı hücrelere dayanan bulaşıcı ajanlardır. 300 nm’ye kadar olan sınırlı boyutları ve hücre içi yaşam döngüleri nedeniyle, jenerik ışık mikroskopisinde görünmezler ve bu yüzden tespit edilmeleri çok zordur. Bazı virüsler kültürlenmiş hücrelerde morfolojik değişiklikleri tetikleyebilirken (sitopatik etkiler), diğer türler hücresel genoma entegre olabilir ve araştırılan hücre hattının fenotipini değiştirebilir. Virüsler, örneğin tripsin veya fetal sığır serumu gibi hayvandan elde edilen hücre kültürü ürünlerinin kullanımı yoluyla hücre kültürlerine girebilir ve laboratuvar çalışanları için ciddi bir sağlık sorunudur. Viral kontaminantların varlığının doğrulanması zor olabilir, ancak genellikle PCR, ELISA, immünositokimya veya elektron mikroskobuna dayanır.
Kontaminasyonları Ortadan Kaldırmak
Tanımlanan kontaminasyon türüne bakılmaksızın, etkilenen hücre kültürleri hücre kültürü odasından çıkarılmalı ve enfeksiyöz ajanların diğer kültürlere yayılmasını önlemek için atılmalıdır. Ayrıca kontaminasyon kaynağının belirlenmesi de önemlidir. Kirlenmiş hücrelerle temas halinde olan kültür ortamı ve diğer hücre kültürü bileşenlerinin atılması ve kirlenmiş kaba temas eden yüzeylerin (örn. İnkübatör, biyogüvenlik kabini, mikroskop, aspiratör) temizlenmesi tavsiye edilir.
Hücre Hattı
Hücre kültürü için bir hücre hattının seçimi, büyük ölçüde hücre modelinin gerektirdiği fonksiyonel özelliklere ve spesifik okumalara bağlıdır. Seçilen hücre hatlarının ayrıca mevcut ekipman ve kendi özel tehlike grubunun gereksinimleri ile uyumlu olması gerekecektir. Laboratuvarda kültürlenen hücreler üç farklı türde sınıflandırılabilir: birincil hücreler, dönüştürülmüş hücreler ve kendi kendini yenileyen hücreler. Birincil hücreler, Deri biyopsilerinden elde edilen fibroblastlar ve karaciğer eksplantlarından izole edilen hepatositler gibi, doğrudan insan dokusundan izole edilir. Biyomedikal ve translasyonel araştırmalar, çoğu zaman bu hücre tiplerini kullanmaya dayanır çünkü bunlar, menşe dokularının iyi temsilcileri olurlar.
Bununla birlikte, bu hücre türlerinin işlenmesiyle ilgili katı biyogüvenlik kısıtlamaları vardır. Ayrıca, birincil hücreler genellikle “sonlu” olarak karakterize edilir ve bu nedenle, sınırlı miktarda hücre bölünmesinden sonra çoğalmaları durduğu ve hücre genişlemesi çoğu zaman imkansız olduğu için sürekli bir stok arzına dayanır. Dönüştürülmüş hücreler, doğal olarak veya genetik manipülasyonla oluşturulabilir. Bu tür ölümsüzleştirilmiş hücre hatlarının kullanımı, hızlı büyüme oranları ve bakım ve klonlama için stabil koşullar oluşturan bir hücresel platforma yol açarken, bunların manipüle edilmiş genotipleri, karyotipik anormallikler ve fizyolojik olmayan fenotiplerle sonuçlanabilir. Öte yandan, insan veya insan dışı türlerden veya (örneğin, Çin hamsteri (CHO), HeLa, insan göbek damarı endotel hücreleri (HUVEC)) türetilen standartlaştırılmış hücre çizgileri çoğu zaman kapsamlı bir şekilde karakterize edilir ve bu nedenle kurulumu daha kolay olabilir. Kendini yenileyen hücreler, örneğin, embriyonik kök hücreler, uyarılmış pluripotent kök hücreler, sinir ve bağırsak kök hücreleri içerir. Bu hücreler, diğer hücre türlerinin çeşitliliğine farklılaşma kapasitesini taşırken, kendi kendini yenileme özellikleri, in vitro olarak uzun süreli bakıma izin verir. Kendi kendini yenileyen hücre tipleri çoğu zaman in vivo mekanizmaların fizyolojik olarak ilgili temsilcileri olarak hareket eder.