4. DENEYSEL SONUÇLAR ve TARTIŞMA
4.3. Eksozom Üretimi, İzolasyonu ve Karakterizasyonu
71
72 osteokondral hasar onarımının PBS kullanılan grubuna göre çok daha iyi olduğunu göstermiştir [151]. Kök hücre dışında osteoblast türevli eksozomlar da kemik doku rejenerasyonu çalışmalarında kullanılmaktadır. Cui ve ark. MC3T3E1 türevli eksozomların osteojenik miRNA’ lar içerdiğini bulmuş ve fare kemik iliği stromal ST2 hücreleri tarafından hücre içine alındığında, bu hücrelerde osteoblast farklılaşmasını desteklediği belirtmiştir [152].
Pre-osteoblastik MC3T3-E1 hücre hatları ve bunların türevleri, doku mühendisliği çalışmalarında en sık kullanılan ve en iyi bilinen in vitro osteojenik modellerdir. Şekil 4.19’da özgül üreme hızı 0.019 sa-1 ve ikilenme süresi 36 sa olan MC3T3-E1 hücre hatlarının kültür boyunca çoğalma ve farklılaşma kapasiteleri çok yüksektir [153].
Ayrıca pre-osteoblastik hücre hatlarında kültürün, 3. gününden itibaren Tip 1 kollajen sentezi, 3. gününden 21. güne kadar hücrelerin ALP enzim aktivitelerinde artış ve 14.
gününde askorbik asit ve inorganik fosfat varlığında mineral birikiminin gerçekleşmektedir. Tüm bu olumlu özellikler MC3T3-E1 hücre hatlarının in vitro kemik doku mühendisliği uygulamalarında kullanılabilecek ideal bir hücre kaynağı olduğunu göstermektedir [154-156]. Bu nedenle, gerçekleştirilen tez çalışmasında da eksozom kaynağı olarak MC3T3-E1 hücre hattı kullanılmıştır.
Şekil 4.19. MC3T3-E1 hücrelerine ait (a) büyüme eğrisi, (b) fibroblastik morfololijeki görüntüsü.
a) b)
73 Eksozomlar birçok hücre tarafından salınmaktadır ve tüm vücut sıvılarında bulunmaktadır. Eksozomlar kültür ortamlarından veya kan, serum, idrar, anne sütü gibi biyolojik vücut sıvılarından çeşitli teknikler kullanılarak izole edilmektedir. Bu teknikler ultrasantrifüj yöntemi, yoğunluk gradient santrifüj, ultrafiltrasyon, büyüklükçe ayırma kromatografisi, polimer esaslı çöktürme ve immünolojik izolasyondur. Ancak söz konusu eksozom izolasyon teknikleri arasında en yaygın olarak kullanılan ve altın standart olarak belirtilen ultrasantrifüj yöntemidir. Her yöntemin kendine özgü avantaj ve dezavantajları bulunmaktadır. Yüksek hacimlerde çalışılabilmesi, herhangi bir çökelme ajanı kullanmadan direk hücre kültürü ortamından eksozom izolasyonunun yapılması ve literatürde kullnılan en yaygın yöntem olması sonucu izolasyon yöntemi olarak ultrasantrifüj yöntemi seçilmiştir.
Hücreler tarafından kültür ortamına salınan eksozom miktarının belirlenmesi için izolasyon sonucu eksozomlardaki protein miktarı hesaplanmaktadır. Literatürde üretilen eksozom miktarının hücre kaynağına bağlı olarak değiştiği belirtilmektedir. Bilinen tüm hücre türlerinden eksozom salımı gerçekleşmektedir ancak bu hücre türlerinden hangi seviyede eksozom üretildiği tam olarak bilinmemektedir. Literatür incelendiğinde hücreler tarafından üretilen eksozom miktarı hücre kaynağına bağlı olarak milyon hücre başına 0.005- 0.5 µg aralığında değişmektedir [133].
Eksozom verimi Bölüm 3.3.3.’te detaylı olarak anlatılan Bradford protein analizi yöntemi ile kantitatif olarak belirlenmiştir ve sonuçlar Çizelge 4.1’de gösterilmiştir.
Kolorimetrik yöntem ile protein tayini eksozom verimini belirlemede en sık kullanılan yöntemlerdir. Bu yöntemlerden Bradford protein testi, Coomassie Brillant mavi organik boyasının proteinlerle etkileşimi sonucu mavi renk oluşturması temeline dayanmaktadır (Şekil 4.19). Şekil 4.20’de eksozom protein mitarının belirlenmesi için kullanılan kalibrasyon grafiği verilmiştir. Grafikte absorbans değerleri yer alan BSA standart dilüsyonların en yüksek derişimi 500 µg/mL’den başlamaktadır ve iki kat seyreltmeler ile yaklaşık 4 µg/mL’ye kadar düşmektedir. Şekil 4.21’de elde edilen standart kalibrasyon grafiği kullanılarak eksozom protein miktarı hesaplanmaktadır.
Eksozomların türetildiği hücreye benzer biyolojik ve fizyolojik özelliğe sahip olduğu bilinmektedir. Bu nedenle, tez çalışması kapsamında MC3T3-E1 pre-osteoblast kaynaklı eksozomların kemik rejenerasyonu üzerindeki etkisinin daha iyi
74 incelenebilmesi için, MC3T3-E1 hücreleri hem büyüme ortamında hem de farklılaşma ortamında kültüre edilmiştir. Bradford protein testi ile büyüme ve farklılaşma ortamında kültüre edilmiş MC3T3-E1 hücrelerinden izole toplam eksozom miktarı sırasıyla milyon hücre başına yaklaşık 0.40 ve 0.19 µg eksozom olarak bulunmuştur ve bu değerler ilgili literatürle uyumludur [133, 157]. İlgili literatür incelendiğinde, hücresel yoğunluğun eksozom verimini etkileyen faktörlerden biri olduğu belirtilmiştir [158].
Dolayısıyla, farklılaşma ortamında inkübe edilen MC3T3-E1 hücrelerinin, hücre yoğunluğundan dolayı kontak inhibüsyona uğrayarak, aktif olarak bölünen büyüme ortamındaki hücrelere kıyasla daha az eksozom salındığı sonucu çıkarılabilir.
Çizelge 4.1. Pre-osleoblast hücreleri tarafından salınan toplam eksozom miktarı.
Kültür Ortamı Kültür Koşulları Eksozom Miktarı
(µg/106 Hücre)
Büyüme Ortamı
6 gün büyüme +
1 gün FBS içermeyen büyüme ortamı 0.40
Farklılaşma Ortamı
2 gün büyüme + 4 gün farklılaşma +
1 gün FBS içermeyen farklılaşma ortamı
0.19
Şekil 4.20. Bradford protein analizinde Coomassie Brillant mavi organik boyasının proteinlerle etkileşimi sonucu mavi renk oluşturması.
75 Şekil 4.21. Bradford protein analizine ait kalibrasyon grafiği.
MC3T3-E1 hücrelerinden izole edilen eksozomların protein içeriği Bradford yöntemine ek olarak Nanodrop A280 ile Protein Analizi ile de incelenmiştir. Bradford analizine göre 22 µg/mL olarak bulunan eksozom miktarı nanodrop A280 ile protein analizi ile 1321±32 µg/mL olarak bulunmuştur. Yöntemler karşılaştırıldığında eksozom miktarlarında görülen bu farkın en önemli sebebi, nanodrop A280 ile protein analizinde membran parçalanarak eksozomal protein içeriği ölçülür iken, Bradford yönteminde membran yapısı parçalanmadan sadece membran üzerindeki proteinlerin tayini gerçekleştirilmesidir. Eswaran ve ark. çalışmalarında seminal plazmadan ultrasantrifüj yöntemi ile izole ettikleri eksozom verimini Nanodrop A280 yöntemi ile 7564 µg/mL±14.39 hesaplamıştır. Eksozom verimi türetildiği hücre kaynağına bağlı olarak değişmesine rağmen, çalışma kapsamında Nanodrop ile ölçülen toplam eksozomal protein miktarı literatürle uyumludur [159]. Ancak her iki yöntemde de ölçülen protein miktarından eksozom verimine geçiş yapılmaktadır. Bu nedenle eksozomun parçalanarak toplam eksozomal protein miktarının ölçüldüğü Nanodrop A280 yönteminin daha doğru olduğu şeklinde bir yorum yapılmaktadır.
Türetildiği hücre türünden bağımsız olarak eksozomlar kendilerine özgü alyuvar yapısına benzer, kupa şeklinde (Cup-shape) bir morfolojiye sahiptir. Şekil 4.22’de büyüme ortamında kültüre edilen MC3T3-E1 hücre hattından izole edilen eksozomlara ait TEM görüntüleri verilmiştir. Şekil 4.22 incelendiğinde tüm yapıların eksozoma özgü kupa şeklinde içe bükülmüş morfolojide olduğu görülmektedir [133]. Zachary ve ark.
y = 0,0015x R² = 0,9675
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45
0 50 100 150 200 250 300
Absorbans (nm)
Derişim (µg/mL)
76 bir çok hücre hattından izole ettikleri eksozomların yuvarlak ve kupa benzeri morfolojide olduğunu belirtmiştir [160]. Şekil 4.22’de verilen bulgular ultrsantrifüj yöntemi ile izole edilen yapıların eksozom olduğunu kanıtlayan niteliktedir ve izolasyon yöntemin başarılı bir şekilde uygulandığını göstermektedir.
Şekil 4.22. MC3T3-E1 kemik öncülü hücrelerinden izole edilen eksozomlara ait (a) düşük ve (b) yüksek büyütmelerdeki TEM görüntüleri. Kırmızı okla gösterilen yapılar kupa şeklindeki görünüme sahip eksozomları temsil etmektedir.
Eksozomlar 40-100 nm çapa sahip, bilinen birçok hücre tarafından ekstraselüler boşluğa salınan morfolojik açıdan kupa şeklinde olan endositik veziküllerdir [133]. İzole edilen eksozomların TEM görüntüleri, ImageJ programına aktarılmış ve nano yapıdaki bu veziküllerin ortalama çap ve çap dağılımları hesaplanmıştır. Eksozom boyut dağılımı Şekil 4.23’de gösterilmektedir. İlgili literatür incelendiğinde, Ramteke ve ark. prostat kanser hücre hatlarından izole ettikleri eksozomların boyutlarının 50-100 nm aralığında olduğunu belirtmiştir [161]. Şekil 4.23 incelendiğinde eksozom boyutlarının ilgili literatürle uygun şekilde heterojen bir dağılımda olduğu ve en yüksek frekansın 96 nm boyutunda olduğu görülmektedir. Histogramda 100 nm’den daha büyük boyuttaki yapılar aglomere olmuş eksozom kümelerine aittir [161]. Sonuç olarak izole edilen eksozomların boyutları yaklaşık 98±30 nm olarak hesaplanmıştır ve sonuçlar literatürle uyumludur [133].
77 Şekil 4.23. Pre-osteoblast kemik öncülü türevli eksozomların çap dağılım histogramı.
Kupa şeklindeki morfoljiye sahip eksozomlar endositik yollarla meydana gelen çift katlı fosfolipit yapıda membranla çevrili veziküllerdir [57]. Bu sebeple eksozomlar endozomal kökenli olduğunu gösteren CD9, CD63 ve CD81 tetraspanin protein belirteçlerine sahiptirler. Pre-osteoblast kökenli eksozomların yüzey belirteçlerinin belirlenmesinde FACS (Akış Sitometrisi) analizi kulalnılmıştır. Eksozomlar akış sitometrisi analizi ile doğrudan ölçümü yapılamayacak kadar küçük boyuttadır. Bu sebeple eksozomların Bölüm 3.3.3’ de detaylı olarak anlatıldığı şekilde 3.9 µm çapa mikrokürelere sabitlenerek FACS analizi gerçekleştirilmiştir. Şekil 4.24’te CD9 ve CD81 antikorları ile gerçekleştirilen FACS analizi sonuçları gösterilmektedir. Şekil 4.24.c ve d’de sırasıyla pozitif kontrol grubuna ait eksozom yokluğunda CD9 ve CD81 yüzey belirteçlerinin FACS analiz sonucunu gösterirken, Şekil 4.24.e ve f’de ise sırasıyla eksozom varlığında CD9 ve CD81 yüzey belirteçlerinin FACS analiz sonucu verilmiştir. Şekil 4.24.c ve d’de pozitif kontrol gruplarında antikor bağlanma oranı % 1.3 ve % 0.3 oranında çok düşük iken, Şekil 4.24.e ve f’de, eksozom içeren deney gruplarında antikor bağlanma oranın % 98.7 ve % 85.5 olduğu görülmüştür. Elde edilen bulgular izole edilen yapıların eksozoma özgü yüzey belirteçlerine sahip olduğunu dolayısıyla yapının eksozom olduğunu kanıtlayan niteliktedir [162]. Eksozom karakterizasyon çalışmalarında elde edilen tüm sonuçlar birbirini desteklemektedir ve literatürle karşılaştırmalı olarak yapılan değerlendirmeler eksozomların yüksek saflıkta izole edildiğini göstermektedir.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
44 57 70 83 96 109 122 135 148 161 174
Frekans
Eksozom Boyut Dağılımı (nm)
Frekans
78 CD9 Yüzey Belirteci CD81 Yüzey Belirteci
Şekil 4.24. CD9 ve CD81 antikorları ile gerçekleştirilen FACS analizi.
Negatif kontrol grubu (Mikroküre)
Pozitif kontrol grubu (Mikroküre + antikor) Deney Grubu (Mikroküre + antikor + eksozom)
79