Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Metagenomic yarı analiz Salmonella gıda ve çevre örnekleri
Chapters
Summary
Automatic Translation
October 25th, 2018
Please note that all translations are automatically generated.
Burada, gıda ve çevre microbiomes DNA örnekleri uyumlu algılama ve Salmonella quasimetagenomic sıralama yoluyla subtyping hazırlamak için bir iletişim kuralı mevcut. Kombine kullanım kültürü zenginleştirme, immunomagnetic ayrılık (IMS) ve birden çok deplasman amplifikasyon (MDA) Gıda ve çevre örnekleri Salmonella genomik DNA'ın etkili konsantrasyon sağlar.
Transcript
Bu yöntem, salmonella'yı gıda örneklerinden saptamak ve genetik parmak izi ile patojeni gerinim seviyesine çıkarmak için kullanılabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, Salmonella algılama ve subtyping'i tek bir iş akışında birleştirmesidir ve Salmonella ile kontamine olmuş gıda örneğinden patojenin parmak izine dönüş süresini önemli ölçüde kısaltır. Başlamak için, aseptik bir dahili filtre ile steril bir laboratuvar blender çantası içine gıda 25 gram örnek yerleştirin veya isteğe bağlı olarak zenginleştirme suyu ile bir sünger nemlendirerek bir çevre bezi hazırlamak, önceden belirlenmiş bir yüzey üzerinde sürükleyerek ve bir blender torbası içine yerleştirerek.
Bir laboratuvar blender kullanarak, iyice RV zenginleştirme suyu 225 mililitre ile her örnek karıştırın. Sonra karışımı 42 derecede 4-21 saat kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, çantanın filtreli tarafında zenginleştirme suyu 50 mililitre alt örnek toplamak.
Daha sonra alt numuneyi 10 dakika boyunca 100 kez g'de santrifüj edin. Supernatant'ı 3, 000 ila 6,000 kez 10 dakika boyunca yeni bir 50 mililitrelik santrifüj tüpve santrifüje dikkatlice aktarın. Supernatant atın ve BPW beş mililitre pelet yıkayın.
BpW beş mililitre pelet resuspend. İlk olarak, buz üzerindeki MDA kitinden örnek tamponve reaksiyon tamponu çözültün. BPW resuspended hücrelerin bir mililitre ve bir mikrosantrifüj tüp anti-Salmonella boncuk 20 mikrolitre yerleştirin.
Mikrosentrifuge tüpünü oda sıcaklığında 30 dakika boyunca dönen bir mikser üzerine yerleştirin. Bundan sonra, üç dakika boyunca bir manyetik stand üzerinde tüp yerleştirin. Bir pelet içine boncuk konsantre manyetik raf birkaç kez ters.
Tüpü manyetik rafta tutarak, aspire edin ve süpernatantı atın. Ardından, tüpe bir mililitre yıkama tamponu ekleyin. Tüp tutucuyu raftan çıkarın ve özellikle bağlayıcı olmayan bakterileri kompleksten çıkarmak için tüp tutucuyu birkaç kez ters çevirin.
Üçüncü yıkamadan sonra, tüpten supernatant aspire ve atın. Sonra manyetik raftan tüp çıkarın ve bir saniye için santrifüj. Daha sonra herhangi bir artık yıkama tampon kaldırmadan önce üç dakika boyunca manyetik raf üzerinde tüp yerleştirin.
Boncuk Salmonella kompleksleri örnek tampon dokuz mikrolitre resuspend ve üç dakika için 95 santigrat derece tüp kuluçka. Buz üzerinde kompleksleri soğutma sonra, reaksiyon tampon dokuz mikrolitre ve enzim karışımı bir mikrolitre ekleyin. Metroyu metin protokolüne göre bir termal döngü içinde kuluçkaya yatırın ve tüpü buz üzerinde soğutun.
Daha sonra, dna konsantrasyonu ve numunenin saflığını ölçmek için bir florospektrometre aleti kullanın. Gelecekteki deneyler için son ürünleri negatif 20 santigrat derecede saklayın. Metin protokolüne göre numune başına 18 mikrolitre PCR karışımı hazırlayın.
Daha sonra mda ürününü yavaşça yukarı ve aşağı boruile karıştırarak karıştırın. PCR karışımına iki mikrolitre MDA ürün süspansiyonu ekleyin. En iyi leştirilmiş gerçek zamanlı PCR protokolünü kullanarak, metin protokolüne göre gerçek zamanlı PCR çalıştırın.
Metin protokolünde belirtildiği gibi MDA ürününe tampon çözümleri ve reaktifler ekleyin ve elde edilen 40 mikrolitre lik sıralama yada prepped MDA ürününü yeni bir plakaya aktarın ve her kuyuya 20 mikrolitre PCR saflaştırma boncukekleyin. Sonra, 10 dakika oda sıcaklığında plaka kuluçka. Daha sonra boncukları %80 etanol ile yıkayın ve 12 dakika kurulayın.
Resuspension tampon 53 mikrolitre kurutulmuş boncuk resuspend ve oda sıcaklığında iki dakika boyunca boncuk kuluçka. Son olarak, üreticinin talimatlarına göre seyreltme ve havuz kütüphaneleri. Bu protokolde, Salmonella DNA'sının hedeflenen miktar değerlendirmesi gerçek zamanlı PCR ile gerçekleştirilmiştir.
Salmonella ile kontamine olmuş tavuk göğsünün iki markasının temsilsonuçları mikrolitre başına 701,54 ile 945,86 nanogram arasında değişmekte ydi ve bu da örnek DNA'nın etkili bir şekilde yükseltildi. Bu yordamı çalışırken, IMS boncukları dikkatlice yıkamayı ve tutmayı, MDA reaktiflerini ve ürünlerini kirletici maddelerden uzak tutmayı ve temiz bir başlık tutmayı unutmamak önemlidir. Bu teknik, geliştirilmesinden sonra gıda güvenliği ve halk sağlığı alanında araştırmacıların salmonella kirleticilerinin gıda numuneleri, ürün ortamları ve tedarik zincirlerindeki hızlı ve yüksek çözünürlüklü takibini keşfetmelerinin önünü açmıştır.
Gıda kaynaklı patojenlerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve kişisel koruyucu ekipman takmak ve iyi laboratuvar uygulamalarını takip etmek gibi önlemlerin bu işlemi gerçekleştirirken her zaman alınması gerektiğini unutmayın.
Related Videos
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
Login to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact firstname.lastname@example.org.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact email@example.com.
To request a trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact firstname.lastname@example.org.