2KROMATOGRAFİ Kromatografi, bir karışımda bulunan maddelerin,biri sabit diğeri hareketli faz olmak üzere birbirleriylekarışmayan iki fazlı bir sistemde ayrılması,tanınması ve saflaştırılması yöntemlerinin genel adıdır.Çeşitli maddelerin hareketli faz yardımıyla,sabit fazüzerinde, değişik hızlarla hareket etmeleri veyasürüklenmeleri esasına dayanır
3Kromatografi tekniğinin temelinde üç ana unsur yer alır. • Sabit faz: Bu faz daima bir "katı" veya bir "katı destek üzerine emdirilmiş bir sıvı tabakasından" oluşur.• Hareketli faz: Bu faz daima bir "sıvı" veya "gazdan" oluşur.• Sabit faz, hareketli faz ve karışımında yer alan maddeler arasındaki etkileşimin türü: Kromatografide "yüzey tutunması veya adsorpsiyon" ile "çözünürlük" gibi olgular temel etkileşim türlerini oluştururlar.
4İlk kez Rus botanikçi Mikhail Tsvett (1903) tarafından geliştirilen bir yöntemdir.Tsvett bu yöntemi bitki pigmentlerinin(klorofil A,klorofilB ve ksantofil)renkli bileşenlerini ayırmakta kullanılmıştır.Kullandığı kolonda renkli bandlaroluştuğundan, bu ayırma yönteminekromatografi adını vermişti
5Bir parça kağıt şeridin aşağı hizasından 1 cm kadar yukarısına bir damla siyahmürekkep damlatınızKağıt şeridi, mürekkep damlattığınızkısım su hizasının üstünde kalacakşekilde su tankına batırınız ve dik birşekilde tutunuz. Su,kapiler etkisiylekağıt üzerinde yukarı doğru yürürkenmürekkebi çözer ve sürüklemeyebaşlar. Mürekkebin içindeki bileşenlerkağıt üzerinde farklı hızlarda ilerleyerekayrılmış olur.
13Başlıca katı dolgu maddeleri (hareketsiz faz) şunlardır: • Silika jel: Genellikle nötür ve asidik yapıdaki bileşikler için uygundur.• Alumina: Genellikle nötür ve bazik yapıdaki bileşikler için uygundur.• Sellüloz: Genellikle biyokimyasal maddeler için uygundur.Hareketli faz görevini üstlenecek çözücüler; Sikloheksan, Kloroform (kansorojen), Metanol, Petrol eter, Metilen klorür, Etanol, Benzen(kansorojen), Etil asetat, Aseton, Toluen, Dietil eter, Karbon tetraklorür(kansorojen), n-Butanol İzopropanol olabilir.
141903 yılında Tsvet bitki pigmentleriyle çalışırken kolon dolgu maddesi olarak kireç kullanmıştı.Günümüzde ise çoğunlukla silika jel ve aluminakullanılmaktadır.
15Kolon Kromatografi Tipleri Kolondaki dolgu maddesi ve seçilen elüsyonmetoduna göre gruplandırılır:i.Jel filtrasyonu büyüklük ii.İyon değişim yükiii.Affinite (bağlanma)
16i.Jel Filtrasyon Kromatografi Karışımdaki moleküllerin molekül büyüklüklerinde göre ayrılması esasına dayanır•Kolon, jel boncuklar(belli büyüklüğe sahip ve karışımdaki bileşenlerle etkileşmeyen bir madde)ile doldurulur katı matriks•Biyomolekül karışımını içeren tampon, kolondan geçirilirKüçük moleküller,jel boncuklar arasındakiboşluklara girer,kolondan geç çıkarlar.Büyük moleküller,jel boncuklar arasındakiboşluklara giremez ve kolondan hızlı birbiçimde sürüklenerek önce çıkarlar.
17Kromatografik ayırma sırasında bozunması veya degişikliğe uğraması istenmeyen protein ya da enzim gibi biyolojikmoleküllerin birbirinden ayrılması için kullanılır.Bu yöntem ile polimerlerin molekül ağırlığı dağılımı da tayinedilebilirAvantaj Büyük miktarda : biyomolekül karışımı saflaştırılabilirDezavantaj: Yavaş ayırım
18ii.İyon exchange (değiş-tokuş) Kromatografi Maddelerin iyonik grupları ile iyon değiştiricideki iyonik grupların eşdeğer miktarlarının karşılıklı yer değiştirmesi esasına dayanırİyon değiştirme kromatografisi, kullanılan iyon değiştiricinin anyon veya katyon aktarmasına göre sırasıyla anyon değiştirme kromatografisi veya katyon değiştirme kromatografisi olarakadlandırılır.Anyon değiştirme kromatografisinde,kolon içindeki sabit tabaka olan matrixe kovalent bağlı iyonlar pozitif yüklüdür,bu iyonlar kolondan geçirilen çözeltideki anyonları kendine çeker,çözeltideki anyonlar ayrılır,sadece katyonlar ortamdan çıkar.Katyon değiştirme kromatografisinde ise,benzer sistemle çözeltideki katyonlar ayrılır,anyonlar ortamdan çıkar.
19Cl- ve I- karışımının nitrat bağlanmış anyon değiştirici RNO3 ile bileşenlerine ayrılmasındageçerli dengeler aşağıdaki biçimdedir:Cl- + RNO3 RCl + NO3I- + RNO3 RI + NO3IAnyonDeğiştiriciCl-R: Çözünmeyen MatriksRNO3 : Anyon Değiştirici
20İyon değiştirmeyi etkileyen faktörler Hareketli faz derişimiHareketli faz pH’sıKompleks oluşturucu etkiİyon değiştirme kromatografisinin uygulanmasıAyrılmaları güç olan bazı iyonları ve asitlerinAminoasitlerSeyreltik iyon çözeltileri deriştirmedeAsit ve baz elde edilmesindeNaCl↔NaOH + Cl
21iii.Affinite Kromatografisi Enzim, hormon,vb spesifik proteinlerin saflaştırılmasında kullanılır.Kolonun dolgu maddesine,(dekstran, poliakrilamid, selüloz vb)spesifik protein ile kompleks yapabilen bir ligand bağlanır:Ligand ile kompleks yapan spesifik protein,katı desteğe bağlanarak kolonda tutulurken; serbest proteinler kolonu terkederler.Bağlı protein, daha sonra, pH değişikliği / tuz çözeltileri veya ligand ilavesiyle kolondan elüe edilirSeçiciliği fazla olan bu yöntem,kromatografi tekniklerinin en yenisidir.Seçiciliği fazla olan bu yöntem,kromatografi tekniklerinin en yenisidir.Antijen – Antikor Enzim – Substrat Reseptör– İlaçgibi oldukça spesifik etkileşimlere dayanır.
22Kolon Kromatografisi a)Gaz Kromatografi (GC) b)Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografi(HPLC)
23GC a) Gaz kromatografisi Bir karışımda gaz halinde bulunan veya kolayca buharlaştırılabilen bileşenlerin birbirinden ayrılması amacıyla gaz kromatografisi yöntemi kullanılır. Bu yöntemde ayrılma, bileşenlerin farklı katı yüzeylerdeki farklı adsorpsiyon ilgilerine göre gerçekleşir. Numunede bulunan bileşenler bir cihazla spektrum haline getirilir ve bu spektrumda bulunan her pik ayrı bir bileşeni gösterir.
24Hareketli faz olarak helyum, azot veya argon gibi inert bir gaz kullanılır ve bu gaza taşıyıcı gaz adı verilir. Kolon içinde kullanılan sabit faz; silika, alumina veya karbon gibi bir katı ise yöntem, gaz-katı kromatografisi adını alır. Eğer sabit faz kiezelguhr gibi inert katı bir dolgu maddesi üzerine tutturulmus uçucu olmayan bir sıvı film ise yöntem gaz-sıvı kromatografisi adını alır. Bu şekilde kullanılan kolonlara dolgulu kolonlar denilir.Gaz kromatografisi yönteminde kolonlar 2-10 mm iç çapında ve 1-5 m boyundadır. Fakat inert bir katı dolgu maddesi üzerine uçucu olmayan bir sıvı kaplanması yerine, bu sıvı filminin doğrudan ince bir cam veya silika kapiler borunun iç yüzeyine tutundurulmasi ile mm iç çapinda ve m gibi çok uzun kapiler kolonların kullanılması mümkün olabilir. Bu nedenle kapiler kolonların verimliligi ve ayırıcılığı, dolgulu kolonlara oranla çok daha iyidir.
25Gaz kromatografisinde, ilk olarak örneğin buharlaştırılması için ısıtılan bir bölme vardır. Hemen ardından sıcaklığı programlanabilen bir fırın içine yerleştirilmiş olan kolon gelmektedir. Sıvı örnekler bir şırıngayla bir septumdan giriş kısmına enjekte edilirler. Kolon çıkışına yerleştirilen bir dedektörden sinyal izlenir ve bir integratör ile kaydedilir. Gaz kromatografisi yönteminde incelenebilen maddeler için belli sıcaklıktaki alıkonma sürelerinin birbirinden farklı olmasından yararlanarak nitel analiz yapılabilir.Bir maddenin alıkonulma süresi, belli bir kolon için, belli sıcaklıkta ve belli taşıyıcı gaz akış hızında sabit bir değerdir. Bu sebeple de,bir iç standart maddesinin analiz örneğine eklenmesi ve sonuçların bu maddeye bağlı olarak belirtilmesi daha çok tercih edilen bir yoldur.Gaz kromatografisi yönteminde nicel analiz ise kromatogramdaki piklerin altlarında kalan alanların hesaplanması ile veya pik yüksekliğinin ölçülmesi ile yapılır.Örneğin, enjekte ettigimiz bir karışımda baslangıçta eşit miktarlarda A ve B bilesenlerinin olduğunu varsaydığımız bir durumda, kromatogramda bu bilesenlere ait piklerin altında kalan alanlar da birbirine eşit olacaktır.
26Bir bileşen kolondan ne kadar erken çıkarsa, o bileşene ait pik de o kadar keskin elde edilirken, kolondan geç çıkan bileşenlere ait pikler ise geniş ve yayvan olarak elde edilmektedir. Bu ise istenmeyen bir durumdur. Bu durumu önlemek için sıcaklık programlaması yöntemi uygulanır. Baslangıçta kolon sıcaklığı düşük tutulur ve zamanla doğrusal bir biçimde arttırılır.
27b) Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi HPLC Sıvı kromatografi bir ayırma tekniğidir. Bir sıvıda çözünmüş ayrılacak bileşenler, bir kolon içerisinde bulunan genellikle katı bir destek üzerindeki sabit faz ile farklı etkileşmelere girerek, kolon içinde değişik hızlarda ilerler. Kolonu değişik zamanlarda terkederler ve böylece birbirlerinden ayrılırlar. Burada taşıyıcı faz olan sıvı, pompalarla kolona basıldığından yüksek akış hızındadır. Bu nedenle ayırma daha kısa sürede ve tam olarak gerçekleşmektedir. Ayrılan bileşik, kolon çıkışına bağlanan uygun bir dedektörle tesbit edilip miktarıyla orantılı olarak kaydedilir. Yüksek hızda gerçekleştirilen ayırmaların yapıldığı sıvı kromatografi sistemlerine, Yüksek Basınç Sıvı Kromatografi (HPSC) denirNormal Faz Sıvı Kromatografisi:Polar sabit faz ve apolar veya düşük polariteye sahip hareketli fazTers Faz Sıvı Kromatografisi:Sabit faz apolar, hareketli faz ise polardır
28Ters faz kromatografisinin avantajları 1. Normal faz kromatografide, sıvı fazın kontrolü çok önemli ve kritiktir.Hareketli faz bileşimindeki küçük değişiklikler kromatogramda belirgin farklılıklara neden olabilir.2. Dengeye ulaşma normal faz kromatografide çok yavaştır.3. Normal faz kromatografide polar maddelerin elüsyonu çok yavaştır ve yayvan piklere sebep olu4. Apolar çözücüler çok pahalıdır, ayrıca nemden uzak tutmak zordur.
29HPLC’nin avantajları• HPLC kolonu, rejenerasyon gerekmeksizin pek çok kezkullanılabilir.• HPLC tekniği kullanıcının becerisine daha az bağımlıdır vetekrarlanabilirlik daha yüksektir.• Nicel analiz kullanılabilir.• Analiz süresi kısadır.• Duyarlık yüksektir.