Summary
Bu videoda, biz gelişmekte olan omurgalı beyin konfokal mikroskobu ile tek bir hücre çözünürlükte canlı zebrafish embriyolar analiz edildiği bir yöntem gösteriyor. Bu, tek hücreli zebrafish embriyo enjekte ve daha sonra gelişmekte olan beyin montaj ve görüntü hangi yöntemi içerir.
Cite this ArticleCopy Citation
Graeden, E., Sive, H. Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (26), e1217, doi:10.3791/1217 (2009).
Translate text to:
Please note that all translations are automatically generated.
Abstract
Bu video, laboratuarımızda, gelişmekte olan zebrafish beyin (Gutzman ve ark, 2008) viraj ve katlama için gerekli hücre şekli değişiklikleri ve düzenlenmeleri analiz etmek için geliştirdiği yöntem göstermektedir. Böyle bir analiz, omurgalı beynin 3 boyutlu yapısının gelişimi için gerekli olan temel hücre biyolojisi yeni bir anlayış tanıyor ve nöral tüp morfolojilerinden çalışma yeteneğini önemli ölçüde artırır. Embriyonik zebrafish beyin 18 saat sonra döllenme (hpf) başlayarak neuroepithelium şişirmek içinde ventriküller olarak şekillenir. 24 hpf, nöral tüp morfolojilerinden ilk adımları tamamlamalısınız. Burada anlatılan yöntemi kullanarak, bir hücre aşamada embriyo mRNA kodlama membran hedefli yeşil flüoresan protein (memGFP) ile enjekte edilir. Enjeksiyon ve inkübasyonu, embriyo, şimdi 18 ve 24 arasında hpf sonra, agaroz, ters, monte edilir ve konfokal mikroskobu ile görüntülenmiş. Özellikle, floresan görüntüleme için ideal bir sistem haline zebrafish embriyo şeffaftır. Analizler, orta beyin Beyin sınır ve arka beyin odaklanmış olmasına rağmen, bu yöntem 80-100 mikron derinliğe kadar zebrafish herhangi bir bölge analizi için genişletilmiş olabilir.
Protocol
1. Enjeksiyon için mRNA hazırlanması
- Bu prosedürde kullanılan mRNA bir plazmid kodlama CAAX eGFP (memGFP) mRNA transkripsiyonu. İlk plazmid ve ark, 2008 Gutzman göre linearize.
- Sonra mMessage mMachine kiti kullanılarak memGFP mRNA yazıya.
- Ortaya çıkan 1μg/μl için mRNA, kısım, ve mağaza sulandırmak -80 ° C
- Bir hücre aşamada embriyo şerit genişliği ile% 1 agaroz bir enjeksiyon kalıp hazırlayın.
- Enjeksiyon bir gün önce, kadın erkek ayıran çiftleşme kafesleri kurdu.
- Enjeksiyon gününde, enjeksiyon hazırlanmak için bir mikropipet çektirmenin kılcal iğneler kullanarak çekin.
2. MRNA enjekte
- Enjeksiyon gününde, buz üzerinde 1μg/μl memGFP mRNA bir kısım Çözülme.
- 200ng/μl bir final konsantrasyon mRNA 01:05 sulandırınız su ve buz üzerinde tutmak.
- 200ng/μl hazırlanan memGFP mRNA 1μl ile kılcal bir iğne yükleyin.
- Gazla çalışan bir mikroenjektör bağlı bir mikromanipülatör içine yerleştirin iğne yüklendi.
- 1nl enjeksiyon hacmi ayarlayın.
- Önceki günden itibaren çiftleşme kafesleri kadar yabani türü balıklar bölücüler çekin.
- Embriyoların kısa sürede belirtilen olarak toplayın. Orient onları mikromanipülatör uzak tarafında tek hücreli embriyo orta (Westerfield 1995) kapsamına agaroz enjeksiyon kalıp.
- Koryon enjekte edilir ve mRNA tek bir hücrenin içine doğrudan yatırıldığına dair sarısı. Deneme başına yaklaşık 50 embriyolar enjekte edilir. Hücre ikiye böldü enjekte etmeyin.
- , 28 ° C'de orta bir gecede embriyo inkübe embriyolar
3. Montaj ve Görüntüleme Embriyolar
- Embriyoların montaj ve görüntü için, ilgi bir zaman noktasında stereomikroskopta bir saat önce embriyoların forseps ile koryon çıkarın.
- 4 embriyolar kadar montaj için bir slayt hazırlayın.
- Yaklaşık 1 cm çapında bir delik ile 2mm kalınlığında özel olarak tasarlanmış plastik slayt alt lamel mühür silikon vakum gres kullanın.
- % 0.7 agaroz slayt delik doldurun ve yaklaşık 20 dakika veya sertleşmiş kadar bekletin
- Agaroz katılaşmış sonra, her embriyo monte etmek için silindirik delik oluşturmak için 200μl pipet uçları kullanarak küçük bir fiş çıkarın.
- Diseksiyon mikroskobu altında agaroz dolu slayt embriyolar yerleştirin. Embriyoların uyutmak için tricaine 50μl (Westerfield, 1995) ekleyin.
- Altta yatan lamel karşı beyin ya da bölgeye ilgi agaroz silindirik delikler embriyolar konumuna forseps kullanın.
- Agaroz embriyolar silikon vakum gres ile güvenli başka bir lamel ile örtün.
- Görüntü kullanılarak embriyo ters bir lamba, floresan, lazer tarama veya disk konfokal mikroskop iplik. 63x ya da yüksek çözünürlüklü görüntüleri neuroepithelium içinde tek hücre toplamak için daha yüksek görüntü.
- Görüntüler LSM yazılım TIFF dosyaları olarak ihraç ve Photoshop kullanılarak analiz edilmektedir.
4. Temsilcisi Sonuçlar / Sonuç
Şekil 1'de gösterildiği gibi, orta beyin ve arka beyin ventriküller arasında 24 hpf zebrafish neuroepithelium bir temsilcisi konfokal görüntü. Her hücre membran bağlı GFP ile etiketlenir.
Şekil 1. MemGFP-enjekte 24 hpf zebrafish embriyo konfokal görüntüleme Canlı.
(A), GFP tarafından açıklanan her hücre ile 24 hpf embriyo Neuroepithelium. Bölge görüntülü, orta beyin Beyin sınır oluşturan, orta beyin ve arka ventriküllerin (E, H, sırasıyla) ayırır.
Discussion
Bu video, tek bir hücrenin zebrafish embriyolar içine mRNA enjeksiyon için bir yöntem ortaya koymaktadır. Burada, her bir hücre etiket için bir zar-hedefli GFP kodlayan mRNA kullanın. Daha sonra tek bir hücre çözünürlükte gelişmekte olan beyin nasıl montaj ve görüntü göstermektedir. Bu teknik bize hücre şekil değişikliği, orta beyin arka beyin sınır formasyonu (Gutzman ve ark, 2008) için gerekli olan bir roman türü, bazal daralma çalışmak için izin verdi. Benzer diğer olayların analiz omurgalı morfolojilerinden ve altta yatan hücre biyolojisi anlayışımızın önemli ölçüde genişletmek için bir potansiyele sahiptir.
Acknowledgements
Sive laboratuvarda ilk kez bu tekniği geliştirdi Dr. Jennifer Gutzman çok teşekkür ederiz. Lütfen plazmid kodlama CAAX-GFP mRNA sağlanan Dana-Farber Kanser Enstitüsü Boston, MA de JB Green teşekkür ederiz. Konfokal görüntüleme Whitehead WM Keck Vakfı Biyolojik Görüntüleme Tesisleri'nde gerçekleştirildi. HS NIHMH70926 tarafından desteklenmektedir. EG, bir NSF öncesi doktora bursu ile desteklenmektedir.
Materials
|Name||Type||Company||Catalog Number||Comments|
|SeaKem GTG agarose||Reagent||Lonza Inc.||50027|
|3-aminobenzoic acid ethyl ester (Tricaine)||Reagent||Sigma-Aldrich||A-5040|
|Capillary tubing||Tool||Frederick Haer and Co.||30-30-1||Borosil 1.0mmOD x 0.5mm ID/fiber 100mm|
|Silicone vacuum grease||Reagent||VWR international||W0S717|
|Forceps||Tool||Fine Science Tools||11232-20||Dumont #5 Bio Inox|
|1-200 μl Pipette tips||Tool||USA Scientific, Inc.||111-0806||These are the correct size for 24 hpf embryos.|
|mMessage mMachine transcription kit||Reagent||Ambion||AM1340||SP6 RNA polymerase|
|Zeiss LSM 510 scanning confocal||Microscope||Carl Zeiss, Inc.|
|Micromanipulator||Tool||Narishige International|
|Microinjector||Tool||Harvard Apparatus||PLI-100|
|Micropipette puller||Tool||Sutter Instrument Co.|
References
- Gutzman, J. H., Graeden, E., Sive, H. Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction. Mech Dev. 125, (974), 11-12 (2008).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: a Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (1995).