Summary
Bu prosedür, hücre hatları transfect ve gerçek zamanlı PCR ile gen ekspresyonu takip etmek zor içine siRNA tanıtmak için hızlı ve kolay bir iş akışını açıklar. Otomatik bir hücre sayıcı kullanımı, çok iyi elektroporasyon plaka ve otomatik elektroforez istasyonu pahalı robot işleme gerek kalmadan hızlı ve güvenilir sonuçlar sağlar.
Abstract
SiRNA aracılı gen demonte gen ekspresyonu çalışmalarında önemli bir araç olmaya devam etmektedir. sadece tek genlerin downregulating etkilerini incelemek için siRNA çalışmalar yürütülmektedir değil, aynı zamanda sinyal yollar ve diğer karmaşık bir etkileşim ağları sorgulamak için. Bu yolağı analizleri, ilgili cep telefonu modelleri kullanımı ve hücresel fizyoloji az pertürbasyon neden yöntemleri de gerektirir. Elektroporasyon giderek soruşturma altında sinyal yolağı değiştirmeden hücre hatları ve birincil hücreler transfect zor siRNA ve diğer nükleik asitlerin tanıtmak için etkili bir yol olarak kullanılmaktadır. Başarılı bir siRNA deneyi için birden fazla kritik adımlar vardır, ve çeşitli deneysel aşamada veri kalitesini arttırırken, çalışmalarını kolaylaştırmak için yollar vardır. SiRNA aracılı gen demonte proje ile başlamanıza yardımcı olmak için, biz yazılan transfeksiyon real-time PCR gen ekspresyon analizi yoluyla elektroporasyon önce hücrelerin toplanması ve sayma komple bir yol çalışması gerçekleştirmek için nasıl göstereceğiz. Aşağıdaki çalışmada, IL-4 Burkitt lenfoma hücre hattı (Namalwa) CCL17 bağımlı gen ekspresyonu transkripsiyonel aktivatör STAT6 rolünü araştırıyor. SiRNA tabanlı deneyler yapışmış ve süspansiyon hücreleri hem de geniş bir yelpazede ortaya teknikler yararlıdır. Ayrıca MXcell elektroporasyon sistemi aynı anda kullanarak birden fazla numune nasıl electroporate TC10 otomatik hücre sayıcı sayma hücre, RNA Experion otomatik elektroforez sistemi ile kalite ve miktar nasıl aynı anda değerlendirmek için nasıl düzene gösterecektir.
Protocol
1. Namalwa hücrelerinin hazırlanması ve sayma
- Kültür şişelerinde hücreleri çıkarın ve pelet hücreler santrifüj. PBS bilinen bir ses supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarın. Bu protokolde kullanılan hücreler, süspansiyon hücrelere. Yapışık hücrelere kullanıyor iseniz toplama önce trypsinize gerekecektir.
- Canlı hücrelerinin sayısını belirlemek için, bir sayım slayt üzerine% 0.4 tripan mavi karışımı çözüm ve pipetlemeyin 10 ul ile 01:01 karıştırma hücre süspansiyonu bir kısım leke ve sonra TC10 otomatik hücre içine slayt eklemek sayacı (Bio-Rad Laboratories, Inc.)
- TC10 hücre sayacı otofokus sayma ile devam edin, sonra en doğru saymak sağlamak ve için. Otomatik numune canlı hücreleri ve toplam hücre yoğunluğu belirler.
- Viewscreen hücreleri görüntülemek için görüntüyü seçin. Sonra TC10 hücre sayacı seyreltme hesap makinesi seçeneğini seçin, otomatik olarak gerekli olacak hücre karışımı miktarını hesaplamak.
- Bu deney, bir toplam üç siRNA'lar kullanarak bir kontrol siRNA ve STAT6 gen, artı untransfected kontrolleri hedefleyen iki farklı siRNA'lar. Bu ml'de 5 x 10 6 hücre bir final konsantrasyonda 3.6 ml gerektirir.
- Seyreltme hesap makinesi içine istenen konsantrasyon ve son hacim değerleri girin ve bu örnek için canlı hücre sayımı dayalı hücre süspansiyonu gerekli hacim hesaplar. Alternatif olarak, elle hesaplama yapmak. Sonra yeni bir tüp içine bu deneyler için gerekli hacim hücre karışımı aktarın.
- Pelet hücreleri hücre karışımları Spin ve tüm PBS kaldırmak. Gene Verici elektroporasyon tampon (Bio-Rad Laboratories) 3.6 ml süspanse edin. 800 ul alikotları uygun siRNA'lar içeren tüp içine aktarın ve hafifçe karıştırın. Hücreler artık elektroporasyon için hazırız.
2. 96-iyi Tabaklar hücreleri Electroporating
- 96-iyi elektroporasyon plaka birlikte electroporated dört tedaviler için çoğaltır sağlar.
- 96-iyi elektroporasyon plaka uygun kuyu içine hücre süspansiyonu 150 ul aktarın.
- MXcell elektroporasyon plaka odasında plaka yerleştirin ve kapağını kapatın.
- Kullanılan hücre hattı ve tampon için optimize edilmiş ayarlar kullanarak Electroporate. Bu hücreler, bir üstel bozulma dalga, 250 V cihaz ayarları ile 350 μF, ve 1000 Ω direnç kullanarak electroporated.
- Elektroporasyon tamamlandıktan sonra, her bir kuyu içinde karıştırın ve daha sonra önceden ısıtılmış medya içeren bir doku kültürü plaka hücreleri aktarmak için hafifçe aşağı yukarı pipet ve. Namalwa hücreleri RPMI (Life Technologies)% 7.5 ve% 1 FCS piruvat ile desteklenmiş yetiştirilmektedir.
- Electroporated henüz kontrol numuneleri alınmış ve kalan hücre süspansiyonu electroporated hücrelere aynı kültürü, önceden ısıtılmış kültür orta yemekleri eklenir.
- 37 geceleme inkübe hücreleri ° C ile% 5 CO 2.
- 24 saat sonra hücrelerin bir set 10 ng / ml son konsantrasyon rekombinant IL-4 (R & D Systems) ile sağlandı. Kontrol hücrelerinin ikinci sette sadece ek ortam alırsınız. Tüm hücreler 37 ° C ve% 5 CO 2 ek bir 24 saat inkübe edilir.
3. RNA ayıklayın ve kontrol
- Büyüme olmak üzere toplam 48 saat sonra, her bir kuyunun hücrelerin sayısı, ve her biri de bir kısım transfer RNA ekstraksiyonu için bir mikrofuge'de tüp ve batı blot veya diğer protein analizi için ikinci bir kısım dondurmak.
- Pelet hücreleri örnekleri santrifüj, ve sonra her bir tüpten süpernatantı çıkarın ve atın.
- RNA ekstraksiyonu ile devam edin. Biz genellikle dahil protokole göre Aurum toplam RNA kiti (Bio-Rad) kullanabilirsiniz.
- SiRNA aracılı gen demonte izlerken bozulmuş RNA yanıltıcı sonuçlar verecektir, çünkü bu RNA kalitesini doğrulamak için özellikle önemlidir. 260/280 oranı RNA bütünlüğü anlamına gelmez, bu nedenle RNA bozulmuş değil onaylamak için bir jel ya da mikroakışkan cihaz örnekleri çalıştırmak için önemlidir.
- Tek adımda hem kalite ve miktar değerlendirmek için, bu örneklerin Experion otomatik elektroforez sistemi (Bio-Rad) kullanılarak analiz edilecektir.
- İlk olarak, ısı örnekleri. Sonra, başbakan, yük ve vorteks Experion RNA çip. Experion elektroforez istasyonu içine çip takın ve çalıştırın.
- Çalıştırmak tamamlandıktan sonra, Experion yazılım (geleneksel bir RNA benzer bir Elektroferogram, sonuçlar tablo şeklinde (RNA konsantrasyon, ribozomal oranı ve RNA kalite göstergesi numarasını görüntüler) ve sanal jel sonuçları otomatik olarak gösterecektir jel). Yüksek kalitede toplam RNA örnekleri genellikle 8-10 RQI olacaktır.
- RNA kalitesi doğruladıktan sonra, cDNA reaksiyonlar ile devam edin. Bu deney bir tepki olarak cDNA sentezi ve real-time PCR iScript bir adım RT-PCR karışımı (Bio-Rad) birleştirmek için kullanılır.
- Her astar kümesi için RNA şablonlar dışında tüm reaksiyon bileşenlerini içeren bir master miks olun ve PCR plakasına bu dağıtmak.
- RNA yeknesak bir konsantrasyona seyreltilmesi sonra, uygun kuyulara RNA örnekleri ekleyin. Her reaksiyon üç nüsha olarak kurulur.
- Plaka Seal, ve CFX384 gerçek zamanlı PCR sistemi (Bio-Rad) içine yerleştirin. Uygun protokolü seçin ve çalışma başlar.
- Çalıştırmak tamamlandıktan sonra, gen ekspresyonu kontrol siRNA electroporated hücreler aynı normalleşme deneysel siRNA electroporated hücreleri bir referans gen normalize ilgi gen gen ekspresyonu karşılaştırılarak belirlenir.
- CCL17 ifadesi CCL17 IL-4 bağımlı indüksiyon transkripsiyonel aktivatör STAT6 rolünü araştırmak için kantitatif gerçek zamanlı PCR kullanarak takip edildi. Bu deneme için, GAPDH bir referans gen olarak kullanılmıştır. Alternatif referans gen ya da birden fazla referans genler aynı şekilde kullanılabilir.
- CFX Manager yazılımı otomatik olarak aynı örnek referans gen ekspresyonu CCL17 ifade normalize ve basitçe, "referans" ve kontrol tedavisi (IL-4 indüksiyon olmadan kontrolü siRNA) olarak GAPDH seçerek tedavileri kontrol etmek için otomatik olarak normalize değerleri karşılaştırıldığında CFX yöneticisi yazılımı deney ayarları penceresi "kontrol".
- Olmadan, IL-4 indüksiyon, CCL17 transkripsiyonunu kontrol tedavisi ile karşılaştırılabilir, bünye düşük seviyelerde kaldı.
- IL-4 ile indüklenen ve normal bir STAT6 yolağı (yani, kontrol siRNA veya untransfected kontrol tedavileri) istinat Hücreler CCL17 ifade 8-10 kat indüksiyon gösterdi.
- IL-4 ile ancak STAT6 ifade ya STAT6 siRNA tanıtımı tarafından inhibe uyarılan hücreler CCL17 IL-4 kaynaklı ifade STAT6 rolünü teyit uninduced hücreleri sadece yaklaşık 2 kat daha yüksek CCL17 ifade gösterdi.
4. Real-time PCR
5. SiRNA demonte Analizi
6. Temsilcisi Sonuçlar
Şekil 1. IL-4 sinyal yolağı Genel Bakış.
IL-4 - kendi reseptörüne A) Cilt STAT6 dimerization ve aktivasyonuna yol açar. STAT6 translocates çekirdeği etkinleştirilir ve bu tür CC17 olarak hedef genlerin transkripsiyonunu aktive eder.
B) IL-4 indüksiyon olmadan, CCL17 transkripsiyonunu, bünye düşük seviyelerde kalmaya devam edecektir.
C) siRNA-aracılı STAT6 gen susturulması sonra, IL4 tedavisi çok az veya hiç artış CCL17 ifade yol açacaktır.
Şekil 2. IL4 tarafından indüksiyonu CCL17 kantitatif gerçek zamanlı PCR ile farklı koşullar ile ölçülür.
A) IL-4 olmadan yetişen Örnekleri gen ekspresyonu ne olursa olsun, düşük bir ifade kurucu seviyesi vardı.
B) yeşil ve mavi de görüldüğü gibi, kontrol örnekleri IL-4 ile tedavi normal yanıt verdi; CCL17 8-10 kat indüksiyon ile. Ancak, hücreler, STAT6, kırmızı ve pembe gösterilen hedef siRNA'lar ile transfekte fikri destekleyen, IL-4 yanıt CCL17 ifade azalmıştır STAT6 CCL17 IL-4 kaynaklı ifade bir rol oynar.
Discussion
Bu makale, süspansiyon hücre hattı transfect ve gen ekspresyonu bu hücrelerin nasıl takip etmek zor bir içine nasıl siRNA'lar electroporate göstermiştir. Bu işlemi yaparken tüm örnekleri arasında mümkün olduğunca tutarlı bir şeyleri saklamak için hatırlamak önemlidir.
Disclosures
Yazar, bu makalede kullanılan reaktifler ve aletleri üreten Bio-Rad Laboratories tarafından istihdam edilmektedir.