2Dalga boyu aralığı (mm) Dalga sayısı aralığı (cm-1) BölgeDalga boyu aralığı (mm)Dalga sayısı aralığı (cm-1)YakınOrtaUzak
3Kırmızı ötesi bölgesinde soğurma, moleküllerin titreşme ve dönme düzeylerini uyarır. Kırmızı ötesi ışımanın enerjisi moleküldeki bağları bozmaya yetmez, elektronik uyarma da yapamaz; fakat atomların kütlelerine, bağların gücüne ve molekül geometrisine bağlı olarak bağların titreşme genliklerini arttırır.
4Titreşme hareketleri: 1) Gerilme 2) Eğilme (düzlem içi ve dışı) Simetrik ve asimetrik gerilmeDüzlem içiyana sallanmaDüzlem içimakaslamaDüzlem dışısallanmaDüzlem dışıbükülme
5Titreşim frekansıİki atomlu(mA ve mB) bir sistemin gerilme ve eğilme frekansının hesabı için basit titreşme hareketi yaptığı kabul edilmiştir.k:bağın kuvvet sabiti (Nm-1), mind:indirgenmiş kütle, m-1 olarak bulunur..k; atomların kütlesine, elektronegatifliğine, bağın uzunluğuna ve bağın gücüne bağlı olarak değişir.
6SOĞURMA PİKLERİNİN SAYISI Çok atomlu bir molekül için soğurma piklerinin sayısı serbestlik derecesinden hesaplanabilir.N atomlu çizgisel bir molekül için 3N-5N atomlu çizgisel olamayan için 3N-6H2O için 3 band beklenir.
8Işıma, sistemde dipol moment değişimine yol açmazsa soğurulmaz Bir molekülde simetri merkezi varsa, bu merkeze göre simetrik bağlara ait gerilme titreşimleri gözlenmez.Ö: H2C=CH2, CH3HC=CHCH3* Sistemde dipol moment değişikliği ne kadar fazlaysa, yani sistem ne kadar polarsa, kırmızı ötesi soğurma bandı o kadar şiddetlidir.
10Işık kaynaklarıİnfared spektrofotometresinde kullanılan ışık kaynağı infrared ışıması yayan ve elektrikle K kadar ısınabilen sert katı maddelerdir.Nerst çubuğu: Uzunluğu 20mm, çapı 1-2 mm olan nadir toprak metali oksitlerinden yapılmıştır.Globar çubuğu: 5 mm çapında, 500 mm uzunluğunda silisyum karbürden oluşmuş bir silindirdir.Tungsten-Flaman Lambası: Dalga boyu µm (yakın infrared) arasındaki bölgesde ışıma yapan bir ışık kaynağıdır.Civa-ark lambası: Uzak infrared (50µm den büyük) bölgesi için kullanılan bir ışık kaynağıdır.Nikrom Teli: Bu ışık kaynağı uzun ömürlüdür.
11DedektörlerPiroelektrik Dedektörler: Yalıtkan Piroelektrik malzemelerin kristalinden yapılmıştır. En çok kullanışan trigilisin sülfattır. Dielektrik malzemeler boyunca bir elektriksel alan uygulandığında, malzemenin dielektrik sabitine bağlı olarak bir elektriksel polarlanma gözlenir. Elektriksel alan ortadan kaldırılınca bu polarlanma kaybolur. Trigilisin sülfat kullanıldığında bu elektriksel alan ortadan kalktığında bile polarlanma devam eder. Fotoiletken Dedektörler: Kurşun sülfür, indiyum antimonürgibi yarı iletken maddelerden yapılmıştır. Bu maddelerin IR ışımasını absorplaması sonucunda iletken olmayan değerlik elektronları iletkenlik bandına uyarırlar ve yarıiletkenin elektriksel direncinin azalmasına neden olur. Termal Dedektörler: Üzerine düşen ışımayı absorplaması sonucunda sıcaklık yükselmesinin ölçülmesi ilkesine dayanır
12IR spektrumlarının alınması için yöntemler Gaz ise:İçi boş ölçme kabında, spektrum bitene kadar basınç sabit kalmalı.
14Katı ise: 1-KBr peleti hazırlanması 2-Pasta hazırlanması 3-NaCl diski üzerinde katı filmoluşturulmasıEğer örnek katı ise spektroskopikpotasyum bromür (KBr) yardımı ilebirkaç tonluk basınç altında ince şeffaf bir tablet oluşturularak spektrum alınır.KBr’ün infrared bölgesinde absorpsiyonuolmadığı için kullanılması uygundur.Kullanılan KBr nem içermemelidir.Çünkü içerdiği nemin IR spektrumndahatalı bantların gozlenmesine neden olur.
15Çözelti ise: Çözeltilerin spektrumunun alınması sırasında dikkat edilmesi gereken en öenmli şey,şeçilen çözücünün IR bölgesinin her yerindeışığı geçirebilmesi gerekmektedir. Bu nedenleen fazla tercih edilen çözücülerkarbontetraklorür, kloroform, karbondisülfür,siklohekzan, benzen, tetrakloroetilendir. Buçözücülerden uygun olanı herhangi biriile örneğin % ‘lük bir çözeltisi hazırlanır. Hazırlanan bu çözelti infrared sellerine koyulur. Ayrıca kullanılan çözücünün hücreninn yapıldığı maddeyi çözmemesine de dikkat edilmelidir.
16Fonksiyonlu grup bölgesi: 4000-1500 cm-1 Parmak izi bölgesi: 1500-400 cm-1
17Deneysel parametre maksimum dalga sayısıdır ve maksimum soğurma bandının yerini gösterir.
18IR spektrumları ne tür bilgi verir? Nitel analiz:organik bileşiklerin yapısındaki fonksiyonel grupların belirlenmesiİki organik bileşiğin aynı olup olmadığının anlaşılmasıNicel analiz: Çok az kullanılır
19Biyokimya için IRMakromoleküllere ligand bağlanmasını, moleküler konformasyonları, peptit ve membran yapıları ile lipit-protein veya lipit-ilaç etkileşimleriniKarbonhidrat, fosfolipit, aminoasit, polipeptit ve proteinlerin yapısınıRelated polisakkaritlerin yapılarındaki farklılıklarıOksihemoglobin’de demir ile oksijenin bağlanmasınıPeptit azotundaki proton ile peptit karbonili arasındaki hidrojen bağınıProteinler üzerinde hidrojen-döteryum değiştirme çalışmalarıyla çözücü ile peptid bağlarının maruz kalma olasılığının ve proteinin ikincil yapısının incelenmesiProteinlerdeki karboksil grubunun iyonlaşmasını
20Alınan spektrumun değerlendirilmesi 3500 cm-1 de gözlenen geniş pik, yapıda alkol veya fenol olduğunun bir göstergesidir.3000 cm-1 de gözlenen çoklu pik, aromatik bir halkadaki C-H bağlarını; cm-1 de gözlenen çoklu pikler ise aromatik yapıdaki C=C bağlarını göstermektedir.cm-1 deki pikler, yapıdaki eter varlığı (R-O-R) gösterir cm-1 deki pikler, p bağlı karbonlara bağlı hidrojenler(=C-H) nedeniyle gözlenmiştir.
21IR’de nicel analizEn iyi sıvı örnekle yapılır. Kalibrasyon eğrisinin çizimi özelliklekatı örneklerde güçtür ve yüksek oranda hata içerir.
22IR’ deki sorunlar Kayıt hızının düşüklüğü Dalga boyunun kalibrasyonu Duyarlılığın azlığı
23Fourier Transformu Kırmızı Ötesi Spektroskopisi (FTIR) Işık kaynağından gelen tüm frekansların örnek ile aynı andaetkileşmesi sağlanır. Işık kaynağından yayılan IR ışıması birdalgaboyu ayırıcısından geçmeden örnek ile etkileşir..Fourier transformlu spektrofotometrelerde aşağıda gösterilenMichelson interferometresi kullanılır.
24FTIR’nin üstünlükleri Her dalga boyunu tek tek taramak gerekmediği için spektrum birkaç saniyede kaydedilir ve yarık veya prizma kullanılmadığı için duyarlık değişmeden yüksek ayırmalı spektrum elde edilir.Birkaç pg örneğin analizi yapılır, bu nedenle bir kromatograf çıkışında rahatlıkla kullanılabilir.Spektrum dijital şekilde de kaydedildiğinden bir karışımın analizinde bileşenlerden birinin spektrum verileri karışımın spektrum verilerinden çıkılarak diğer bileşenlerin spektrum verileri elde edilebilir.
25FT IR’nın dezavantajıOrtamdaki suyun soğurulması ile protein amid I bandları ve membranda C=O titreşim bandlarının üst üste çakışmasıdır.
26FTIR spektroskopisi proteinlerin ikincil yapılarını bulmak için kullanılan en popüler metodlardan biridir.
30Protein-ligant etkileşimi Antibiyotiklerle proteinlerin nasıl etkileştiğinin incelenmesinde
31KAYNAKLAR www.kimyaevi.com Takumi Noguchi, Detection of protein-cofactor interactions by means of Fourier transform infrared spectroscopy, RIKEN Review No. 41 (November, 2001): Focused on Bioarchitect Research.Mckee, T. Ve Mckee J.R., Biochemistry tha molecular basis of life, International edition, McGrawhill, s:Tural, H., Enstrümental analiz-II Spektroskopik YöntemlerBiyokimyada Lisansüstü Yazokulu, Telefoncu A. Ve diğerleri (editörler) Biyokimyada temel ve modern teknikler.s