İstanbul'un fethinden sonra Ayasofya Kilisesi'ni cami yapan Fatih Sultan Mehmet, caminin kuzeybatısında bulunan ve o dönem papaz evleri olarak kullanılan yapıyı da medreseye çevirdi. Zaman içinde medrese işlevini sürdüren yapı hemen her dönemde bakım ve onarım çalışmalarından geçti. Sultan Abdülaziz döneminde 1869-1874 yılları arasında yıktırılan ve eski medrese temelleri üzerine yeniden inşa edilen yeni medrese binası, Ayasofya'dan geriye çekilerek batı cephesinin hizasında hazırlanan projelere göre yapıldı.
Son Ayasofya Medresesi, Daru'l-Hilafetü'l-Aliye Medresesi olarak kullanılırken, 1924'de İstanbul Belediyesi tarafından Öksüzler Yurdu olarak değerlendirildi. 1934 yılında Ayasofya Müze olduğunda medrese bir süre daha Öksüzler Yurdu olarak kullanıldı. 1936 yılında harap olması ve kullanıma müsait olmaması sebebiyle yıktırıldı.
Kültür Varlıklarını Koruma Bölge Kurulu'nun 19 Aralık 2012 tarih ve 1069 sayılı kararı ile medresenin yeniden aslına uygun olarak yeniden inşaasına başlanması uygun bulundu. İstanbul Rölöve Anıtlar Müdürlüğünce 11 Aralık 2017'de Ayasofya Medresesi ilk etap işine başlandı. 31 Aralık 2019'da işin tasfiyesi yapıldı. Vakıflar Genel Müdürlüğü tarafından yapılan ihale sonucu geçen yıl 25 Nisan'da Ayasofya Fatih Medresesi tamamlama işi yer teslimi gerçekleştirildi. O tarihten sonra yeniden inşaası için başlayan çalışmalarda sona gelindi. Medrese'nin, açılış törenine Cumhurbaşkanı Recep Tayyip Erdoğan'ın da katılması bekleniyor.