We are searching data for your request:
Upon completion, a link will appear to access the found materials.
Hoechst 33342 nükleer DNA'ya bağlandığında mavi spektrumun yayıldığını anlıyorum. Ama kırmızı spektrum bize tam olarak ne söylüyor?
Kırmızı spektrumun apoptoz, hücresel karmaşıklık veya sitoplazmik içerik için bir vekil göstergesi olabileceğini okudum.
Hücresel bağlam açısından kırmızı spektrum tam olarak neyi gösterir?
Düzenle**
Bu soruya daha erken dönemediğim için üzgünüm. Cevabı bu yazıda buldum: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0022175995002146#
Apoptoz sırasında görünüşte yoğunlaştırılmış kromatin, hoechst'in kırmızı bir spektruma kaymasına neden olur.
Görünür Spektrum: Dalga Boyları ve Renkler
İnsan gözü, kabaca 400 nanometreden (mor) 700 nanometreye (kırmızı) kadar değişen dalga boylarında renkleri görür. 400-700 nanometreden (nm) gelen ışık, insanlar tarafından görülebildiği için görünür ışık veya görünür spektrum olarak adlandırılır. Bu aralığın dışındaki ışık diğer organizmalar tarafından görülebilir ancak insan gözü tarafından algılanamaz. Dar dalga boyu bantlarına (tek renkli ışık) karşılık gelen ışık renkleri, ROYGBIV kısaltması kullanılarak öğrenilen saf spektral renklerdir: kırmızı, turuncu, sarı, yeşil, mavi, çivit mavisi ve mor.
Büyüme Işık Spektrumu Nedir?
Büyüme ışık spektrumu, bitki büyümesini teşvik etmek için bir ışık kaynağı tarafından üretilen ışığın elektromanyetik dalga boylarını ifade eder. Fotosentez için bitkiler, nanometre (nm) cinsinden ölçülen dalga boylarının (400nm-700nm) PAR (fotosentetik aktif radyasyon) bölgesindeki ışığı kullanır.
Nanometreler evrensel bir ölçü birimidir ancak aynı zamanda ışık spektrumunu ölçmek için de kullanılır. gözle görülür ışık spektrumu dalga boyları (380-740nm). Bitkiler ise dalga boylarını algılar. dahil olmak üzere UV ve Uzak Kırmızı spektrumlarını dahil etmek için görünür ışığımız ve ötesi.
Işık spektrumlarının, çevresel koşullar, mahsul türleri vb. gibi şeylere bağlı olarak bitki büyümesini farklı şekilde etkilediğine dikkat etmek önemlidir. Tipik olarak, bitkilerde ışık enerjisini kimyasal enerjiye dönüştürmekten sorumlu molekül olan klorofil, fotosentez için mavi ve kırmızı ışık spektrumlarındaki ışığın çoğunu emer. . PAR aralığının tepelerinde hem kırmızı hem de mavi ışık bulunur.
Bunun bir yolu Zeeman etkisinden geçer. Absorpsiyon çizgisinin başladığı bölgede bir manyetik alanın varlığı, bir atomun enerji seviyelerini birden çok bileşene bölebilir. Bu bölünmüş enerji durumları arasındaki geçişler daha sonra ayrı dalga boylarında birden çok bileşenli absorpsiyon hatlarına yol açar. Bileşenlerin sayısı ve bölünmenin boyutu, enerji durumlarının kuantum sayılarına ve uygulanan manyetik alanın boyutuna bağlıdır. Alan yeterince güçlüyse, ayrı bileşenler ölçülebilir ve bunların ayrımları bize manyetik alan gücü hakkında bilgi verebilir. Bazen, spektrumda ayrı çizgiler birlikte bulanıktır, ancak alan gücünü vermek için absorpsiyon çizgisinin toplam genişliği modellenebilir.
Çoğu zaman, bileşenler çözülmek için yeterince ayrılmamıştır, ancak farklı polarizasyon durumlarına sahip olduklarından, ayrılmaları polarize filtreler aracılığıyla gözlemlenerek yine de çıkarılabilir. Hangi polarizasyon durumlarının gözlemlendiğine bağlı olarak çizgilerin dalga boyu değişecektir. Bu spektropolarimetri olarak bilinir. Manyetik alanın yönüne de duyarlı olabilir.
Bir örnek yardımcı olabilir. Aşağıdaki Kochukhov'dan (2017) alınan grafik, Zeeman bölünmesine biraz duyarlı olan üç spektral bölge için manyetik olarak aktif M-cücelerin bazı yüksek çözünürlüklü spektrumlarını göstermektedir. bilmen gerek içsel absorpsiyon profili). Mavi noktalı çizgi, manyetik alan olmadan beklediğinizi gösterir ve kırmızı çizgiler, yüzeyi kaplayan güçlü (birkaç kG) manyetik alan içeren verilere uyan modelleri gösterir.
Soldaki çizgiler basitçe genişletilmiştir, çünkü çoklu bireysel Zeeman bileşenleri çözümlenemez (aslında, manyetik alan yıldız yüzeyi boyunca tek tip bir değere sahip olsaydı, yalnızca ayrı bileşenler olurdu, ki bu pek olası görünmüyor, bu nedenle takılan alan kuvveti bazılarını temsil ediyor. ortalama). Ortadaki ve sağdaki çizgiler, en güçlü manyetik alana (WX UMa) sahip yıldızdaki tek tek Zeeman bileşenlerini hemen hemen görebileceğiniz durumları temsil eder.
Sonuçlar
Seçilen tek hücrelerin DNA'sını boyamak amacıyla Hoechst33342'ye bir fotokafes yerleştirdik. Bu, serbest bazlı Hoechst33342 ile reaksiyona sokularak sağlandı. Ö-nitrobenzil bromür 1 fotoğraflı Hoechst vermek için (pcHoechst, Şekil 1b, Destekleyici Bilgilerde Şema S1). K ile DMF'de reaksiyonu çalıştırarak2CO3 60 °C'de bir baz olarak, HPLC saflaştırmasından sonra başlangıç materyali ve bis-benzillenmiş Hoechst arasında tatmin edici bir %39 verimle pcHoechst'i izole ettik. Saflık, UHPLC ile >%95 olarak değerlendirildi (Şekil S1). Benzilasyonun ilk olarak 4'te meydana geldiği belirlendi.n-metil piperazino grubu, ROESY tarafından belirlendiği gibi bir kuaterner amonyum tuzu verecek şekilde (Şekil S2). UV ile mavi ışıkla aydınlatma, molekülü parçalayarak Hoechst33342'yi serbest bırakacaktır (Şekil 1c).
bir ilk laboratuvar ortamında hedef bağlama üzerine flüoresansı değerlendirmek için deney, firkete DNA'sı (hpDNA) 100 nM pcHoechst'e (mavi) karşı titre edildi ve 100 uM hpDNA'ya kadar flüoresansta bir artış tespit edilmedi (Şekil 1d). Hoechst33342 (100 nM, siyah) bir EC ile pozitif kontrol görevi görürken, daha yüksek DNA konsantrasyonları daha yoğun flüoresansla sonuçlandı (Şekil S3)50=44.6 nM. PBS'de (20 μM bileşik) UV/Vis spektrumlarını karşılaştırarak, pcHoechst'in (mavi, λmaksimum=351 nm) Hoechst33342 (siyah, λmaksimum=340 nm Şekil 1e). Bileşiğin UV/Vis spektrumları 1 (gri) aynı koşullar altında ortaya çıktı λmaksimum=350 nm ve bileşiğin UV/Vis spektrumunun hesaplanan ilavesinden sonra 1 ve Hoechst (kesik çizgi) teorik spektrumun pcHoechst'ten farklı olduğunu bulduk. Bileşiğin yok olma katsayısı 1 350 nm'de belirlendi ϵ350 nm(1)∼5200 M −1 cm −1 (Şekil S4). Düşük DNA konsantrasyonundaki flüoresans değerlerini karşılaştırdığımızda, nitrobenzil grubu tarafından bisbenzimid arka plan flüoresansının söndürülmesinin meydana gelmediğini öne sürerek Hoechst ve pcHoechst arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar gözlemleyemedik. Ancak, 1 mM hpDNA varlığında absorbans ölçümleri tekrarlandığında, Hoechst33342 için absorbans (Şekil 1f) ve emisyonda (Şekil 1g) belirgin bir artış gözlemledik. e karşı pcHoechst. Ayrıca, Hoechst33342 ve pcHoechst için sırasıyla 51 kat ve 1,6 kat artan hpDNA inkübasyonu üzerine floresan kuantum verimindeki artışla açılmayı tahmin ettik (Şekil 1h).
Daha sonra görüntüleme deneylerine döndük selüloda HeLa hücrelerini Hoechst33342 ve pcHoechst (her biri 10 μM) ile inkübe ederek ve bir UV LED ile aydınlatılmış veya aydınlatılmamış (λkafesten çıkarmak=365 nm, 4 s, 76 μW LED gücü) pcHoechst ile muamele edilmiş hücrelerde nükleer ve arka plan sinyalindeki bir artışı gözlemlemek için (Şekil 2a, Destekleyen Filmler 1–4). UV ışığı ile aydınlatmadan sonra, geniş alan modunda görüntülemeye devam ettik (Şekil 2b) ve 24 saat sonra videoyu kaç hücrenin bölündüğü için değerlendirdik (Şekil 2c). UV aydınlatması olmadığında bile 10 μM Hoechst33342 için öldürücülük yüksek iken, 100 nM kullanıldığında daha az belirgindi. İlginç bir şekilde, pcHoechst, UV aydınlatması olmadığında araçla tedavi edilen hücrelere kıyasla hiçbir toksisite göstermedi. Tüm koşullar için, UV ışıması toksisitede açık bir eğilim gösterdi, ancak hücre bölünme oranı, 100 nM Hoechst33342 ile tedavi edilen hücrelere kıyasla 10 uM pcHoechst ile tedavi edilen hücrelerin aydınlatılmasından sonra daha yüksekti. Bu ilk karakterizasyonla, birkaç avantaj sunan konfokal mikroskopi ile pcHoechst'i kullanmaya hevesliydik: i) daha kısa piksel aydınlatması, ii) arka plan üzerinde geliştirilmiş sinyal ve iii) hedefli kafesten çıkarma yapılabilir. Yine, 10 μM pcHoechst ile tedaviden sonra ilk global kafesten çıkarma işlemini gerçekleştirmek için canlı HeLa hücreleriyle başladık. Bu nedenle, yüksek yoğunluklu bir yüksek frekanslı UV ışık taraması uygulandıktan sonra flüoresansta ani bir artış gözlemlendi (λkafesten çıkarmak=355 nm, 15 s, 1.10 mW lazer gücü) görüntü almadan önce (λeski=355 nm, λem=420–500 nm), 5 dakika içinde doygunluğa ulaşır (Şekil 2d, e, Destekleyen Film 5). Daha uzun görüntüleme, nükleer bölgelerde floresansı azalttı, muhtemelen daha yüksek lazer güçleri kullanılarak desteklenen ağartmayı yansıtıyordu (Şekil S5). Zaman içinde çizgi profillerinin floresan yoğunluğunun analizi, kafesten çıkarmadan sonra bir dakika içinde nükleer laminadaki heterokromatinden zengin bölgelerde ilk sinyal görünümünü ve ardından kafesten çıkarmadan sonra 3 dakika içinde çekirdeğin içinde bir artış olduğunu gösterir (Şekil 2f). Bu, Hoechst türevleri ile bilinen, yoğunlaştırılmış heterokromatik bölgelerin tercihli olarak boyandığını veya bol sitoplazmik kafeslenmemiş Hoechst'in çekirdeğe yayıldığını ve ilk önce temas ettiği bölgeleri boyadığını yansıtabilir. Çekirdeğin dışındaki noktalar, lizozomal sistemdeki birikime atadığımız görünürdü. Bu, endo- ve lizozomal sistemin saptanması için bir leke olan mCLING23 ve asitleştirilmiş lizozomlar için bir leke olan LysoTracker kırmızısı varlığında görüntüleme ile desteklenir ve bunların her ikisi de kafeslenmemiş pcHoechst ile belirgin bir kanama olmaksızın birlikte lokalizasyon gösterir (Şekiller). 2g, S6 ve S7) ve pozitif Pearson katsayısı ile r=0.338±0.151 (Şekil 2h, r=-0,260±0,115 LysoTracker olmayan görüntüler için). Ayrıca ekstranükleer sinyalin toplam entegre sinyal yoğunluğunun %7,2±3,2'si olduğunu belirledik. İlginç bir şekilde ve lizozomal sinyal gözlemimiz için daha fazla destek olan Hoechst33342 ve pcHoechst, sitrik asit tamponunda biraz farklı spektrumlar ve daha yüksek kuantum verimleri gösterir (pH 4 Şekil S8).
selüloda pcHoechst'in kafesten çıkarılması. A) 4 s UV ışık ışınımından önce ve sonra Hoechst33342 veya pcHoechst (her biri 10 μM) ile inkübe edilmiş canlı HeLa hücrelerinin epifloresan görüntülemesi, pcHoechst ile tedavi edilen hücreler için nükleer floresanda bir artış gösterir. Ölçek çubuğu: 20 μm. B) (A)'daki gibi, ancak faz kontrastlı görüntüler. C) (A)'dan gelen hücreler, bileşik ve UV tedavisi sırasında tam bir hücre döngüsü boyunca ilerlemek için tek hücre canlılığını belirlemek için 24 saat boyunca görüntülendi, sayılar mutlak hücre bölünmesi olaylarını gösterir. D) pcHoechst (10 uM) ile inkübe edilmiş canlı HeLa hücrelerinin konfokal görüntüleri. Her görüntü arasına, pcHoechst'i kafesten çıkarmak için daha yüksek yoğunlukta UV ışığı uygulandı. Ölçek çubuğu: 20 μm. E) pcHoechst kafesinin açılması üzerine zamanla floresan artışı (n=15 hücre). F) Çizgi taramaları, pcHoechst'in kafesten çıkarılması üzerine (D'deki kesikli çizgiden) zamanla floresan artışına neden olur. G) LysoTracker Red ile etiketlenmiş lizozomal sistem ile pcHoechst'ten gelen sitozolik sinyallerin kolokalizasyonu. Ölçek çubuğu: 5 μm. H) Pearson korelasyonu r sitozolik kollokalizasyon değeri, birlikte uygulanan pcHoechst ve LysoTracker Red için pozitif ve kontrollerde negatiftir, bu nedenle asidik bölmelerden kaynaklanan ekstranükleer sinyaller için tartışılır n=6 hücre.
Daha sonra, canlı hayvanlarda tek çekirdekleri spesifik olarak boyamak ve izlemek için pcHoechst'in uygulanıp uygulanamayacağını araştırdık. Bu nedenle, önce zebra balığı hücrelerinde çekirdeklerin pcHoechst boyamasını inceledik. canlıda ve performansını Hoechst33342 ile karşılaştırdı. Zebra balığı embriyoları, 24 saat boyunca pcHoechst (100 uM) veya Hoechst33342 (100 nM, 1 uM, 10 uM ve 100 uM) içinde inkübe edildi. 100 nM ve 1 uM Hoechst33342 iyi tolere edildi, 10 uM Hoechst33342'de sağkalım hafifçe azaldı, 100 uM Hoechst33342 öldürücüydü ve 10 uM Hoechst33342 hala biraz toksisite gösterdi. Buna karşılık, 100 μM pcHoechst, balıklar ortam ışığı altında veya karanlıkta tutulduğunda zebra balığı gelişimini etkilemedi (Şekil S9). 100 μM pcHoechst ile muamele edilmiş zebra balığı embriyolarının 395 nm UV-LED'lerini kullanan beş dakikalık UV ışıması, muhtemelen 10 μM'den daha düşük aktif bileşik konsantrasyonları veren verimsiz kafessizleştirme nedeniyle herhangi bir toksik etki göstermedi (Şekil S9). Yine de, birkaç çekirdek görünür hale geldiğinden, bu UV ışınlamasının pcHoechst'i başarıyla kafesten çıkardığını gözlemledik, bu da pcHoechst'in zebra balığı embriyolarında kullanılabileceğini gösterir. Karanlıkta veya ortam ışığı altında tutulan balıklarda Hoechst etiketli yapılar görülmedi, bu da pcHoechst'in bu koşullar altında sızdırmadığını gösterdi (Şekil S10).
Zebra balığındaki pcHoechst etiketli yapıların gerçekten çekirdek olduğunu göstermek için nükleer referans lekesi olarak mRFP etiketli bir histon proteini H2B (H2B-mRFP) kullandık (Şekil 3a). H2B-mRFP eksprese eden embriyolar dekoryona edildi ve 32 hpf'den başlayarak 10 uM Hoechst33342 veya 100 uM pcHoechst içinde inkübe edildi. 52 hpf'de pcHoechst, bir hücre kümesini hedefleyen bir konfokal mikroskop üzerinde lokalize 405 nm UV lazer aydınlatması kullanılarak aktive edildi. Hoechst33342 gibi, pcHoechst zebra balığı hücrelerinin çekirdeklerini boyadı ve UV aydınlatmasından sonra H2B-mRFP ile birlikte lokalize oldu, bu da pcHoechst'in kafesten çıkardıktan sonra DNA'ya bağlandığını gösterir (Şekil 3b). Yine ortam ışığı altında ve UV aydınlatması olmadan işlendiğinde zebra balığı embriyolarında floresan pcHoechst sinyali tespit edilmedi, bu da pcHoechst'in ışığa çok duyarlı olmadığını gösterir. Çekirdeklerin hem Hoechst33342 hem de pcHoechst ile yalnızca yüzeysel hücre katmanlarında boyandığını gözlemledik ve bu nedenle aşağıdaki deneylerde yüzeysel hücreleri spesifik olarak hedeflemeye devam ettik.
canlılarda zebra balığı hücre çekirdeklerinin pcHoechst ile görüntülenmesi. A) Şekil 3, 4, S11 ve S12'deki deneyler için genel şematik iş akışı. H2B-RFP mRNA, pcHoechst'in kırmızı flüoresan DNA ile ilişkili bir füzyon proteini (mRFP'ye kaynaştırılmış Histon 2B) ile bağıntılı nükleer boyaması için tek hücreli-aşamalı zebra balığı embriyolarına enjekte edilir. Hoechst33342 veya pcHoechst (32-56 hpf arasında), hedeflenen kafesten çıkarma ve sonraki görüntülemeden önce karanlıkta 4-16 saatlik inkübasyonla uygulanır. B) Agaroz gömülü H2B-RFP eksprese eden zebra balığı embriyoları, gece boyunca 32 hpf'de 10 uM Hoechst 33342 (üst sıra) veya 100 uM pcHoechst (alt sıra) ile inkübe edildi. 52 hpf'de pcHoechst'in kafesten çıkarılması için büyük bir hücre kümesini hedef alan 405 nm UV lazer kullanılarak spot ışınlama yapıldı. 54 hpf'de zebra balığı kuyruk yüzgecindeki hedeflenen alanın eş odaklı görüntülemesi, pcHoechst'in (mavi, alt sıra) mRFP etiketli H2B (kırmızı) ile Hoechst33342'ye (mavi, üst sıra) kıyasla kollokalizasyonunu gösterir. Birleştirme, parlak alan görüntüsünü içerir. Gösterilen görüntüler, aynı parametreleri kullanan üç kafesten çıkarma deneyini temsil etmektedir.
pcHoechst'in uzamsal olarak kontrollü aktivasyonunu oluşturmak için canlıda, zebra balığı embriyolarında tek hücreleri hedeflemek için bir konfokal mikroskobun ağartma noktası işlevini kullandık. Aydınlatma, 405 nm UV lazerin 100 ms ışık darbelerinin 100 döngüsü kullanılarak yapıldı. PCHoechst'i zebra balıklarında minimum UV kaynaklı hasarla yerel olarak kafesten çıkarmak için gereken optimum lazer gücünü belirlemek için 0,0175 ila 0,24 mW arasında bir dizi lazer gücünü test ettik. Yüksek güçlerde (0.20-0.24 mW) hedeflenen hücrelerin yakınında çekirdeklerin boyanması gözlemlenebilir, ancak mRFP etiketli H2B'nin flüoresansı ağartıldı ve embriyonun kuyruğundaki hedeflenen bölge belirgin şekilde yaralandı (Şekil S11). Bu ayarda, büyük olasılıkla hedeflenen hücrelerin ölümü veya yaralanma nedeniyle doku hareketleri nedeniyle pcHoechst sinyali doğrudan hedeflenen çekirdeklerde gözlemlenmedi. UV lazer gücünün tek hücreli çözünürlükte 0,07 mW aktive edilmiş pcHoechst'e daha da düşürülmesi, hedeflenen hücrelerin H2B-mRFP sinyalini korudu ve genellikle hedeflenen hücrelere verilen herhangi bir hasarı hafifletti (Şekil 4). UV lazerin görüntüleme için düşük güçte (0.0175 mW) taranması, hiçbir hücrede pcHoechst'i etkinleştirmedi, bu da kurulumumuzda pcHoechst aktivasyonu için 0.0175 ile 0.07 mW arasında bir eşik yoğunluğunu gösterir. Etkinleştirilmiş pcHoechst'in hücre takibi için kullanılıp kullanılamayacağını araştırmak için, pcHoechst'in 0,07 mW ile 1,5 saate kadar kafesten çıkarılmasından sonra hızlandırılmış kayıt gerçekleştirdik (Supporting Movie 6). Bu süre boyunca lekeli çekirdeğin pcHoechst sinyalini koruduğunu gözlemledik. Ek deneyler, pcHoechst ile boyanmış çekirdeklerin aydınlatmadan en az 10 saat sonra görünür olduğunu ortaya koydu (Şekil S12), seçilen hücrelerin pcHoechst ile birkaç saat boyunca izlenmesinin mümkün olduğunu gösterdi.
canlılarda tek hücreli çözünürlükte optimize edilmiş ışık yoğunluğu ile pcHoechst'in kafesten çıkarılması. H2B-mRFP (kırmızı) enjekte edilmiş zebra balığı embriyoları, gece boyunca karanlıkta 100 uM pcHoechst ile inkübe edildi ve 0,07 mW ve 74 hpf'de 405 nm UV lazer kullanılarak aktive edildi. Ok, iki ağartma noktasıyla hedeflenen bir çekirdeği gösterir. Aydınlatmadan önce ağartma öncesi bir görüntü, ağartma sonrası 7.5 dakika ve ağartmadan 1.5 saat sonra bir görüntü kaydedildi. Beyaz dikdörtgenler büyütülmüş alanları gösterir. Kafessiz pcHoechst (mavi), UV aydınlatmasından 7.5 dakika ve 1.5 saat sonra gözlemlenebilir ve tek bir çekirdekte H2B-mRFP (kırmızı) ile aynı yerde bulunur. Aynı yoğunluğa sahip iki deneyin ve toplamda on deneyin temsili görüntüleri.
Daha sonra, subnükleer boyamayı sağlayan pcHoechst ile DNA'nın daha da hassas lokalizasyonunu elde edip edemeyeceğimizi merak ettik. Bunu kanıtlamak için, zebra balığından daha kolay kurulum sağlayan HeLa hücrelerine döndük. Fotoağartma (FRAP) deneyinden sonra bir floresan geri kazanımında bir ağartma noktası işlevi kullanarak, pcHoechst'i zebra balığına benzer şekilde hücresel özgüllükle kafesten çıkarmayı başardık. Bunu başarmak için, görüntülemeden önce canlı HeLa hücrelerine 100 nM pcHoechst ekledik ve lokal UV aydınlatması uyguladık (λkafesten çıkarmak=355 nm, 10-15 s, 0.11-1.10 mW) hemen ardından floresan gözlemlemek için (λeski=355 nm, λem=420–500 nm) esas olarak hedeflenen hücrenin çekirdeğinde (Şekil 5a). Canlı hücrelerde gösterildiği gibi, Hoechst ağartmasına bağladığımız UV ışığı uygulandıktan sonra hedeflenen bölgede karanlık bir nokta fark edilebilir (Şekil S13). Bundan cesaret alarak, daha küçük, subnükleer bir alanda DNA'yı uzay-zamansal olarak hassas bir şekilde boyayarak bunu daha da ileri götürmeyi hedefledik. Kurulumumuzdaki lazer yoğunluğunu azaltarak (λkafesten çıkarmak=355 nm, 10-15 s, 1.42 μW) lokal olarak tanımlanmış bir noktada DNA'yı kafeslenmemiş Hoechst ile 1,4 μm'ye kadar bir çözünürlükle boyayabildik (Şekil 5b, c), ince ayarlı kromozomal boyamanın yolunu açtık ve gözlem. Şaşırtıcı bir şekilde, önemli sinyal genişlemesini gözlemlemeden 90 saniye boyunca karşılık gelen sinyali gözlemleyebildik, bu da bir subnükleer fraksiyonda DNA'nın kısa süreli izlenmesine izin verdi (Şekil 5d).
pcHoechst kafesten çıkarma, hücre hedeflemesine ve DNA'nın subnükleer görselleştirilmesine izin verir. A) Belirtilen alanda (beyaz daire) UV ışığı ile bir FRAP ağartma noktası kullanılarak pcHoechst (100 nM) ile inkübe edilen canlı HeLa hücrelerinin konfokal görüntülemesi nükleer boyama gösterir. Yüksek lazer gücü (10–15 s için 110–1100 μW) tüm hücreyi etkinleştirir. Ölçek çubuğu: 10 μm.B) (A)'da olduğu gibi, ancak daha düşük lazer gücü (10–15 s için 1.42 μW) çekirdeğin bir kısmında daha hassas kafes açmaya izin verir C) 1.4–1.7 μm çözünürlükle D) 90 s boyunca sabit kalmıştır. Üç tekrardan temsili görüntüler. E) Belirtilen alanda (beyaz daire) iki fotonlu bir lazerle (720 nm, 19.7 mW) bir ağartma noktasını hedefleyen pcHoechst (10 μM) ile inkübe edilmiş canlı HeLa hücrelerinin konfokal görüntüleri, aydınlatılmış çevrede subnükleer boyamayı gösterir. temsili görüntüleri n>15 hücreleri. Ölçek çubuğu: 10 μm.
Sonuç olarak ve fototoksisiteyi azaltmak için pcHoechst'in kafesten çıkarılması için iki foton uyarımı kullanmayı amaçladık. Dalga boyları NIR bölgesinde olduğundan, iki fotonlu mikroskopi, daha düşük saçılma, arka plan ve odak düzleminin dışındaki fototoksisite ile daha derin doku penetrasyonuna izin verir, ancak daha yüksek lazer yoğunluklarına ihtiyaç vardır. 24 Bu nedenle, canlı HeLa hücrelerini 10 μM pcHoechst ile 3 saat inkübe ettik ve ardından hücreleri iki foton uyarımı için ayarlanabilir bir NLO lazeri ile donatılmış dikey lazer taramalı konfokal mikroskoba aktardık. Ne yazık ki, küresel olarak kafesten çıkaramadık, ancak pcHoechst'in loş nükleer sinyalini düşük yoğunluklarda beyazlatabildik (λ=720 nm, 5,6 mW Destekleyen Film 7). Bu nedenle yüksek ve düşük lazer güçleriyle kafesten çıkarma ve görüntüleme gerçekleştirdik (λkafesten çıkarmak=720 nm, 19.7 mW, λresim=720 nm, 2.5 mW), bu da hedeflenen bölgede ağartmaya neden oldu. Bununla birlikte, zamanla yayılan ağartma noktasının çevresinde serbest bırakılan floresan sinyalleri, iki fotonlu kafesten çıkarmanın mümkün olduğunu gösterdi (Şekil 5e).
DNA boyama, moleküler biyolojinin ön saflarında yer almıştır ve dört ana yaklaşım ayırt edilebilir: i) histonlar, çinko parmaklar ve Cas9 gibi DNA bağlayıcı proteinlerin floresan proteinlere kaynaştırıldığı genetik mühendisliği, ii) boya etiketli oligonükleotitler , FISH ve DNA-PAINT için kullanıldığı gibi, iii) küçük moleküllü DNA bağlayıcıların kullanımı ve iv) DNA sentezi sırasında doğal olmayan nükleotitlerin dahil edildiği ve daha sonra biyo-ortogonal bir şekilde reaksiyona girdiği DNA'nın metabolik etiketlemesi üzerinden kimyaya tıklayın. Tüm bu teknikler kendi yollarında güçlü olsa da, bu paleti kullanılabilecek ek bir araçla genişletmeye çalıştık. canlıda hücre altı hassasiyetle ve transgenik bir hayvan yaratmaya gerek kalmadan. Bu arzu edilen özellikler, tasarımı, geçmişte önemli bir miktarı geliştirilmiş olan, DNA'yı hedefleyen küçük moleküllü problarla sınırlandırır: Hoechst33342'nin kendisinden başlayarak, floresan boyalar, spektrumları görünür hale getirmek için bisbenzimid iskelesine kimyasal olarak kaynaştırılmıştır. süper çözünürlüklü görüntülemeyi etkinleştirmek için. 22, 26 Ancak, bu boyalar DNA'yı küresel olarak lekeliyor, bu yüzden talep üzerine sondamızı etkinleştirmenin bir yolunu bulmamız gerekiyordu. Geçmişte, stirilbenzotiyazol 27 türevleri ve tiyazol turuncu modifiye diariltenler 28 gibi DNA'ya bağlanabilmek için ışığı kullanan moleküler boyalar geliştirilmiştir ve bu nedenle aydınlatmanın izin verdiği uzaysal-zamansal kesinliği değiştirebilir. Bununla birlikte, stirilbenzotiyazoller, DNA bağlama karşılıklarına dönüştürülmek için UV-C ışığına (220 nm) ihtiyaç duyarlar ve bu nedenle (özellikle canlı hücrelerde ve hayvanlarda) mikroskobik kurulumlarla uyumsuz görünürken, işlevselleştirilmiş diariletilenlerin boyutu büyüktür ve fotokromizm yavaştır. ve bu nedenle sadece uzun ışınlama süreleri (15 dakika) olan sabit hücrelere uygulanabilir. Bu nedenlerle, canlı hücrelerde UV ila mavi ışık (355-405 nm) aydınlatma ile mikroskobik çalışmalarda kafesten çıkarılabilen Hoechst33342'ye dayalı hücre geçirgen, kafesli bir DNA boyası olan pcHoechst'i sentezledik. DNA'ya bağlı Hoechst33258'in kristal yapısına danışılarak (PDB ID: 8BNA 17), 4-n-metil piparazino grubu rotamerler gösterir ve kısmen solvente maruz kalır (Şekil 1a), ancak bir Ö-nitrobenzil koruma grubu, kuaterner amonyum tuzunu oluşturmak için molekülü 100 μM'ye kadar DNA varlığında floresansı açamaz hale getirir laboratuvar ortamında. Testimizde koruma grubu, bisbenzimidin arka plan floresansının söndürme davranışını göstermedi. Okumamızda pcHoechst'in DNA'ya bağlanmasını dışlayamasak da, deneylerimizde fiziksel bağlanmaya değil, açık floresansa güveniyoruz, bu da kesin mekanizmanın daha fazla araştırmasını ihmal edilebilir hale getiriyor. Boyalar ve ilaçlar gibi diğer moleküller genellikle karboksilatlar ve karbamatlar gibi fonksiyonel gruplar üzerinde sırasıyla asitleri ve aminleri serbest bırakmak için kafeslerle korunurken, 21 kuaterner amonyum tuzları daha önce, örneğin kafeste kullanılan bir çalışmada olduğu gibi "foto kafeslenebilir" olarak tanımlandı. nikotin. 29 pcHoechst, üçüncül aminlerin diğer fotokaglama gruplarına uygun olduğunu gösterdiğimiz bu rapora olumlu katkılar sağlıyor. Ancak, pcHoechst'i nicel olarak kafesten çıkaramadık laboratuvar ortamında ancak uzun süreli ışığa maruz kalma üzerine daha fazla oksidasyon ürünleri gözlemlendi. Bu aynı zamanda nicel olmayan kafesten çıkarmaya da yansır. canlıda, toksisite değerlendirmemizden türetildiği gibi (aşağıyı göster).
DNA'yı işaretlemek için biyolojik bir sistemde pcHoechst'in kafesten çıkarılması, UV aydınlatmasından sonra floresanda (10 uM pcHoechst, 4 saat ön inkübasyon) bir artış gözlemlenerek, ilk olarak canlı HeLa hücrelerinde konfokal bir mikroskopta gerçekleştirildi. İlk görüntü alındıktan sonra, bir sonraki görüntü alınmadan önce 1 kare için daha yüksek lazer gücünde kafes açma işlemi yapılarak çekirdeğin global olarak boyanması sağlandı. Bu ilk deneyler, pcHoechst ile mümkün olan uygulamaların genişliğini vurgular ve bildiğimiz kadarıyla, nükleer organizasyon içinde hedeflenen bir bölgeyi lekeleyebilen, genetik olarak kodlanmamış bir boyanın ilk örneğini temsil eder. İlginç bir şekilde, çekirdek, uzun süreli maruziyetten sonra homojen hale gelmeden önce dış nükleer bölgelerden kaynaklanan sinyallerle başlangıçta heterojen bir şekilde boyandı. Fotoürünlerin, büyük olasılıkla asidik bir ortamda kuantum verimindeki artıştan dolayı, sırasıyla kırmızı ve uzak kırmızı lekeler LysoTracker kırmızısı ve mCLING ile lizozomal sistemde biriktiğini belirledik. Bu kontrol deneyleri ayrıca, pcHoechst ile birlikte daha uzun dalga boylarının kullanılmasının, çift renkli mikroskopiye izin vererek mümkün olduğunu doğrulamaktadır.
Genel bir değerlendirme, özellikle canlı hücrelerde saatlerce kullanılmaları gerektiğinde, küçük moleküllü DNA bağlayıcıların toksisitesidir. 30, 31 Özellikle, pcHoechst sırasıyla HeLa hücreleri ve zebra balığı embriyoları ve larvaları için 10 ve 100 μM'ye kadar toksik değildir, oysa aynı Hoechst33342 konsantrasyonları öldürücüdür (ilk toksisite belirtileri hücrelerde ve balıklarda 0.1 ve 10 μM'de gözlenmiştir). , sırasıyla). Bu, pcHoechst'in DNA bağlanmasının olmadığını veya sadece zayıf olduğunu iddia eder ve kafesten çıkarmadan sonra aktif konsantrasyonun olduğunu öne sürer. selüloda ve canlıda sırasıyla 0.1 ve 10 μM'nin altındadır. Ayrıca, bir epifloresan geniş alan mikroskobu üzerinde bir UV LED ile HeLa hücrelerini 0, 4 ve 10 saniye boyunca yanıp sönerek UV ışınlamasının toksisitesini belirledik ve açık bir zaman ve toksisite ilişkisi gösterdik. Bu nedenle, fotoliz ve (boya) çapraz bağlama gibi UV kaynaklı DNA fototoksisitesinin dikkate alınması gerekir. Bununla birlikte, pcHoechst'in UV ışığı ile kafesten çıkarıldığı tek hücreler mitoz bölünmeyi tamamlayabildi ve bölünebildi.
pcHoechst, balık hücreleri tarafından Hoechst33342'ye benzer bir şekilde alınır ve her ikisi de yüzeysel hücre katmanlarıyla sınırlı görünüyordu. canlıda. Kafessiz, pcHoechst zıt boyamalı H2B-mRFP çekirdekleri ifade eder canlıda sağlam bir floresan sinyali ile ve birkaç saat boyunca tespit edilebilir kaldı. Zebra balığı embriyoları için mevcut aydınlatma protokolümüzle, tek hücreler zaman içinde etiketlenebilir ve izlenebilir. Bununla birlikte, başarılı pcHoechst kafesten çıkarmanın hedef bölgelerinde yine de bir miktar UV kaynaklı doku hasarı gözlemlendi. Bu, uygulamaları sınırlayabilirken canlıda, ışınlama yoğunluğunun ve süresinin daha fazla optimizasyonu ve veya iki foton aktivasyonuna geçiş, 24 zebra balığı dokularına ve DNA'sına verilen hasarı azaltabilir ve hedeflenen boyamanın özgüllüğünü artırabilir. Bir ağartma noktası modülü kullanarak, yüksek lazer gücüne sahip hedeflenen bir çekirdeği veya azaltılmış lazer gücüne sahip çekirdek altı bölgeleri seçici olarak boyayabildik. İlk deneyde, hedeflenen bölgede boya ağartmasına bağladığımız karanlık bir nokta gözlemliyoruz ve gerçekten de kontroller Hoechst33342'nin canlı HeLa hücrelerinde benzer şekilde ağartıldığını gösterdi. İkinci deneyde, düşük lazer yoğunlukları kullanarak, uygulanan ışık dağılımına yakın seçicilikle subnükleer boyamayı vurgularız. Ayrıca, iki foton etkisini kullanarak kafesten çıkarmanın mümkün olduğunu gösterdik. λ=720 nm, bir ağartma noktası kullanarak yüksek güçlere sahip canlı HeLa hücrelerinde. Bu ayarda, tek fotonlu kafesten çıkarmanın aksine ağartma noktasının çevresinde lekelenme gözlemledik. Bu, UV'den mavi ışığa bir darbe ile 1 fotonun kafesten çıkarılması ve ardından iki foton mikroskobu ile görüntüleme için yollar açarak daha hafif görüntüleme koşulları sağlar. Farklı mekanizmalar tarafından hücre ve DNA hasarı göz ardı edilemezken, Hoechst boyaları ve UV-A ışıması ile deneysel sonuçların ve bu nedenle fototoksisitenin, vakadan vakaya değerlendirilmesi gereken mikroskobik kurulumlar arasında farklılık gösterebileceğini kabul etmek önemlidir. 30, 31, 33 Daha fazla iyileştirme için, kimyasal alan piperazin, 21, 34, 35 üzerinde farklı fotofiziksel özelliklere sahip farklı bir fotokafenin kurulmasına izin verirken, fenol üzerindeki bir floresan boyaya konjugasyon, görüntüleme için batokromik kaymalar için gelecekteki olasılıklar sunar. 22, 25, 26 Son olarak, deneyimlerimize göre, pcHoechst aydınlatılmış odalarda işlenebilir ve istenmeyen arka plan aktivasyonu olmadan düşük güçte UV lazerlerle görüntülenebilir. Bu nedenle, canlı hücrelerde ve zebra balıklarında DNA'nın ışıkla aktive olan boyanması için kullanılan basit bir kimyasal biyoloji aracı olarak pcHoechst'i vurguluyoruz.
Yapıları nanometre düzeyinde aydınlatmak için mikroskopi ve nanoskopinin ön planda olduğu zamanlarda yeni araçlara ihtiyaç duyulmaktadır. 36 pcHoechst, DNA'nın küresel, tek hücreli ve subnükleer etiketlemesini uzay-zamansal bir şekilde sağlar.
Hoechst kırmızı ve mavi spektrumları - kırmızı emisyon bize ne söylüyor? - Biyoloji
Işığın organik ve inorganik numuneler tarafından emilmesi ve ardından yeniden yayılması, tipik olarak, aşağıdakilerden biri olarak tanımlanan iyi kurulmuş fiziksel olayların sonucudur. floresan veya fosforesans. Flüoresans prosesi yoluyla ışığın emisyonu, foton absorpsiyonu ve emisyon arasındaki nispeten kısa bir zaman gecikmesinden dolayı, genellikle bir mikrosaniyeden daha kısa sürede değişen, uyarma ışığının absorpsiyonu ile neredeyse eşzamanlıdır. Uyarma ışığı söndürüldükten sonra emisyon daha uzun süre devam ederse, fenomen fosforesans olarak adlandırılır.
Şekil 1 - Epi-Floresan Mikroskop
İngiliz bilim adamı Sir George G. Stokes, floresansı ilk olarak 1852'de tanımladı ve mineral floresanın ultraviyole uyarım ile aydınlatıldığında kırmızı ışık yaydığını gözlemlediğinde bu terimin ortaya çıkmasından sorumluydu. Stokes, flüoresans emisyonunun her zaman uyarma ışığından daha uzun bir dalga boyunda meydana geldiğini kaydetti. 19. yüzyıldaki ilk araştırmalar, birçok örneğin (mineraller, kristaller, reçineler, ham ilaçlar, tereyağı, klorofil, vitaminler ve inorganik bileşikler dahil) ultraviyole ışıkla ışınlandığında floresan olduğunu gösterdi. Bununla birlikte, 1930'lara kadar, biyolojik araştırmalarda doku bileşenlerini, bakterileri ve diğer patojenleri boyamak için florokromların kullanımına başlamadı. Bu lekelerin birçoğu oldukça spesifikti ve floresan mikroskobunun gelişimini uyardı.
Floresan mikroskopi tekniği, geleneksel optik mikroskopi ile diğer kontrast modlarında kolayca bulunmayan nitelikler nedeniyle biyoloji ve biyomedikal bilimlerin yanı sıra malzeme biliminde önemli bir araç haline geldi. Bir dizi florokromun uygulanması, floresan olmayan malzeme arasında yüksek derecede özgüllük ile hücreleri ve alt mikroskobik hücresel bileşenleri tanımlamayı mümkün kılmıştır. Aslında, floresan mikroskobu, tek bir molekülün varlığını ortaya çıkarma yeteneğine sahiptir. Çoklu floresan etiketlemenin kullanılmasıyla, farklı problar aynı anda birkaç hedef molekülü aynı anda tanımlayabilir. Floresan mikroskobu, spesifik numune özelliklerinin kırınım limitinin altında uzaysal çözünürlük sağlayamasa da, bu limitlerin altındaki floresan moleküllerin tespiti kolaylıkla sağlanır.
Çeşitli numuneler, ışınlandıklarında (florokrom uygulaması olmadan) otofloresan sergilerler; bu, botanik, petrololoji ve yarı iletken endüstrisi alanlarında kapsamlı bir şekilde kullanılan bir olgudur. Buna karşılık, hayvan dokuları ve patojenlerin incelenmesi, genellikle ya aşırı zayıf ya da parlak, spesifik olmayan otofloresan ile karmaşıktır. Sonraki çalışmalar için çok daha büyük değere sahip olanlar, florokromlar (ayrıca floroforlar), ışınlayan ışığın belirli dalga boyları tarafından uyarılır ve tanımlanmış ve faydalı yoğunlukta ışık yayar. Florokromlar, kendilerini görünür veya alt-görünür yapılara bağlayan, genellikle bağlanma hedeflemelerinde oldukça spesifik olan ve önemli bir kuantum verimine (foton absorpsiyonunun emisyona oranı) sahip olan lekelerdir. Floresan mikroskopi kullanımındaki yaygın büyüme, iyi anlaşılmış biyolojik hedeflerle birlikte bilinen uyarım ve emisyon yoğunluk profillerine sahip yeni sentetik ve doğal olarak oluşan floroforların geliştirilmesiyle yakından bağlantılıdır.
Uyarma ve Emisyonun Temelleri
Bir floresan mikroskobunun temel işlevi, numuneyi istenen ve belirli bir dalga boyu bandıyla ışınlamak ve daha sonra çok daha zayıf yayılan floresansı uyarma ışığından ayırmaktır. Düzgün yapılandırılmış bir mikroskopta, ortaya çıkan flüoresan yapıların çok karanlık (veya siyah) bir arka plana karşı yüksek kontrastla üst üste bindirilmesi için göze veya dedektöre yalnızca emisyon ışığı ulaşmalıdır. Tespit sınırları genellikle arka planın karanlığı tarafından yönetilir ve uyarı ışığı tipik olarak yayılan floresandan birkaç yüz bin ila bir milyon kat daha parlaktır.
resimli Şekil 1 hem iletilen hem de yansıyan floresan mikroskopisi için donatılmış modern bir epi-floresan mikroskobunun bir kesit diyagramıdır. Diyagramın ortasındaki dikey aydınlatıcının bir ucunda ışık kaynağı (episkopik lamba yuvası etiketli) ve diğer ucunda filtre küpü kulesi bulunur. Tasarım, yansıyan ışığın dalga boyunun uyarımdan daha uzun olduğu temel bir yansıyan ışık mikroskobundan oluşur. Johan S. Ploem, yansıyan ışık floresan mikroskobu için dikey aydınlatıcının geliştirilmesine borçludur. Bir floresan dikey aydınlatıcıda, belirli bir dalga boyunda (veya tanımlanmış dalga boyları bandında), genellikle görünür spektrumun morötesi, mavi veya yeşil bölgelerindeki ışık, bir ark deşarj lambasından veya başka bir kaynaktan gelen multispektral ışığın bir ark-deşarj lambasından geçirilmesiyle üretilir. dalga boyu seçici heyecan filtre. Uyarma filtresi tarafından geçirilen dalga boyları, bir yüzeyin yüzeyinden yansır. iki renkli (aynı zamanda bir dikroik) numuneyi yoğun ışıkla yıkamak için mikroskop hedefi aracılığıyla ayna veya ışın ayırıcı. Numune flüoresansa, objektif tarafından toplanan emisyon ışığı dikromatik aynadan geri geçer ve ardından bir filtre tarafından filtrelenir. bariyer (veya emisyon) istenmeyen uyarma dalga boylarını engelleyen filtre. Floresansın, optik mikroskopide, örneğin uyarıldıktan sonra kendi ışığını ürettiği tek mod olduğuna dikkat etmek önemlidir. Yayılan ışık, uyarma ışık kaynağı yönünden bağımsız olarak tüm yönlerde küresel olarak yeniden yayılır.
Epi-floresan aydınlatma, modern mikroskopideki tekniklerin ezici seçimidir ve yansıyan ışık dikey aydınlatıcı, gözlem görüntüleme tüpleri ile hedefleri barındıran burunluk arasına yerleştirilir. Aydınlatıcı, ilk olarak uyarı ışığını mikroskop objektifinden geçirerek (bu konfigürasyonda bir yoğunlaştırıcı) numuneye doğru giderken ve ardından yayılan floresanı yakalamak için aynı hedefi kullanarak. Bu tür aydınlatıcının çeşitli avantajları vardır. Floresan mikroskop hedefi, ilk önce iyi düzeltilmiş bir yoğunlaştırıcı ve ikinci olarak görüntü oluşturan ışık toplayıcı olarak hizmet eder. Tek bir bileşen olduğu için objektif/kondansatör her zaman mükemmel hizadadır. Numuneye ulaşan uyarma ışığının büyük bir kısmı, etkileşim olmadan geçer ve objektiften uzaklaşır ve aydınlatılan alan, göz merceklerinden gözlemlenen alanla sınırlıdır (çoğu durumda). Bazı kontrast arttırıcı tekniklerdeki durumun aksine, mikroskop Köhler aydınlatması için uygun şekilde yapılandırıldığında objektifin tam sayısal açıklığı mevcuttur. Son olarak, yansıyan ışık floresansı ve iletilen ışık gözlemi ve dijital görüntülerin yakalanması ile birleştirmek veya bunlar arasında geçiş yapmak mümkündür.
Şekil 2 - Floresan Filtreler
sunulduğu gibi Şekil 1, yansıyan ışık dikey aydınlatıcısı, arka uçta bir ark deşarjlı lamba yuvası içerir (genellikle bir cıva veya ksenon brülörü). Uyarma ışığı, aydınlatıcı boyunca mikroskobun optik eksenine dik olarak hareket eder, toplayıcı merceklerden ve değişken, ortalanabilir bir açıklık diyaframından ve ardından değişken, ortalanabilir bir alan diyaframından geçer (bkz. Şekil 1). Işık daha sonra istenen bandın seçiminin ve istenmeyen dalga boyunun tıkanmasının meydana geldiği uyarma filtresine çarpar. Seçilen dalga boyları, uyarma filtresinden geçtikten sonra, daha kısa dalga boyundaki ışığı verimli bir şekilde yansıtan ve daha uzun dalga boylu ışığı verimli bir şekilde geçiren özel bir girişim filtresi olan dikromatik ışın bölme aynasına ulaşır. Dikromatik ışın ayırıcı, gelen uyarı ışığına göre 45 derecelik bir açıyla eğilir ve bu aydınlatmayı doğrudan objektif optik sistem aracılığıyla ve numune üzerine 90 derecelik bir açıyla yansıtır. Aydınlatılmış numune tarafından üretilen floresan emisyonu, artık olağan görüntü oluşturma işlevine hizmet eden objektif tarafından toplanır. Yayılan ışık, uyarma aydınlatmasından daha uzun dalga boylarından oluştuğu için, dikromatik aynadan ve yukarı doğru gözlem tüplerine veya elektronik dedektöre geçebilir.
Dikromatik aynaya ulaşan saçılan uyarma ışığının çoğu, ışık kaynağına doğru geri yansıtılır, ancak çok küçük bir miktar sıklıkla geçer ve ayna bloğunun iç kaplaması tarafından emilir. Yayılan floresan mercek veya dedektöre ulaşmadan önce bariyer veya bastırma filtresinden geçmelidir.Bu filtre, herhangi bir artık uyarma ışığını bloke eder (bastırır) ve istenen daha uzun emisyon dalga boylarını geçirir. Çoğu yansıyan ışık aydınlatıcısında, uyarma filtresi, dikromatik ayna ve bariyer filtresi, optik bir bloğa (genellikle küp), gösterildiği gibi şekil 2. Modern floresan mikroskopları, dört ila altı floresan küpü barındırabilir (genellikle döner bir taret üzerinde veya bir kaydırma mekanizması aracılığıyla bkz. Şekil 1) ve kullanıcının yedek satış sonrası uyarma ve bariyer filtrelerinin yanı sıra dikromatik aynaları kolayca takmasına izin verir.
Dikey aydınlatıcı tasarımı, kullanıcının tüm görüş alanı boyunca parlak ve eşit bir aydınlatma açıklığı sağlayarak mikroskobu Köhler aydınlatması için ayarlamasını sağlamalıdır. Optik sistemin düzeltilmiş yoğunlaştırıcı lensleri, merkezlenebilir açıklık diyaframının görüntüsünün odaklanan objektifin arka açıklığı ile eşlenik olmasını sağlamalıdır. Modern aydınlatıcılarda, önceden odaklanmış, ortalanabilir alan diyaframının görüntüsü, odaklanan numuneye ve sabit mercek diyaframının düzlemine eşleniktir.
Aydınlatıcı lamba yuvası genellikle bir kızılötesi ışık bastırma filtresi içerir. Lamba evinin kendisi zararlı ultraviyole dalga boylarını sızdırmamalı ve tercihen, çalışma sırasında gövde yanlışlıkla açılırsa lambayı otomatik olarak kapatan bir anahtar içermelidir. Lamba yuvası, çalışma sırasında olası bir brülör (ark deşarj lambası) patlamasına dayanacak kadar sağlam olmalıdır. Modern lamba evlerinde, lamba yuvası, ark lambası görüntüsünü objektifin arka açıklığı içinde ortalamaya izin vermek için ayar düğmeleriyle donatılmıştır (Köhler aydınlatmasında bu düzlemler eşleniktir). Işık yolunun bir yerinde, genellikle lamba yuvasına daha yakın ve uyarma filtresinden önce, numunenin detektörle görüntülenmediği veya görüntülenmediği durumlarda uyarma ışığını tamamen engellemek için bir kapağın olması arzu edilir. Ek olarak, kullanıcının uyarma aydınlatmasının yoğunluğunu azaltmasını sağlamak için nötr yoğunluk filtreleri (bir tekerlek, taret veya sürgü üzerinde) için hükümler sağlanmalıdır.
Stokes'un Vardiyası
Elektronlar uyarılmış durumdan temel duruma geri gevşediğinde titreşim enerjisi kaybolur. Enerji kaybının bir sonucu olarak, uyarılmış bir floroforun emisyon spektrumu, absorpsiyon veya uyarma spektrumu ile karşılaştırıldığında genellikle daha uzun dalga boylarına kaydırılır (dalga boyunun radyasyon enerjisiyle ters orantılı olarak değiştiğine dikkat edin). Bu iyi belgelenmiş fenomen olarak bilinir Stokes Yasası veya Stokes'un vardiyası. Stokes'un kaydırma değerleri arttıkça, floresan filtre kombinasyonlarının kullanılması yoluyla uyarımı emisyon ışığından ayırmak daha kolay hale gelir.
Florofor emisyonu (veya absorpsiyon) yoğunluk tepe noktası, dalga boyu ve büyüklük olarak, uyarma zirvesi tarafından sergilenenden genellikle daha düşüktür ve emisyon spektral profili (eğri) genellikle uyarma eğrisinin bir ayna görüntüsüdür (veya hemen hemen öyledir), ancak buna kaydırılır. gösterildiği gibi daha uzun dalga boyları Figür 3 Alexa Fluor 555 için sarı-yeşil bölgedeki ışığı emen ve sarı-turuncu emisyon üreten kullanışlı bir prob. Maksimum floresan yoğunluğunu elde etmek için, bir florofor (genellikle boya) genellikle uyarma eğrisinin zirvesinde veya yakınında dalga boylarında uyarılır ve emisyon zirvesini içeren mümkün olan en geniş emisyon dalga boyları aralığı algılama için seçilir. Uyarma ve emisyon dalga boylarının seçimi tipik olarak girişim filtrelerine dayanır (şekil 2). Ek olarak, bir mikroskop optik sisteminin spektral tepkisi, cam iletim verimliliği (yansıma önleyici kaplamalardan dolayı), lens ve ayna elemanlarının sayısı ve dedektör sisteminin duyarlılığı gibi faktörlere de bağlı olacaktır.
Figür 3 - Florofor Soğurma ve Emisyon Profilleri
Uyarma ve emisyon dalga boylarının etkili bir şekilde ayrılması ve tespiti, ultraviyole, görünür ve yakın kızılötesi spektral bölgelerdeki belirli dalga boyu bantlarını bloke etmek veya geçirmek için uygun filtre seçimi yoluyla floresan mikroskopisinde elde edilir. Floresan dikey aydınlatıcılar, numuneye doğru giderken ışık yoluna ve yine numune ile numune arasındaki yolda, kolaylıkla değiştirilebilir filtre (nötr yoğunluk ve girişim uyarma dengeleyicileri) eklemelerinin uygulanması yoluyla uyarma ışığını kontrol etmek amacıyla tasarlanmıştır. gözlem tüpleri veya kamera dedektör sistemi. Nispeten düşük flüoresans emisyon yoğunlukları (yukarıdaki tartışmaya bakınız) göz önüne alındığında belki de en önemli kriter, uyarma için kullanılan ışık kaynağının, zayıf emisyon ışığının en üst düzeye çıkarılması için yeterli parlaklığa sahip olması ve florokromların yeterli absorpsiyon özelliklerine sahip olmasıdır. ve emisyon kuantum verimleri.
Belirli bir floroforun uyarma ışığının bir fotonu soğurma etkinliği moleküler enine kesitin bir fonksiyonudur ve soğurma olasılığı, soğurma olasılığı olarak bilinir. sönme katsayısı. Daha büyük sönme katsayıları, belirli bir dalga boyu bölgesinde bir fotonun (veya kuantumun) absorpsiyonunun daha olası olduğunu gösterir. Kuantum verimi, emilenlere kıyasla yayılan kuantum sayısının oranını belirtir (ve genellikle 0.1 ile 1.0 arasında bir değerdir). 1'in altındaki kuantum verim değerleri, yeniden ışınımlı floresan yolundan ziyade ısı veya fotokimyasal reaksiyon gibi ışınımsız yollardan enerji kaybının sonucudur. Sönme katsayısı, kuantum verimi, ışık kaynağının ortalama ışık şiddeti ve floresan ömrü, floresan emisyonunun yoğunluğuna ve faydasına katkıda bulunan önemli faktörlerdir.
Solma, Söndürme ve Foto Ağartma
Sonunda floresan emisyonunun yeniden ışınlanmasını etkileyen ve dolayısıyla yoğunluğu azaltan geniş bir koşullar yelpazesi sıklıkla devreye girer. Floresan emisyon yoğunluğunun azaltılması için genel terim solma, genellikle daha fazla alt bölüme ayrılan bir tümünü yakalama kategorisi söndürme ve fotoağartma Daha kesin açıklamalar için fenomenler. Fotoağartma, uyarılmış haldeki floresan moleküllerin, emisyondan önce moleküler oksijen ile etkileşimleri nedeniyle geri dönüşümsüz bozunmasıdır. Fotoağartma oluşumu, fotoağartma işleminden sonra floresan geri kazanımı olarak bilinen bir teknikte kullanılır.SIKI BAĞLAMAK), biyolojik makromoleküllerin difüzyonunu ve hareketini araştırmak için çok yararlı bir mekanizma. Yöntem, yoğun bir lazer ışığı patlaması ile numunenin keskin bir şekilde tanımlanmış bir bölgesinin ışıkla ağartılmasına ve bunun ardından ışıkla ağartılmış alandaki floresan geri kazanım oranlarının ve modelinin gözlemlenmesine dayanır. Fotoağartmada floresan kaybı olarak bilinen ilgili bir teknik (ÇEVİRME), bir ışıkla ağartılmış alanın bitişiğinde uzanan tanımlanmış bir bölgede floresansın azalmasını izlemek için kullanılır. FRAP'a benzer şekilde, ikinci teknik, canlı hücrelerde moleküler mobilite ve dinamiklerin araştırılmasında faydalıdır.
Şekil 4 - Çoklu Lekeli Numunelerde Fotoağartma Oranları
Sunulan Şekil 4 Hint Muntjac geyiği epidermis fibroblast hücrelerinin çok lekeli bir kültürü için farklı zaman noktalarında yakalanan bir dizi dijital görüntüde gözlenen tipik bir ışıkla ağartma (solma) örneğidir. Çekirdekler bir bis-benzimidazol türevi (Hoechst 33258 mavi floresan) ile boyanırken, mitokondri ve aktin hücre iskeleti, sırasıyla MitoTracker Red CMXRos (kırmızı floresan) ve Alexa Fluor 488'e (yeşil floresan) konjuge edilmiş bir phalloidin türevi ile boyandı. Zaman noktaları, üç flüoroforu aynı anda uyarmak için ayarlanmış bant genişliklerine sahip bir flüoresan filtre kombinasyonu kullanılarak iki dakikalık aralıklarla alındı ve aynı zamanda birleşik emisyon sinyalleri kaydedildi. Her üç floroforun da nispeten yüksek bir yoğunluğa sahip olduğuna dikkat edin. Şekil 4(a)ancak Hoechst florofor (mavi) yoğunluğu iki dakikada hızla düşmeye başlar ve 6-8 dakikada neredeyse tamamen kaybolur. Mitokondriyal ve aktin lekeleri, ışıkla ağartmaya karşı daha dirençlidir, ancak her ikisinin yoğunluğu, zamanlanmış dizi (10 dakika) boyunca önemli ölçüde düşer.
Söndürmenin uyarılmış hal gevşeme süreci, ışınımsal olmayan enerji kaybını içeren çeşitli mekanizmalar yoluyla floresan yoğunluğunun azalmasıyla sonuçlanır ve sıklıkla oksitleyici ajanların veya tuzların veya ağır metallerin veya halojen bileşiklerinin mevcudiyetinin bir sonucu olarak ortaya çıkar. Bazı durumlarda söndürme, enerjinin başka bir moleküle aktarılmasından kaynaklanır. akseptör), uyarılmış florofora fiziksel olarak yakın olan ( bağışçı), floresan rezonans enerji transferi olarak bilinen bir fenomen (FRET). Bu özel mekanizma, optik mikroskobun yanal çözünürlüğünün çok altındaki mesafelerde moleküler etkileşimlerin ve ilişkilerin çalışılmasını içeren yararlı bir tekniğin temeli haline geldi.
Floresan Işık Kaynakları
Çoğu floresan mikroskopi uygulamasında düşük emisyon seviyelerinin talihsiz bir sonucu, göze veya kamera dedektörüne ulaşan fotonların sayısının da çok düşük olmasıdır. Çoğu durumda, optik mikroskopların toplama verimliliği yüzde 30'dan azdır ve optik yoldaki birçok floroforun konsantrasyonu mikromolar veya nanomolar bölgelerde değişir. Tespit edilebilir emisyon üretmek için yeterli uyarma ışık yoğunluğunu oluşturmak için, yüksek enerjili kısa ark deşarjlı lambalar gibi güçlü kompakt ışık kaynakları gereklidir. En yaygın lambalar, watt değerleri 50 ila 200 Watt arasında değişen cıvalı brülörler ve 75 ila 150 Watt arasında değişen ksenon brülörlerdir (bkz. Şekil 5). Bu ışık kaynakları genellikle, gaz halindeki buharın iyonlaşması yoluyla brülörü tutuşturmak ve minimum titreşimle yanmasını sağlamak için yeterli başlatma gücü sağlayan harici bir doğru akım kaynağı tarafından çalıştırılır.
Mikroskop ark deşarj lambası harici güç kaynağı genellikle, brülörün çalıştığı saat sayısını takip etmek için bir zamanlayıcı ile donatılmıştır. Ark lambaları, nominal ömürlerinin (200-300 saat) ötesinde kullanıldıklarında verimlerini kaybederler ve kırılmaları daha olasıdır. Cıva brülörleri, morötesinden kızılötesine kadar olan spektrum boyunca eşit yoğunluk sağlamaz ve lambanın yoğunluğunun çoğu, yakın morötesinde harcanır. 313, 334, 365, 406, 435, 546 ve 578 nanometrelerde belirgin yoğunluk zirveleri meydana gelir. Görünür ışık bölgesindeki diğer dalga boylarında, yoğunluk o kadar parlak olmasa da sabittir (ancak yine de çoğu uygulamada kullanılabilir). Aydınlatma verimliliğini göz önünde bulundururken, yalnızca lamba gücü birincil düşünce değildir. Bunun yerine, kritik parametre, kaynak parlaklığı, ark geometrisi ve emisyonun açısal yayılımı dikkate alınarak dikkate alınması gereken ortalama parlaklıktır.
Şekil 5 - Ark-Deşarj Floresan Lambaları
Son birkaç yılda, optik mikroskopi, lazer ışık kaynaklarının, özellikle argon-iyon ve argon-kripton (iyon) lazerlerinin uygulamasında bir artış yaşadı. Bu lazerler, küçük kaynak boyutu, düşük sapma, neredeyse tek renklilik ve yüksek ortalama parlaklık gibi erdemlere sahiptir. Numune odak düzleminden çıkarılan odaklanmamış ışığın reddedilmesi yoluyla çok keskin floresan görüntüler oluşturmada güçlü bir araç olduğu kanıtlanmış bir teknik olan konfokal mikroskopi taramada önemli hale geldiler. Konfokal mikroskoplar, bu görevi, eşlenik bir açıklık aracılığıyla çakışan görüntüleme ile nokta veya çizgi taraması yoluyla gerçekleştirir. Numunelerin optik bölümleri bir ana bilgisayarda saklanabilir ve daha sonra monitörde görüntülenen nihai görüntüde yeniden oluşturulabilir.
Filtre Terminolojisi
Floresan mikroskopi filtre kombinasyonlarına uygulanan ortak terminoloji, farklı üreticiler tarafından filtrelerini tanımlamak için kullanılan çeşitli baş harfleri ve kodların bir sonucu olarak kafa karıştırıcı hale geldi. Temel olarak, üç ana filtre kategorisi vardır: uyarma (genellikle uyarıcılar), engel (emisyon) ve iki renkli ışın ayırıcılar (veya dikroik aynalar). Floresan filtreler eskiden neredeyse sadece boyalı camdan veya iki cam plaka arasına sıkıştırılmış jelatinden yapılmıştır. Bununla birlikte, mevcut eğilim, uyarma filtrelerinin ışığın dalga boylarını büyük bir özgüllük ve yüksek iletim ile geçirmesi veya reddetmesi için girişim optikli yüksek çözünürlüklü filtreler üretmektir. Dikromatik ışın ayırıcılar, ışık yoluna 45 derecelik bir açıyla yerleştirildiğinde belirli dalga boylarındaki ışığı yansıtmak veya geçirmek için tasarlanmış özel girişim filtreleridir (bkz. Şekil 1 ve 2). Bariyer filtreler hem renkli cam hem de girişim kaplamaları (veya ikisinin kombinasyonu) ile üretilir.
Üreticiler tarafından uyarma filtrelerinin özelliklerini tanımlamak için kullanılan kısaltmalar şunları içerir: UG (ultraviyole cam) ve BG (mavi cam). Kısa geçiş filtreleri genellikle şu şekilde gösterilir: KP(K Almanca'da "kısa" anlamına gelen kurz'un kısaltmasıdır) veya basitçe SP. Birçok üretici artık girişim filtrelerini şu adla etiketliyor: EĞER. Dar bant uyarma girişim filtreleri, Stokes kayması küçükse özellikle yararlıdır.
Bariyer filtreleri için kısaltmalar veya kısaltmalar şunları içerir: LP veya L uzun geçiren filtreler için, Y veya İyi oyun sarı veya gelb (Alman) cam için, r veya RG kırmızı cam için, OG veya Ö turuncu cam için, K kante için, kenar (filtre) için Almanca bir terimdir ve BA bariyer filtresi için. Filtre türü aynı zamanda bir sayı ile ilişkilendirildiğinde, örneğin BA515, bu atama maksimum iletiminin yüzde 50'sinde dalga boyunu (nanometre cinsinden) ifade eder.
Dikromatik ışın ayırıcılar da dahil olmak üzere çok sayıda kısaltma ile tanımlanır. CBS kromatik ışın ayırıcı için, DM dikroik ayna için, TK "teiler kante" için, Almanca kenar ayırıcı için, FT "farb teiler" için (Almanca renk ayırıcı için) ve RKP yansıma için kısa geçiş. Bu terimlerin tümü birbirinin yerine geçebilir olarak kabul edilmelidir ve modern dikromatik ışın ayırıcılar her zaman optik cam üzerinde girişim kaplamaları ile üretilir (organik veya metalik boyaların aksine). Girişim ince filmleri, daha kısa dalga boyları için yüksek yansıtma ve daha uzun dalga boyları için yüksek iletim üretecek şekilde tasarlanmıştır. Dikromatik ışın ayırıcılar, yansıyan ışık floresan aydınlatıcısı aracılığıyla optik bloğa giren uyarma ışığının yoluna 45 derecelik bir açıyla yönlendirilir. Birincil işlevleri, seçilen uyarım (daha kısa) dalga boylarını objektif üzerinden ve numune üzerine yeniden yönlendirmektir. Bu özel filtreler ayrıca, daha uzun dalga boyundaki floresan emisyonunu bariyer filtresine geçirme ve herhangi bir saçılan uyarı ışığını lamba yuvası yönünde geri yansıtma gibi ek işlevlere sahiptir.
Şekil 6 - Nikon B-2E (Orta Bant Mavi Uyarma)
Sunulan Şekil 6 modern mikroskoplarda kullanılan tipik bir floresan filtre kombinasyonu için iletim profilleridir. Uyarma filtresi spektrumu (kırmızı eğri), merkez dalga boyuna sahip 450 ila 490 nanometre arasında yüksek bir iletim seviyesi (yaklaşık yüzde 75) sergiler (CWL) 470 nanometre. Dikromatik ayna (sarı eğri), uyarma spektrumu bölgesindeki dalga boylarını yansıtırken, daha yüksek ve daha düşük dalga boylarını nispeten yüksek verimlilikle geçirir. İki renkli ayna eğrisinde yüzde sıfır iletimin yüzde 100 yansımaya karşılık geldiğine dikkat edin. Yansımada bir tepeyi temsil eden 450 ile 500 nanometre arasındaki iletim profilindeki belirgin düşüş, uyarma filtresinden numune üzerine 90 derecelik bir açıyla geçen dalga boyları bandını yansıtmaya hizmet eder. Optik dizideki son bileşen olan bir emisyon veya bariyer filtresi (beyaz eğri), yeşil görünür ışık bölgesindeki dalga boylarını 520 ila 560 nanometre aralığında iletir. Üst üste bindirilmiş çeşitli spektrumların iletilen ve yansıyan dalga boyu bantları arasındaki sınırlar, yansıyan ve iletilen dalga boylarının neredeyse tamamen ayrılmasını sağlamak için mümkün olduğunca dik olacak şekilde tasarlanmıştır. Dikromatik ayna tayfında görünen sinüzoidal olarak yükselen ve düşen sivri bir desen, olarak bilinen ince film biriktirme işleminin ortak bir etkisidir. çalıyor. Bu filtre kombinasyonunun performansı dikkat çekicidir ve ince film girişim filtre teknolojisinde elde edilen hızlı ilerlemelerin açık bir göstergesidir.
Nikon tarafından kullanılan filtre terminolojisi, 1990'ların başlarına kadar uzanan bir terimler karışımından türetilmiştir. O zaman, tüm Nikon tamamlayıcı filtre kombinasyonları, sert ceket püskürtme tekniğidir, ancak şu anda mevcut olan filtrelerin çoğu, daha yeni, daha yumuşak kaplama yöntemlerinden yararlanmaktadır. Yumuşak kaplamalar neme ve ısı bozulmasına karşı daha duyarlı olmalarına ve sert kaplama filtrelerinden daha dikkatli kullanılmaları gerekmesine rağmen, bunlar daha yüksek engelleme değeri olan optik yoğunluklar sergilerler ve belirli dalga boyu bantlarında daha fazla ince ayar kolaylığı sağlarlar. Nikon filtre kombinasyon kodu terminolojisinin anlaşılması, belirli bir setin belirli bir florofor için yeterli performans gösterip göstermeyeceğini hızlı bir şekilde belirlemek için bir mekanizma sağlar.
Nikon'a özel alfanümerik filtre tanımlama kodundaki ilk harf, dalga boyu uyarım spektral bölgesini belirtir (örneğin, UV, V, B, ve Gsırasıyla ultraviyole, mor, mavi ve yeşil için basit kısaltmalardır). Uyarım kodunun ardından gelen sayı, uyarım filtresi geçiş bandı genişliği ile ilgilidir: 1 dar bant uyarma için, 2orta ve geniş bant uyarımı için ve 3 çok geniş bant uyarma için. Son olarak, uyarma bant geçiren boyut numarasını takip eden bir veya daha fazla harf, bariyer filtre özelliklerini tanımlar. kod harfi A en düşük kesme dalga boyuna sahip standart bir uzun geçişli bariyer filtresini gösterirken B uzun geçişli bir emisyon filtresi için daha yüksek bir kesme dalga boyu değeri belirtir. Bant geçiren emisyon filtreleri harfle tanımlanır E ("gelişmiş" terimine atıfta bulunarak) geçişi ortadan kaldırma konusunda üstün performanslarını belirtmek için. NS elektronik filtreler, DAPI, FITC, TRITC ve Texas Red gibi belirli problarla en iyi performans için tasarlanmış yumuşak kaplama girişim kombinasyonlarıdır.
Floresan Işık Bütçesi
Tipik bir floresan mikroskobunda ışık akılarının tahmini, dijital görüntülerin üretilmesinde veya numunelerin görsel olarak gözlemlenmesi sırasında karşılaşılacak kısıtlamaları özetlemek için yararlıdır. Bu alıştırma için uyarı kaynağının, ortalama ışık akısı yoğunluğu milimetre kare başına yaklaşık 400 kandela olan standart 75 Watt'lık bir xenon ark deşarj lambası olduğu varsayılır (diğer kaynaklar için, bkz. tablo 1).Lamba çıkışı toplandığında ve 490 nanometre parazit filtresinden (10 nanometre bant genişliğine ve yüzde 75 aktarıma sahip) yönlendirildiğinde, yaklaşık 2 miliWatt ışık geçecektir. Yüzde 90 verimli bir dikromatik ayna tarafından yansıtıldıktan sonra, 1.8 miliWatt'lık bir ışık akısı, uyarma ışını olarak mikroskop hedefinin arka açıklığına girer.
Sayısal açıklığı 1.4 olan 100x'lik bir objektifle, aydınlatılan numunenin alanı, çapı yaklaşık 40 mikrometre olan dairesel bir görüş alanı olduğu varsayılarak, 12 x 10 × E(-6) santimetre kare olacaktır. Numune üzerindeki ışık akısı, santimetre kare başına yaklaşık 150 Watt'tır ve bu, santimetre kare başına 3,6 x 10 × E(20) fotonluk bir akı yoğunluğuna karşılık gelir. Bu nedenle, numune aydınlatma yoğunluğu, güneşli bir günde Dünya yüzeyinde meydana gelen olaydan yaklaşık 1000 kat daha fazladır.
Yukarıda tartışılan ışık akısından kaynaklanan flüoresans emisyonu, flüoroforun absorpsiyon ve emisyon özelliklerine, numunedeki konsantrasyonuna ve numunenin optik yol uzunluğuna bağlıdır. Matematiksel olarak, üretilen floresan (F) denklem ile verilir:
Formül 1 - Floresan Üretildi
nerede σ moleküler absorpsiyon kesitidir, Q kuantum verimidir ve ben gelen ışık akısı (yukarıda hesaplandığı gibi). Floreseinin florofor olduğunu varsayarsak, absorpsiyon kesiti (σ) molekül başına 3 x 10 × E(-16) santimetre karedir, Q 0,99'a eşittir ve bunun için bir değer elde edilir. F Molekül başına saniyede 100.000 foton. Boya konsantrasyonu litre başına 1 mikromol ise ve 10 mikrometre kalınlığında (12 pikolitreye eşit hacim) 40 mikrometre çapında bir diskte eşit olarak dağılmışsa, yaklaşık 1.2 x 10 x E(-17) mol boya veya Optik yolda 7,2 milyon molekül. Tüm moleküller aynı anda uyarılırsa, flüoresans emisyon hızı saniyede 7,2 x 10 x E(11) foton olacaktır. F ve boya moleküllerinin sayısı). İlgilenilen soru, yayılan fotonların kaç tanesinin tespit edileceği ve bu emisyon hızının ne kadar süre devam edebileceğidir?
Tablo 1 - Seçilmiş Işık Kaynaklarının Işık Yoğunluğu
|Lamba||Akım|
(Amper)
|Işık akısı|
(Lümen)
|Ortalama Aydınlık|
Yoğunluk (cd/mm2)
|Yay Boyutu|
(YxG)
(Milimetre)
|Merkür Yayı|
(100 Watt)
|5||2200||1700||0.25 x 0.25|
|ksenon ark|
(75 Watt)
|5.4||850||400||0,25 x 0,50|
|ksenon ark|
(500 Watt)
|30||9000||3500||0.30 x 0.30|
|Tungsten|
Halojen
|8||2800||45||4,2 x 2,3|
Algılamanın verimliliği, optik toplama verimliliğinin ve dedektör kuantum verimliliğinin bir fonksiyonudur. Yüzde 100 aktarıma sahip (gerçekçi olmayan bir koşul) 1,4 sayısal açıklık objektifi, yaklaşık yüzde 30'luk kabul açısıyla sınırlı maksimum toplama verimliliğine sahiptir. Dikromatik aynanın iletim verimliliği yüzde 85 ve bariyer filtreninki yüzde 80'dir. Toplam toplama verimliliği o zaman yaklaşık yüzde 20 veya saniyede 140 milyar fotondur. Dedektör geleneksel bir şarj bağlantılı cihaz ise (CCD), kuantum verimliliği yeşil floresan emisyonu için yaklaşık yüzde 50'dir (525 nanometrede), bu nedenle algılanan sinyal saniyede 70 milyar foton veya yayılan floresansın yaklaşık yüzde 10'u olacaktır. Mükemmel bir dedektörle bile (yüzde 100 kuantum verimliliği), floresan emisyon fotonlarının sadece yüzde 20'si algılanabilir.
Floresan emisyonunun süresi, fotoağartma sonucunda florofor yıkım hızına bağlıdır. Oksijenli tuzlu su çözeltisindeki floresan için ölçümler, her bir molekülün yok edilmeden önce yalnızca yaklaşık 36.000 foton yayabildiğini göstermektedir. Oksijensiz bir ortamda, fotodestrüksiyon oranı yaklaşık on kat azalır, bu nedenle floresein molekülü başına 360.000 foton üretilir. Bu örnekte (7.2 milyon molekül) tüm boya havuzu, bu durumda minimum 2,6 x 10 × E(11) ve maksimum 2,6 x 10 × E(12) foton üretebilecektir. Yukarıda hesaplanan molekül başına saniyede 100.000 foton emisyon hızı varsayıldığında, flüoresans, foto-tahripten önce sadece 0,3 ila 3 saniye devam edebilir. Foton akısının yüzde 10'unun tespit edilmesi durumunda, saniyede 7.2 x 10 × E(10) elektronluk bir sinyal elde edilecektir.
Bu örneğin argümanını takiben, dedektör 1000 x 1000 piksel CCD kamera ise, bu sinyal sensör başına yaklaşık 72.000 elektron ile bir milyon sensöre dağıtılacaktır. 9 mikrometre kare sensörlü bilimsel düzeyde bir CCD için tam kuyu depolama kapasitesi yaklaşık 80.000 elektrondur ve okuma gürültüsü 10 elektrondan azdır. Sinyal-gürültü oranı, daha sonra büyük ölçüde, sinyalin kareköküne eşit, yaklaşık 268 olan foton istatistiksel gürültüsü tarafından belirlenir. Neredeyse tüm durumlarda, bu yüksek sinyal seviyesi, fotodestrüksiyon meydana gelmeden önce sadece çok kısa bir süre devam edebilirdi. . Çoğu mikroskopist tarafından gözlem süresini uzatmak için kullanılan uzlaşma, gelen ışık akı yoğunluğunda bir azalmadır, böylece boya havuzundaki florofor moleküllerinin sadece bir kısmı uyarılır ve foto-tahrip edilir. Bu nedenle, sinyal-gürültü oranı nadiren teorik maksimuma eşittir ve tipik olarak floresan mikroskobunda 10 ile 20 arasında değişir.
Tek Moleküllerin Tespiti
İdeal koşullar altında, optik arka plan ve dedektör gürültüsünün yeterince düşük olması koşuluyla, tek bir molekülden flüoresans emisyonunu saptamak genellikle mümkündür. Yukarıda tartışıldığı gibi, tek bir flüoresan molekülü, fotoağartma ile yok edilmeden önce 300.000 kadar foton yayabilir. Yüzde 20 toplama ve algılama verimliliği varsayarsak, yaklaşık 60.000 foton algılanacaktır. Bu deneyler için çığ fotodiyodu veya elektron çoğaltan CCD dedektörleri kullanan araştırmacılar, tek moleküllerin davranışını birçok saniye ve hatta dakikalarca izleyebildi. En büyük sorun, optik arka plan gürültüsünün yeterince bastırılmasıdır. Mikroskop lenslerinin ve filtrelerinin yapımında kullanılan malzemelerin çoğu bir miktar otofloresans gösterdiğinden, başlangıçta çok düşük floresan bileşenlerinin üretimine yönelik çabalar yönlendirildi. Bununla birlikte, kısa süre sonra, toplam iç yansımayı kullanan floresan mikroskopi tekniklerinin (TIR) istenen düşük arka plan ve yüksek uyarma ışık akısı kombinasyonunu sağladı.
Toplam iç yansıma floresan mikroskobu (TIRFM) farklı kırılma indekslerine sahip iki ortam arasındaki arayüzde ışık tamamen dahili olarak yansıtıldığında gelişen geçici dalgadan yararlanır. Harici bir ışık kaynağı kullanma ilkesi aşağıdaki şekilde gösterilmektedir: Şekil 7(a). Bu teknikte, bir ışık demeti (genellikle genişletilmiş bir lazer ışını), cam veya sulu çözeltiden oluşan daha düşük bir kırılma indeksi ortamına dayanan cam veya safir gibi yüksek kırılma indeksli bir prizmadan yönlendirilir. Işık, kritik açıdan daha yüksek bir açıyla prizmaya yönlendirilirse, ışın arayüzde tamamen dahili olarak yansıtılacaktır. Yansıma fenomeni, alt kırılma indeksi alanına yaklaşık 200 nanometre veya daha az nüfuz eden bir elektromanyetik alanın üretilmesiyle arayüzde geçici bir dalga geliştirir. Kaybolan dalgadaki ışık yoğunluğu, içindeki floroforları uyarmak için yeterince yüksektir, ancak sığ derinliği nedeniyle uyarılan hacim çok küçüktür. Sonuç, son derece düşük seviyeli bir arka plandır, çünkü örneğin çok az bir kısmı uyarma ışığına maruz kalır (yalnızca ara yüzün 200 nanometre mesafesi içindeki kısmı).
Şekil 7 - Ters Mikroskop TIRFM Konfigürasyonları
Toplam dahili yansıma floresan mikroskobu, geniş alan tekniklerinde kullanılan epi-aydınlatmanın bir modifikasyonu yoluyla da gerçekleştirilebilir (resimde gösterildiği gibi). Şekil 7(b)). Bu yöntem, çok yüksek bir sayısal açıklık hedefi (en az 1.4, ancak tercihen 1.45 ila 1.6) ve mikroskop alanının bir taraftan küçük bir spor veya ince bir halka ile daha düzgün aydınlatma ile kısmi aydınlatmasını gerektirir. Nikon, 1.49 sayısal açıklığa sahip 60x ve 100x TIRF hedefleri sunar. Toplam iç yansıma ile sonuçlanan aydınlatma açısını elde etmek için yüksek kırılma indeksli lens daldırma ortamı ve mikroskop kapak camı gereklidir. sunulduğu gibi Şekil 7(b), kritik açıdan daha küçük bir açıyla objektif ön lens elemanından çıkan ışık ışınları (olarak ifade edilir) Bir(1)) içinde şekil 7(b)) mikroskoptan uzağa iletilir. Açı kritik açıya yükseltildiğinde veya bunun ötesine geçtiğinde (bir açıyla gösterilir) bir(2) içinde Şekil 7(b)), toplam iç yansıma sonuçları.
Floresan rezonans enerji transferi gibi diğer popüler gelişmiş floresan teknikleri (FRET) ve fotoağartma işleminden sonra floresan geri kazanımı (SIKI BAĞLAMAK) ve spektroskopi, Nikon Ti2-LAPP modüler aydınlatma sistemiyle mümkün olduğu gibi, ek bilgi elde etmek için genellikle toplam iç yansıma ile birleştirilir. Sonuç, bireysel floroforların ve floresan etiketli moleküllerin incelenmesi için çok güçlü bir araçtır. Tek moleküllerin özelliklerinin incelenmesinden kaynaklanan avantajlar henüz yeni yeni anlaşılmaya başlanmıştır. Böylece, mevcut optik mikroskopi aralığı artık tek molekülden tüm hayvana kadar uzanmaktadır.
Sonuçlar
Modern floresan mikroskobu, insan gözünün basit gözlemini çok aşan bir karmaşıklık düzeyi elde etmek için yüksek performanslı optik bileşenlerin gücünü cihazın bilgisayarlı kontrolü ve dijital görüntü edinimi ile birleştirir. Mikroskopi, düşük ışık seviyelerinde veya görsel olarak algılanamayan dalga boylarında hızla bilgi elde etmek için büyük ölçüde elektronik görüntülemeye bağlıdır. Bu teknik gelişmeler sadece vitrin süslemeleri değil, bir sistem olarak ışık mikroskobunun temel bileşenleridir.
Optik mikroskopinin yalnızca tanımlayıcı bir araç veya entelektüel bir oyuncak olduğu dönem geride kaldı. Şu anda, optik görüntü oluşumu, veri analizine yönelik yalnızca ilk adımdır. Mikroskop bu ilk adımı elektronik dedektörler, görüntü işlemciler ve görüntüleme sisteminin uzantıları olarak görülebilen görüntüleme cihazları ile birlikte gerçekleştirir. Odak, sahne konumu, optik bileşenler, panjurlar, filtreler ve dedektörlerin bilgisayarlı kontrolü yaygın olarak kullanılmaktadır ve mekanik mikroskoplarla insan tarafından mümkün olmayan deneysel manipülasyonlara olanak tanır. Elektro-optiğin floresan mikroskopisinde artan uygulaması, hücre altı yapıları veya partikülleri manipüle edebilen optik cımbızların, tek moleküllerin görüntülenmesini ve çok çeşitli karmaşık spektroskopik uygulamaların geliştirilmesine yol açmıştır.
Katkıda Bulunan Yazarlar
Kenneth R. Bahar - Bilimsel Danışman, Lusby, Maryland, 20657.
Michael W. Davidson - Ulusal Yüksek Manyetik Alan Laboratuvarı, 1800 Doğu Paul Dirac Dr., Florida Eyalet Üniversitesi, Tallahassee, Florida, 32310.
İlgili Nikon Ürünleri
Fotostimülasyon ve TIRF
Nikon görüntüleme sistemlerine foto-stimülasyon (dönüştürme/aktivasyon), FRAP ve TIRF özelliği eklemek için aydınlatma modülleri.
Işık kaynakları
Nikon, stereomikroskopi için koaksiyel sistemlerden epi-floresan uygulamaları için LED tabanlı aydınlatıcılara ve gelişmiş görüntüleme uygulamaları için güçlü lazer ünitelerine kadar çok çeşitli görüntüleme ihtiyaçları için ışık kaynakları sunar. Hafif çözümlerimizin çoğu benzersiz uygulamalar içerir ve yüksek hızlı kontrol için tetiklenebilir.
Hoechst kırmızı ve mavi spektrumları - kırmızı emisyon bize ne söylüyor? - Biyoloji
ATOM HİDROJEN EMİSYON SPEKTRUMU
Bu sayfa, atom içindeki enerji seviyeleri arasındaki elektron hareketlerinden nasıl ortaya çıktığını gösteren atomik hidrojen emisyon spektrumunu tanıtır. Ayrıca, hidrojenin iyonlaşma enerjisini bulmak için spektrumun nasıl kullanılabileceğine de bakar.
emisyon spektrumu nedir?
Hidrojenin emisyon spektrumunu gözlemlemek
Hidrojen deşarj tüpü, her iki ucunda bir elektrot bulunan, düşük basınçta hidrojen gazı içeren ince bir tüptür. Bunun üzerine yüksek bir voltaj koyarsanız (örneğin 5000 volt), tüp parlak pembe bir parıltıyla yanar.
Işık bir prizmadan veya kırınım ızgarasından geçirilirse, çeşitli renklerine bölünür. Göreceğiniz şey, hidrojen emisyon spektrumunun küçük bir parçasıdır. Spektrumun çoğu gözle görülmez çünkü ya kızıl ötesi ya da ultraviyole içindedir.
Fotoğraf, solda bir hidrojen deşarj tüpünün bir kısmını ve sağdaki spektrumun görünür kısmında en kolay görülen üç çizgiyi göstermektedir. (Özellikle kırmızı çizginin solundaki "lekelenmeyi" dikkate almayın. Bu, fotoğrafın çekilme biçimindeki kusurlardan kaynaklanır. Aşağıdaki nota bakın.)
Not: Bu fotoğraf Atlanta Georgia State Üniversitesi Fizik ve Astronomi Bölümü'nden Dr Rod Nave'nin izniyle çekilmiştir. Fotoğraf, Üniversite sitesindeki HiperFizik sayfalarındaki hidrojen tayfı hakkındaki notlardan alınmıştır. Konuya giriş niteliğinden daha fazlasıyla ilgileniyorsanız, gitmek için iyi bir yer.
İdeal olarak, fotoğraf üç temiz spektral çizgi gösterecektir - koyu mavi, camgöbeği ve kırmızı. Kırmızı çizginin solunda görünen kırmızı leke ve diğer iki çizginin solundaki diğer benzer lekeler (görmesi çok daha zor), Dr Nave'e göre, kurulumdaki başıboş yansımalardan veya muhtemelen kırınım ızgarasındaki kusurlardan. Her halükarda bu fotoğrafı kullanmayı seçtim çünkü a) Bence bu çarpıcı bir görüntü ve b) hidrojen deşarj tüpü ve spektrumunu aynı görüntüde içeren şimdiye kadar karşılaştığım tek fotoğraf bu.
Hidrojenin emisyon spektrumunu UV ve IR'ye genişletmek
Hidrojen spektrumunda çıplak gözle görebileceğiniz üç çizgiden çok daha fazlası vardır. Spektrumun hem ultraviyole hem de kızıl ötesi bölgelerindeki çizgi modellerini de tespit etmek mümkündür.
Bunlar, onları keşfeden kişinin adını taşıyan bir dizi "dizi" satırına girer. Aşağıdaki şema bu serilerden üçünü göstermektedir, ancak şemada gösterilen Paschen serisinin solundaki kızılötesinde başkaları da vardır.
Diyagram oldukça karmaşık, bu yüzden ona her seferinde biraz bakacağız. Önce diyagramın sağındaki Lyman serisine bakın - bu, neler olduğunu görmek için en yaygın ve en kolay olanıdır.
Not: Frekans ölçeği PHz olarak işaretlenmiştir - bu petaHertz'dir. Kilo (bin veya 103 kez anlamına gelir) ve mega (bir milyon veya 106 kez anlamına gelir) gibi öneklere aşinasınız. Peta 10 15 kez demektir. Yani 3 PHZ gibi bir değer 3 x 10 15 Hz anlamına gelir. "Hertz" hakkında endişeleniyorsanız, bu sadece "saniyedeki devir sayısı" anlamına gelir.
Lyman serisi, morötesi renkte bir dizi çizgidir. Frekans arttıkça çizgilerin birbirine yaklaştığına dikkat edin. Sonunda birbirlerine o kadar yakınlaşırlar ki onları sürekli bir spektrumdan başka bir şey olarak görmek imkansız hale gelir. Serinin sağ ucundaki gölgeli parça bunu gösteriyor.
Daha sonra, belirli bir noktada, olarak bilinen seri sınırı, dizi durur.
Şimdi Balmer serisine veya Paschen serisine bakarsanız, desenin tamamen aynı olduğunu ancak serilerin daha kompakt hale geldiğini göreceksiniz. Balmer serisinde, sayfanın yukarısındaki fotoğraftan görünen üç çizginin konumuna dikkat edin.
Her şeyi karmaşık hale getirmek - frekans ve dalga boyu
Genellikle frekanslar yerine ışığın dalga boyları kullanılarak çizilen hidrojen spektrumunu bulacaksınız. Ne yazık ki, ışığın frekansı ve dalga boyu arasındaki matematiksel ilişki nedeniyle, frekansa veya dalga boyuna karşı çizerseniz, spektrumun tamamen farklı iki görüntüsünü elde edersiniz.
Frekans ve dalga boyu arasındaki ilişki
Matematiksel ilişki:
Bunu yeniden düzenlemek, dalga boyu veya frekans için denklemler verir.
Bunun anlamı, ikisi arasında ters bir ilişki olduğudur - yüksek frekans, düşük dalga boyu anlamına gelir ve bunun tersi de geçerlidir.
Not: Bazen çok daha belirgin olan f sembolüyle verilen frekansı bulacaksınız.
Hidrojen spektrumunun dalga boyu cinsinden çizilmesi
Frekans yerine dalga boyu cinsinden çizerseniz, spektrum böyle görünür:
. . . ve frekans açısından spektrumun neye benzediğini size hatırlatmak için:
Bu kafa karıştırıcı mı? Pekala, bunu son derece kafa karıştırıcı buluyorum! Peki bu konuda ne yaparsın?
Bu sayfanın geri kalanı için yapacağım bir tek frekansa karşı çizilen spektruma bakın, çünkü onu atomda olanlarla ilişkilendirmek çok daha kolaydır. Spektrumun nasıl çizildiğine bağlı olarak farklı göründüğünü unutmayın, ancak bunun dışında, muayene edenlerin istediği açık olmadığı sürece dalga boyu versiyonunu dikkate almayın. Her iki versiyonu da öğrenmeye çalışırsanız, sadece onları karıştıracaksınız!
Not: Müfredatlar muhtemelen bu konuda pek yardımcı olmayacaktır. Geçmiş makalelere bakmanız ve şemaları işaretlemeniz gerekir.
İngiltere merkezli bir sınav için çalışıyorsanız ve bunlara sahip değilseniz, müfredat sayfasına giderek bunları nasıl elde edeceğinizi öğrenebilirsiniz.
Hidrojenin emisyon spektrumunu açıklamak
Balmer ve Rydberg Denklemleri
1885'te Balmer, şaşırtıcı bir matematiksel kavrayışla, bugün Balmer serisi olarak bildiğimiz çizgilerden herhangi birinin dalga boyunu tahmin etmek için basit bir formül buldu. Üç yıl sonra, Rydberg bunu hidrojen emisyon spektrumundaki çizgilerin herhangi birinin dalga boylarını hesaplamak için genelleştirdi.
Rydberg'in bulduğu şey şuydu:
rH olarak bilinen bir sabittir Rydberg sabiti.
n1 ve n2 tam sayılardır (tam sayılar). n2 n'den büyük olmalı1. Başka bir deyişle, eğer n1 diyelim ki 2 sonra n2 3 ile sonsuz arasında herhangi bir tam sayı olabilir.
Bu formüle yerleştirebileceğiniz çeşitli sayı kombinasyonları, hidrojen emisyon spektrumundaki herhangi bir çizginin dalga boyunu hesaplamanıza izin verir - ve bu formülü kullanarak elde ettiğiniz dalga boyları ile gerçek bir spektrumu analiz ederek bulunanlar arasında yakın bir uyum vardır. .
Not: Balmer'in orijinal denkleminin bir versiyonuna rastlarsanız, böyle görünmeyecektir. Balmer denkleminde, n1 her zaman 2'dir - çünkü bu, spektrumun görünen kısmındaki çizgilerin dalga boylarını verir ki bu da onun ilgilendiği şeydir. Orijinal denklemi de farklı şekilde organize edilmişti. Modern versiyon, neler olduğunu daha net gösteriyor.
Her bir satırın frekansını hesaplamak için Rydberg denkleminin değiştirilmiş bir versiyonunu da kullanabilirsiniz. Bu versiyonu önceki denklemden ve dalga boyu ve frekansla ilgili formülden sayfanın ilerisinde çalışabilirsiniz.
Not: n'nin olduğu Rydberg denkleminin versiyonlarıyla karşılaşabilirsiniz.1 ve n2 tam tersidir, hatta m ve n gibi harflerle değiştirilebilirler. Hangi sürümü kullanırsanız kullanın, daha büyük olan sayı her zaman sağdaki terimin altındaki sayı olmalıdır - aldığınız sayı.Onları yanlış yoldan alırsanız, bir hesaplama yapmaya başlarsanız hemen belli olur, çünkü sonunda olumsuz bir cevap alırsınız!
Hidrojen emisyon spektrumunun kökeni
Hidrojen emisyon spektrumundaki çizgiler düzenli modeller oluşturur ve (nispeten) basit bir denklemle temsil edilebilir. Her satır, basit tam sayıların bir kombinasyonundan hesaplanabilir.
Hidrojen yüksek voltaja maruz kalarak uyarıldığında neden ışık yayar ve bu tam sayıların anlamı nedir?
Hiçbir şey onu heyecanlandırmadığında, hidrojenin elektronu birinci enerji seviyesindedir - çekirdeğe en yakın seviye. Ancak atoma enerji sağlarsanız, elektron daha yüksek bir enerji düzeyine uyarılır - hatta atomdan tamamen çıkarılır.
Bir deşarj tüpündeki yüksek voltaj bu enerjiyi sağlar. Hidrojen molekülleri önce hidrojen atomlarına parçalanır (dolayısıyla atomik hidrojen emisyon spektrumu) ve elektronlar daha sonra daha yüksek enerji seviyelerine yükseltilir.
Belirli bir elektronun üçüncü enerji seviyesine uyarıldığını varsayalım. Bu, daha düşük bir seviyeye inerek tekrar enerji kaybetme eğiliminde olacaktır. Bunu iki farklı şekilde yapabilir.
Tekrar birinci seviyeye kadar düşebilir veya ikinci seviyeye geri düşebilir ve sonra ikinci bir sıçramada birinci seviyeye inebilir.
Spektrumdaki bireysel çizgilere belirli elektron atlamalarını bağlamak
Bir elektron 3 seviyesinden 2 seviyesine düşerse, bu iki seviye arasındaki enerji boşluğu ile tam olarak aynı miktarda enerji kaybetmesi gerekir. Elektronun kaybettiği enerji ışık olarak ortaya çıkar ("ışık"ın görünür olduğu kadar UV ve IR'yi de içerdiği).
Her ışık frekansı, aşağıdaki denklemle belirli bir enerjiyle ilişkilendirilir:
Frekans ne kadar yüksek olursa, ışığın enerjisi o kadar yüksek olur.
Bir elektron 3 seviyesinden 2 seviyesine düşerse kırmızı ışık görülür. Bu, hidrojen spektrumundaki kırmızı çizginin kaynağıdır. Kırmızı ışığın frekansını ölçerek enerjisini hesaplayabilirsiniz. Bu enerji, hidrojen atomundaki 3-seviye ile 2-seviye arasındaki enerji boşluğu ile tamamen aynı olmalıdır.
Bu nedenle son denklem, iki elektron seviyesi arasındaki enerji boşluğunun bir ölçüsü olarak yeniden yazılabilir.
Enerjideki olası en büyük düşüş bu nedenle spektrumdaki en yüksek frekans çizgisini üretecektir. En büyük düşüş sonsuzluk seviyesinden 1 seviyesine doğru olacaktır. (Sonsuzluk seviyesinin önemi daha sonra açıklığa kavuşturulacaktır.)
Sonraki birkaç diyagram, enerji seviyeleri üstte ve spektrum altta olmak üzere iki kısımdadır.
Bir elektron 6 seviyesinden düşerse, düşüş biraz daha azdır ve bu nedenle frekans biraz daha düşük olacaktır. (Diyagramın ölçeği nedeniyle, 7 ile sonsuz arasındaki tüm seviyeleri içeren tüm sıçramaları çizmek imkansızdır!)
. . . ve 1 seviyeye diğer olası atlamalar arasında ilerlerken, Lyman serisinin tamamını hesaba katmış olursunuz. Spektrumdaki çizgiler arasındaki boşluklar, enerji seviyeleri arasındaki boşlukların nasıl değiştiğini yansıtır.
Aynı şeyi 2 seviyeye atlamak için yaparsanız Balmer serisindeki çizgilerle karşılaşıyorsunuz. Bu enerji boşluklarının tümü Lyman serisinden çok daha küçüktür ve dolayısıyla üretilen frekanslar da çok daha düşüktür.
Paschen serisi 3-seviyeye atlamalarla üretilecek, ancak onları da dahil edersem diyagram çok dağınık olacak - 4-seviyeye inen diğer tüm serilerden bahsetmiyorum, 5-seviye seviye falan.
Rydberg denklemindeki sayıların önemi
n1 ve n2 Rydberg denkleminde, spektrumda belirli bir çizgiyi oluşturan sıçramanın her iki ucundaki enerji seviyeleri basitçe bulunur.
Örneğin, Lyman serisinde, n1 her zaman 1'dir. Elektronlar Lyman serisinde çizgiler üretmek için 1-seviyeye düşer. Balmer serisi için, n1 her zaman 2'dir, çünkü elektronlar 2 seviyesine düşüyor.
n2 atlanılan seviyedir. Kırmızı çizginin 3 seviyesinden 2 seviyesine düşen elektronlar tarafından üretildiğinden daha önce bahsetmiştik. Bu durumda, n2 3'e eşittir.
Sonsuzluk seviyesinin önemi
Sonsuzluk seviyesi, bir elektronun hidrojen atomunun bir parçası olarak sahip olabileceği mümkün olan en yüksek enerjiyi temsil eder. Peki elektron bu enerjiyi en ufak bir parça bile aşarsa ne olur?
Elektron artık atomun bir parçası değildir. Sonsuzluk seviyesi, pozitif yüklü bir iyon oluşturmak için atomun iyonlaşmasının meydana geldiği noktayı temsil eder.
Hidrojenin iyonlaşma enerjisini bulmak için spektrumu kullanma
Kendisine verilen ek enerji olmadığında, hidrojenin elektronu 1-seviyede bulunur. Bu onun temel durumu olarak bilinir. Elektronu sonsuza kadar hareket ettirmek için yeterli enerji sağlıyorsanız, hidrojeni iyonize etmiş olursunuz.
iyonlaşma enerjisi elektron başına bu nedenle 1-düzey ve sonsuzluk düzeyi arasındaki mesafenin bir ölçüsüdür. Son birkaç diyagrama bakarsanız, bu belirli enerji sıçramasının Lyman serisinin seri limitini ürettiğini göreceksiniz.
Not: Şimdiye kadar bir elektron bir üst seviyeden bir alt seviyeye düştüğünde açığa çıkan enerjiden bahsediyorduk. Belli bir miktarda enerji varsa yayınlandı bir elektron sonsuzluk seviyesinden 1 seviyesine düştüğünde, aynı miktar gerekli elektronu 1-seviyeden sonsuza kadar itmek için.
Lyman serisi limitinin frekansını belirleyebilirseniz, bunu bir atomdaki elektronu 1 seviyesinden iyonlaşma noktasına hareket ettirmek için gereken enerjiyi hesaplamak için kullanabilirsiniz. Bundan, atom molü başına iyonlaşma enerjisini hesaplayabilirsiniz.
Sorun şu ki, bir seri limitinin frekansını bir spektrumdan kesin olarak bulmak oldukça zordur çünkü çizgiler o bölgede birbirine çok yakındır ve spektrum sürekli görünür.
Seri limitinin frekansını grafiksel olarak bulma
Burada Lyman serisindeki en geniş aralıklı yedi satırın frekanslarının bir listesi ve birinden diğerine gidildikçe frekanstaki artış yer almaktadır.
Çizgiler birbirine yaklaştıkça, açıkçası frekanstaki artış daha az olur. Seri sınırında, çizgiler arasındaki boşluk tam anlamıyla sıfır olacaktır.
Bu, frekanstaki artışları gerçek frekansa göre çizecek olsaydınız, eğriyi artışın sıfır olduğu noktaya kadar tahmin (devam) edebileceğiniz anlamına gelir. Bu, seri limitinin frekansı olacaktır.
Aslında yukarıdaki tablodaki verilerden iki grafik çizebilirsiniz. Frekans fark iki frekansla ilgilidir. Örneğin 0.457 sayısı 2.924'ten 2.467 alınarak bulunur. Peki bu iki değerden hangisine karşı 0.457'yi çizmelisiniz?
Her zaman tutarlı olduğunuz sürece - başka bir deyişle, her zaman farkı daha yüksek veya daha düşük rakama göre çizin. İlgilendiğiniz noktada (farkın sıfır olduğu yerde), iki frekans numarası aynıdır.
Aşağıdaki grafikten de göreceğiniz gibi, olası her iki eğriyi de aynı grafik üzerinde çizerek, eğrilerin tam olarak nasıl tahmin edileceğine karar vermeyi kolaylaştırır. Bunlar eğri oldukları için, düz çizgiler olmalarına kıyasla tahminde bulunmak çok daha zordur.
Her iki çizgi de yaklaşık 3.28 x 10 15 Hz'de bir seri sınırına işaret ediyor.
Not: 3,28 PHZ'nin 3,28 x 10 15 Hz ile aynı olduğunu unutmayın. Bu şekil üzerinde bir kontrol olarak Lyman serisinin seri limitini hesaplamak için Rydberg denklemini kullanabilirsiniz: n1 = Lyman serisi için 1 ve n2 = seri limiti için sonsuz. 1/(sonsuz) 2 = sıfır. Bu, 3,29 x 10 15 Hz frekans için bir değer verir - başka bir deyişle, iki değer %0,3 içinde aynı fikirdedir.
Yani . . . şimdi bir hidrojen atomundan tek bir elektronu koparmak için gereken enerjiyi hesaplayabiliriz. Sayfanın yukarısındaki denklemi hatırlayın:
Temel durum ile elektronun atomdan ayrıldığı nokta arasındaki enerji boşluğunu, elde ettiğimiz değeri frekans yerine koyarak ve bir veri kitabından Planck sabitinin değerini arayarak bulabiliriz.
Bu size tek bir atom için iyonlaşma enerjisini verir. Normalde alıntılanan iyonlaşma enerjisini bulmak için, bunu bir mol hidrojen atomundaki atom sayısıyla (Avogadro sabiti) çarpmamız ve sonra onu kilojoule dönüştürmek için 1000'e bölmemiz gerekir.
Not: Bunu 3 önemli rakamdan fazlasına aktarmak yanlış olur. Grafikten elde edilen frekans değeri yalnızca bu doğruluk içindir.
Bu, 1312 kJ mol-1 olan hidrojenin iyonizasyon enerjisi için normal olarak alıntılanan değer ile iyi bir şekilde karşılaştırılır.
Anlayışınızı test etmek için sorular
Bu, yaptığınız ilk soru grubuysa, başlamadan önce lütfen giriş sayfasını okuyun. Daha sonra buraya geri gelmek için tarayıcınızdaki GERİ DÜĞMESİNİ kullanmanız gerekecektir.
Floresan Rezonans Enerji Transferi (FRET) Mikroskobu
Canlı hücrelerdeki belirli moleküler türler arasındaki etkileşimlerin kesin konumu ve doğası, biyolojik araştırmaların birçok alanında büyük ilgi görmektedir, ancak araştırmalar, bu fenomenleri incelemek için kullanılan araçların sınırlı çözünürlüğü nedeniyle sıklıkla engellenmektedir. Geleneksel geniş alan floresan mikroskobu, floresan olarak etiketlenmiş moleküllerin, Rayleigh kriteri tarafından tanımlanan optik uzaysal çözünürlük sınırları içinde, yaklaşık 200 nanometre (0,2 mikrometre) lokalizasyonunu sağlar. Bununla birlikte, tipik bir biyomoleküler süreçte yer alan protein ortakları arasındaki fiziksel etkileşimleri anlamak için, moleküllerin göreceli yakınlığı, kırınım sınırlı geleneksel optik görüntüleme yöntemlerinin izin verdiğinden daha kesin olarak belirlenmelidir. tekniği floresan rezonans enerji transferi (daha yaygın olarak kısaltma ile anılır FRET), optik mikroskopiye uygulandığında, moleküler etkileşimlerin meydana gelmesi için yeterince yakın bir mesafe olan birkaç nanometre içinde (bakınız Şekil 1) iki molekül arasındaki yaklaşımın belirlenmesine izin verir.
Tipik floresan mikroskopi teknikleri, bir dalga boyunda ışığın bir florofor tarafından absorpsiyonuna (uyarma) ve ardından daha uzun bir dalga boyunda ikincil floresan emisyonuna dayanır. Uyarma ve emisyon dalga boyları genellikle birbirinden onlarca ila yüzlerce nanometre ile ayrılır. Çekirdek, mitokondri, hücre iskeleti, Golgi aygıtı ve zarlar gibi hücresel bileşenlerin spesifik floroforlarla etiketlenmesi, sabit ve canlı preparasyonlar içinde lokalizasyonlarını sağlar. Ayrı uyarma ve emisyon spektrumlarına sahip ayrı floroforlarla birkaç hücre altı yapıyı aynı anda etiketleyerek, tek bir hücre veya doku bölümü içindeki etiketli moleküllerin yakınlığını incelemek için özel floresan filtre kombinasyonları kullanılabilir. Bu teknikle, birbirine optik çözünürlük sınırından daha yakın olan moleküller çakışıyor gibi görünür ve bu belirgin uzaysal yakınlık, moleküler bir birleşmenin mümkün olduğunu ima eder. Ancak çoğu durumda, normal kırınım sınırlı floresan mikroskop çözünürlüğü, biyomoleküller arasında bir etkileşimin gerçekten olup olmadığını belirlemek için yetersizdir. Floresan rezonans enerji transferi, uyarılmış bir durumdaki florofordan yakın çevredeki ikinci bir kromofora radyasyonsuz enerji transferinin gerçekleştiği bir süreçtir. Enerji transferinin gerçekleşebileceği aralık yaklaşık 10 nanometre (100 angstrom) ile sınırlı olduğundan ve transfer verimliliği floroforlar arasındaki ayırma mesafesine son derece duyarlı olduğundan, rezonans enerji transferi ölçümleri moleküler etkileşimleri araştırmak için değerli bir araç olabilir. .
Floresan rezonans enerji transferinin mekanizması şunları içerir: bağışçı Uyarılmış bir elektronik durumda florofor, uyarma enerjisini yakındaki bir akseptör Kromofor, uzun menzilli dipol-dipol etkileşimleri yoluyla radyasyonsuz bir şekilde. Enerji transferini destekleyen teori, uyarılmış bir floroforun, benzer bir rezonans frekansına sahip ikinci bir dipol ile bir enerji alışverişine girebilen salınımlı bir dipol olarak ele alınması kavramına dayanmaktadır. Bu bağlamda, rezonans enerji aktarımı, aynı frekansta titreşen bir çift diyapazon gibi, bağlı osilatörlerin davranışına benzer. Buna karşılık, ışınımsal enerji transferi, bir fotonun emisyonunu ve yeniden emilmesini gerektirir ve örneğin fiziksel boyutlarına ve optik özelliklerine, ayrıca kabın geometrisine ve dalga cephesi yollarına bağlıdır. Işınımsal mekanizmalardan farklı olarak, rezonans enerji transferi, verici-alıcı çifti ile ilgili önemli miktarda yapısal bilgi verebilir.
Rezonans enerji transferi, bir floroforun çevreleyen solvent kabuğuna duyarlı değildir ve bu nedenle floresan söndürme, uyarılmış durum reaksiyonları, solvent gevşemesi veya anizotropik ölçümler gibi solvente bağlı olaylar tarafından ortaya çıkarılan benzersiz moleküler bilgiler üretir. Rezonans enerji transferinde yer alan floroforlar üzerindeki en büyük çözücü etkisi, verici ve alıcının spektral özellikleri üzerindeki etkidir. Işınımsız enerji transferi, kısa menzilli çözücü etkilerinden çok daha uzun mesafelerde meydana gelir ve ilgili floroforlar arasında konumlandırılan bileşenlerin (çözücü ve konak makromolekül) dielektrik doğası, esas olarak aşağıdakilere bağlı olan rezonans enerji transferinin etkinliği üzerinde çok az etkiye sahiptir. verici ve alıcı florofor arasındaki mesafe.
Floresan rezonans enerji transferi olgusuna foton emisyonu aracılık etmez ve ayrıca alıcı kromoforun floresan olmasını bile gerektirmez. Bununla birlikte, çoğu uygulamada, hem verici hem de alıcı floresandır ve enerji aktarımının meydana gelmesi, alıcı floresan emisyonundaki bir artışla birlikte donör floresansının söndürülmesi ve floresan ömrünün azalmasıyla kendini gösterir. Enerji transfer sürecinin verimliliği, verici ve alıcı molekülleri ayıran mesafenin altıncı kuvvetinin tersi ile orantılı olarak değişir. Sonuç olarak, FRET ölçümleri etkili bir yöntem olarak kullanılabilir. moleküler cetvel uygun bir donör ve alıcı florokrom ile etiketlenmiş biyomoleküller arasındaki mesafeleri birbirinden 10 nanometre içinde olduklarında belirlemek için.
Aynı makromoleküler proteinin karşıt uçlarına bağlı iki florokrom arasındaki floresan rezonans enerji transferinin varsayımsal bir örneği Şekil 1'de sunulmuştur. Doğal konformasyonda (Şekil 1(a)), iki florofor yaklaşık 12 nanometrelik bir mesafe ile ayrılmıştır. florokromlar arasında molekül içi rezonans enerji aktarımının gerçekleşmesi için çok uzak. Bununla birlikte, protein bir konformasyonel değişikliğe uğramak üzere indüklendiğinde (Şekil 1(b)), iki florokrom birbirine çok daha yakın hale getirilir ve şimdi FRET moleküler etkileşimlerine katılabilir. Şekilde, verici florokromun uyarılması, sarı tri-nükleer aromatik molekülün etrafındaki mavi bir ışıma ile gösterilirken, karşılık gelen alıcı emisyonu (Şekil 1(b)) sağdaki ikinci heterosiklik florokromu çevreleyen yeşil bir ışıma ile temsil edilir. - proteinin el tarafı. Enerji transferi ölçümleri genellikle bir makromolekül üzerindeki bölgeler arasındaki mesafeleri ve bu mesafeler üzerindeki konformasyonel değişikliklerin etkilerini tahmin etmek için kullanılır. Bu tür deneyde, verici ve alıcı arasındaki mesafeyi hesaplamak ve makromolekül hakkında yapısal bilgi elde etmek için enerji transferinin derecesi kullanılır.
Floresan rezonans enerji transferi, proteinler ve lipidlerdeki moleküller arası ve moleküller arası yapısal ve fonksiyonel değişiklikleri araştırmak için sıklıkla kullanılmış olsa da, canlı hücrelerde FRET mikroskopi tekniklerinin uygulanmasının önündeki en büyük engel, belirli hücre içi proteinleri uygun floroforlarla etiketlemek için uygun yöntemlerin olmaması olmuştur. . Denizanasının klonlanması yeşil floresan proteini (GFP) ve çok çeşitli hücre tiplerinde ekspresyonu, canlı hücrelerde hem gen ekspresyonu hem de yapısal protein lokalizasyonu için belirteçlerin geliştirilmesinde kritik bir anahtar haline geldi. Mavi ışık yayan bir flüoresan proteini de dahil olmak üzere proteinin çeşitli spektral olarak farklı mutasyon varyantları geliştirilmiştir (mavi floresan protein, BFP). Doğal GFP ve BFP mutantları için hem uyarma hem de emisyon spektrumları, FRET yaklaşımıyla uyumlu olacak şekilde dalga boyunda yeterince ayrılmıştır. Şekil 2, floresan rezonans enerji transferi ve mutant floresan proteinler kullanılarak protein-protein etkileşimlerinin tespiti için stratejiyi gösterir. Biri BFP (verici) ve diğeri GFP (alıcı) ile etiketlenmiş iki protein fiziksel olarak etkileşime girerse, kompleks maksimum absorbans dalga boyunda uyarıldığında alıcı emisyon maksimumunda (510 nanometre) artan yoğunluk gözlenecektir. (380 nanometre) donörün. Proteinlerin kompleks oluşturmaması, alıcı (GFP) floresan emisyonu olmamasına neden olur.
Darbeli lazerler, mikroskop optikleri ve bilgisayar tabanlı görüntüleme teknolojisindeki gelişmelerle birlikte, verici ve alıcı floroforların aslında biyomoleküllerin bir parçası olduğu etiketleme tekniklerinin geliştirilmesi, canlı hücrelerde dinamik protein etkileşimlerinin görselleştirilmesini sağlamıştır. Protein partner etkileşimlerinin araştırılmasına ek olarak, floresan rezonans enerji transferinin son uygulamaları, proteaz aktivitesi çalışmalarını, membran voltaj potansiyellerindeki değişiklikleri, kalsiyum metabolizmasını ve gen ekspresyonunun nicelleştirilmesi gibi yüksek verimli tarama deneylerinin yürütülmesini içerir. tek canlı hücreler.
Floresan Rezonans Enerji Transferinin Prensipleri
Rezonans enerji transferi süreci (RET) elektronik olarak uyarılmış durumdaki bir donör florofor, uyarma enerjisini yakındaki bir kromofor olan alıcıya aktardığında gerçekleşebilir. Prensipte, verici molekülün floresan emisyon spektrumu, alıcı molekülün absorpsiyon spektrumu ile örtüşüyorsa ve ikisi minimum uzaysal yarıçap içindeyse, verici uyarma enerjisini uzun menzilli dipol-dipol moleküller arası aracılığıyla alıcıya doğrudan aktarabilir. bağlantı. 1940'ların sonlarında Theodor Förster tarafından önerilen bir teori, başlangıçta rezonans enerji transferinde yer alan moleküler etkileşimleri tanımladı ve Förster ayrıca transfer hızı, kromoforlar arası mesafe ve ilgili kromoforların spektral özellikleri arasındaki ilişkiyi tanımlayan resmi bir denklem geliştirdi.
Rezonans enerji transferi, çarpışma gerektirmeyen ve ısı üretimi içermeyen ışımasız kuantum mekaniksel bir süreçtir. Enerji transferi gerçekleştiğinde, alıcı molekül donör molekül floresansını söndürür ve alıcının kendisi bir florokrom ise, artan veya duyarlı floresan emisyonu gözlemlenir (bkz. Şekil 3).Bu fenomen, verici floroforun maksimum absorpsiyonuna karşılık gelen dalga boylarındaki ışıkla hem donör hem de alıcı molekülleri içeren bir numunenin uyarılmasıyla ve alıcının maksimum emisyonunun yakınında ortalanmış dalga boylarında yayılan ışığın saptanmasıyla gözlemlenebilir. Popülaritesi hızla artan alternatif bir saptama yöntemi, alıcının varlığında ve yokluğunda donör floroforun floresan ömrünü ölçmektir.
Şekil 3'te, floresan rezonans enerji transferinde donör emisyonu ve alıcı absorbansı arasında yer alan birleştirilmiş geçişleri gösteren bir Jablonski diyagramı sunulmaktadır. Soğurma ve emisyon geçişleri düz dikey oklarla (sırasıyla yeşil ve kırmızı) temsil edilirken, titreşimsel gevşeme dalgalı sarı oklarla gösterilir. Birleştirilmiş geçişler, foton aracılı elektronik geçişlerden kaynaklanmış olmaları durumunda Jablonski diyagramında doğru yerleşimlerini öneren kesikli çizgilerle çizilir. Uygun bir alıcının varlığında, donör florofor, uyarılmış durum enerjisini bir foton yaymadan doğrudan alıcıya aktarabilir (Şekil 3'te mavi bir okla gösterilmiştir). Ortaya çıkan hassaslaştırılmış floresan emisyonu, alıcının emisyon spektrumuna benzer özelliklere sahiptir.
Rezonans enerji transferinin gerçekleşmesi için çeşitli kriterlerin karşılanması gerekir. Verici ve alıcı moleküllerin örtüşen emisyon ve absorpsiyon spektrumlarına ek olarak, ilgili iki florofor, birbirinden 1 ila 10 nanometre aralığında konumlandırılmalıdır. Förster tarafından türetilen denklemlerde (ve aşağıda tartışıldığı gibi) açıklandığı gibi, verici ve alıcı moleküller arasındaki enerji transfer verimliliği, ikisini ayıran mesafenin altıncı kuvveti olarak azalır. Sonuç olarak, verici floroforun uyarma enerjisini ışınımsız etkileşim yoluyla alıcıya aktarma yeteneği, moleküller arasındaki mesafe arttıkça keskin bir şekilde azalır ve FRET fenomenini yaklaşık 10 nanometrelik bir maksimum donör-alıcı ayırma yarıçapı ile sınırlar. 1 nanometreden daha az mesafelerde, birkaç başka enerji ve/veya elektron transferi modu mümkündür. Rezonans enerji transfer sürecinin mesafe bağımlılığı, moleküler etkileşimlerin araştırılmasındaki faydasının birincil temelidir. Verici ve alıcı floroforlarla etiketlenmiş molekülleri içeren canlı hücre çalışmalarında, rezonans enerji transferi yalnızca biyolojik olarak birbirleriyle etkileşime girecek kadar yakın moleküller arasında gerçekleşir.
Rezonans enerji transferi için ek bir gereklilik, donör molekülün floresan ömrünün, olayın meydana gelmesine izin vermek için yeterli süreye sahip olması gerektiğidir. Hem oran (K(T)) ve verimlilik (E(T)) enerji transferinin miktarı, alıcının varlığında ve yokluğunda donör floroforun ömrü ile doğrudan ilişkilidir. Förster'ın teorisine göre ve deneysel olarak doğrulandı, enerji aktarım hızı şu denklemle verilir:
nerede R(0) bu Forster kritik mesafe, τ(D) alıcının yokluğunda bağışçının yaşam süresidir ve r verici ve alıcı kromoforları arasındaki mesafedir. Förster kritik mesafesi (R(0)), transfer hızının, alıcının yokluğunda donör bozunma (de-eksitasyon) oranına eşit olduğu alıcı-verici ayırma yarıçapı olarak tanımlanır. Başka bir deyişle, verici ve alıcı yarıçapı (r) Förster mesafesine eşittir, o zaman transfer verimliliği yüzde 50'dir. Bu ayırma yarıçapında, verici uyarma enerjisinin yarısı rezonans enerji transferi yoluyla alıcıya aktarılırken, diğer yarısı floresan emisyonu da dahil olmak üzere diğer tüm mevcut süreçlerin bir kombinasyonu yoluyla dağıtılır.
Kavramsal olarak, Förster kritik mesafesi, altında rezonans enerji transferinin hala gerçekleşeceği verici ve alıcı moleküller arasındaki maksimum ayrılma uzunluğudur. Kritik mesafe değeri tipik olarak 2 ila 6 nanometre aralığına düşer, bu da tesadüfen birçok protein moleküler boyutunun sırasına göredir. Ek olarak, kritik mesafe aralığı ayrıca hücre zarı kalınlığı ve çoklu alt birime sahip proteinler üzerindeki mesafe ayırma bölgeleri gibi biyolojik olarak önemli birkaç boyuta da karşılık gelir. Değeri R(0) (nanometre cinsinden) aşağıdaki ifadeden hesaplanabilir:
hangisinde κ-kare donör ve alıcının geçiş dipolleri arasındaki uzaydaki nispi oryantasyonu tanımlayan bir faktördür, J(λ) donör emisyonu ve alıcı absorbans spektrumu bölgesindeki örtüşme integralidir (dalga boyu nanometre olarak ifade edilir), η ortamın kırılma indisini temsil eder ve S(D) vericinin kuantum verimidir.
Enerji transferinin verimliliği, E(T), alıcıya aktarılan verici tarafından soğurulan fotonların fraksiyonunun bir ölçüsüdür ve verici-alıcı ayırma mesafesi ile ilgilidir, r, denkleme göre:
ve E(T) şu şekilde değerlendirilir:
nerede τ(DA) alıcının huzurunda vericinin ömrü ve τ(D) alıcının yokluğunda vericinin yaşam süresidir. Bu nedenle, bir alıcının varlığında ve yokluğunda donör floresan ömrünü ölçerek (bu, alıcıya bağlı olarak donör sönmesinin boyutunun göstergesidir), verici ve alıcı molekülleri ayıran mesafeyi belirlemek mümkündür. Yaygın olarak uygulanan birçok teknikte, enerji transfer verimliliği, alıcının varlığında ve yokluğunda bağıl ortalama donör floresan yoğunluklarının kararlı durum ölçümleri ile belirlenir (ömürler ölçülerek değil).
Özetle, enerji transfer hızı, verici emisyonu ve alıcı absorpsiyon spektrumu (bkz. Şekil 4) arasındaki spektral örtüşmenin derecesine, vericinin kuantum verimine, verici ve alıcı geçiş dipol momentlerinin nispi yönelimine ve Verici ve alıcı molekülleri ayıran mesafe. Verici ve alıcı arasındaki mesafeyi etkileyen herhangi bir olay veya süreç, rezonans enerji aktarım hızını etkileyecek ve sonuç olarak, artefaktların kontrol edilebilmesi veya ortadan kaldırılabilmesi koşuluyla, olgunun nicelleştirilmesine izin verecektir.
Şekil 4'te sunulanlar, camgöbeği floresan proteininin absorpsiyon ve emisyon spektrumlarıdır (CFP, donör) ve kırmızı floresan proteini (RFP veya DsKırmızı, alıcı) bir floresan rezonans enerji transfer çifti olarak potansiyel uygulamaları ile karşılaştırıldığında. Her iki biyolojik peptit için absorpsiyon spektrumları kırmızı eğriler olarak gösterilirken emisyon spektrumları mavi eğriler olarak sunulur. Verici emisyon ve alıcı absorpsiyon spektrumları arasındaki örtüşme bölgesi, eğrilerin tabanına yakın gri bir alanla temsil edilir. Moleküllerin spektral örtüşmesi çok fazla arttığında, spektral geçiş veya karşıdan karşıya geçmek alıcı emisyon kanalında uyarılmış alıcıdan gelen sinyalin (donörün uyarma aydınlatmasından kaynaklanan) ve donör emisyonunun algılandığı yerde gerçekleşir. Sonuç, zayıf alıcı floresan emisyonundan çıkarılması gereken yüksek bir arka plan sinyalidir.
Işınımsız enerji transferinin temel teorisi, sabit bir mesafe ile ayrılmış bir verici-alıcı çiftine doğrudan uygulanabilir, bu durumda enerji transfer hızı Förster mesafesinin bir fonksiyonudur. R(0), hangi sırayla bağlıdır κ-kare, J(λ), η, ve S(D). Bu faktörler biliniyorsa, verici ve alıcı arasındaki mesafe hesaplanabilir. Çoklu alıcı kromoforları ve mesafe dağılımları gibi durumları tanımlamak için daha karmaşık formülasyonlar gereklidir. Tablo 1'de, birkaç popüler donör-alıcı florofor çiftinin spektral örtüşmesinden tespit edilen, deneysel olarak ölçülen bir dizi Förster kritik mesafeleri sunulmaktadır. Değişken, her ikisi de yerel çevresel koşullara bağlı olan donör kuantum verimini ve spektral örtüşme derecesini içerdiğinden, Förster mesafe değerleri, rezonans enerji transferini araştırmak için kullanılanlarla aynı deneysel koşullar altında belirlenmelidir.
Enerji transfer ortamının kırılma indisi genellikle solvent bileşiminden bilinir veya belirli bir makromolekül için tahmin edilebilir ve genellikle sulu çözeltide 1.4 olarak alınır. Vericinin kuantum verimi, bilinen kuantum verimine sahip standart floroforlarla karşılaştırılarak belirlenir. Çünkü S(D) hesaplanmasında altıncı kök olarak görünür. R(0)değerindeki küçük hatalar veya belirsizlikler S(D) Förster mesafe hesaplaması üzerinde büyük bir etkisi yoktur. Ayrıca altıncı kök bağımlılığından dolayı, R(0) varyasyonlardan büyük ölçüde etkilenmez. J(λ), ancak örtüşme integrali yine de her verici-alıcı çifti için değerlendirilmelidir. Genel olarak, verici emisyon spektrumu ile alıcı absorpsiyon spektrumu arasındaki daha yüksek örtüşme dereceleri, daha büyük Förster kritik mesafe değerleri verir.
Ortak RET Donör-Alıcı Çiftleri için Förster Kritik Mesafesi
|donör||Akseptör||Förster Mesafesi (Nanometre)|
|triptofan||Dansil||2.1|
|IAEDANS (1)||GGPM (2)||2.5 - 2.9|
|BFP||DsRFP||3.1 - 3.3|
|Dansil||FITC||3.3 - 4.1|
|Dansil||oktadesilrodamin||4.3|
|CFP||GFP||4.7 - 4.9|
|CF (3)||Teksas Kırmızısı||5.1|
|floresan||tetrametilrodamin||4.9 - 5.5|
|Cy3||Cy5||>5.0|
|GFP||YFP||5.5 - 5.7|
|VÜCUT FL (4)||VÜCUT FL (4)||5.7|
|Rodamin 6G||Malahit yeşili||6.1|
|FITC||Eozin Tiyosemikarbazid||6.1 - 6.4|
|B-Fikoeritrin||Cy5||7.2|
|Cy5||Cy5.5||>8.0|
(1) 5-(2-iyodoasetilaminoetil)aminonaftalin-1-sülfonik asit
(2) N-(4-dimetilamino-3,5-dinitrofenil)maleimid
(3) karboksifloresein süksinimidil ester
(4) 4,4-difloro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indasen
Tablo 1
Yönlendirme faktörünün değerlendirilmesindeki belirsizlik (κ-kare) literatürde kapsamlı bir şekilde tartışılmıştır ve Förster teorisinin geçerli ve mesafe ölçümüne uygulanabilir olduğuna dair deneysel kanıtlara rağmen, bu değişken biraz tartışmalı olmaya devam etmiştir. Förster mesafelerinin genellikle varsayılan bir değer için verildiğini bilmek önemlidir. κ-kare, tipik olarak dinamik olarak ortalama 2/3 değeri (0,67). Bu varsayılan değer, enerji transferinden önce dönel difüzyon yoluyla verici ve alıcı oryantasyonunun rastgeleleştirilmesinden kaynaklanır. Yönlendirme faktörü, verici emisyon dipolünün ve alıcı absorpsiyon dipolünün uzaydaki nispi yönelimlerine bağlıdır ve sıfır ile 4 arasında değişebilir. 1 değeri paralel geçiş dipollerine karşılık gelirken, 4 değeri her ikisi de olan dipollerden kaynaklanır. paralel ve doğrusal.
Förster mesafesiyle altıncı kök ilişkisi nedeniyle, oryantasyon faktöründe 1'den 4'e bir değişiklik, hesaplanan mesafede yalnızca yüzde 26'lık bir değişiklik üretir ve geleneksel olarak varsayılan 0.67 değeri olduğunda maksimum yüzde 35'lik bir hata mümkündür. uygulamalı. En ciddi potansiyel hata, dipoller birbirine tam olarak dik olarak yönlendirilirse ve buna karşılık gelen κ-kare değeri sıfıra eşit olur. Bir dizi statik yönelimin var olduğu ve floroforun uyarılmış durum ömrü boyunca değişmediği varsayımı da dahil olmak üzere, belirsizlikle başa çıkmak için çeşitli teknikler kullanılmıştır. Verici ve alıcı için floresan anizotropi ölçümleri, sınırların belirlenmesine izin verebilir. κ-kare varyasyonu. Ek olarak, düşük floresans polarizasyonuna sahip floroforların kullanılması (birkaç örtüşen geçişten kaynaklanan emisyon nedeniyle), oryantasyon faktöründeki belirsizliği azaltır. Olası değerlerin sınırlandırılması κ-kare bu şekilde potansiyel mesafe hesaplama hatasını belki yüzde 10'a düşürür.
Çoğu durumda, oryantasyon faktörünü belirlemek imkansız değilse de zordur ve değişkenin tam değeri genellikle aşılmaz bir problem olarak görülür. Bununla birlikte, bazı kanıtlar, rezonans enerji transferi hesaplamalarında faktörün önemi için bir sınırlama olduğunu göstermektedir. Rezonans enerji transfer spektroskopisi ve x-ışını kırınım teknikleri kullanılarak verici ve alıcı mesafelerinin karşılaştırılması, faktör için (Förster teorisi tarafından önerildiği gibi), en azından küçük peptitler ve proteinler için 0.67 değerinin varsayılmasının geçerliliğini büyük ölçüde destekler. Daha büyük proteinler için daha fazla belirsizlik vardır. Yönlendirme faktörü için bu değerin kullanımı, hem donör hem de alıcı probların sınırsız izotropik harekete geçmekte serbest olduğu varsayımı altında geçerlidir. Makromoleküllere tek veya çift bağ ile bağlanan floroforlar için, donör ve alıcının segmental hareketlerinin dinamik olarak rastgele yönelimlerle sonuçlanma eğiliminde olduğuna dair deneysel kanıtlardan daha fazla gerekçe elde edilmiştir.
Gevşek bağlı florokromlar için, tekli bağlar etrafında serbest dönme hareketi, ortalama bir yönlendirme değerinin kullanılmasını sağlamalıdır, ancak çoklu bağlantı bölgelerinden bağlanan moleküllerin sınırsız hareketi muhtemelen gerçekleşmez. Öte yandan, uç değerler için sıfır ve 4 κ-kare, donör ve alıcının tam floresan polarizasyonunu gerektirir; bu, elde edilmesi olası olmayan bir durumdur. Verici-alıcı dağılım mesafelerinin ve oryantasyonlarının gözlemlenen ortalama mesafeyi belirlediğini iddia eden bazı araştırmacılar tarafından istatistiksel hesaplamalar sunulmuştur. Gözlemlenen mesafede bir dağılım olması koşuluyla (ve bu, verici ve alıcının birbirine çok yakın olmasıyla sınırlı değildir). R(0)), floroforlar arasındaki ortalama mesafe güvenilir bir şekilde elde edilebilir ve oryantasyon faktöründen kaynaklanan belirsizlik değerlendirilir.
Yönlendirme faktörünün bağımlılığı (κ-kare) verici emisyon dipolünün ve alıcı absorpsiyon dipolünün (Şekil 5'te gösterilen) nispi yönelimleri aşağıdaki denklemle verilir:
2 = (cos θT - 3cos θDcos θA)2 = (sin θD sin θAcos Φ - 2cos θDcos θA)2
nerede θ(T) vericinin emisyon geçiş dipolü ile alıcının absorpsiyon geçiş dipolü arasındaki açıdır, θ(D) ve θ(A) bu dipoller ile verici ve alıcıyı birleştiren vektör arasındaki açılardır ve Φ iki geçiş dipolünü içeren düzlemler arasındaki açıdır.
Verici-alıcı ayırma uzunluğu Förster mesafesine yaklaştığında, enerji transfer verimliliği mesafe değişikliklerine en duyarlıdır (R(0)) iki molekül için. Şekil 6, transfer verimliliği ile donör ve alıcı arasındaki mesafe arasındaki üstel ilişkiyi göstermektedir. Ayırma mesafesi aşağıda azaldıkça verimlilik hızla yüzde 100'e yükselir R(0)ve tersine, sıfıra düştüğünde r daha büyüktür R(0). Aktarım verimliliğinin mesafeye güçlü (altıncı güç) bağımlılığı nedeniyle, verici-alıcı ayırma mesafesinin ölçümleri, yalnızca verici ve alıcı yarıçapı Förster mesafesi içinde iki kat olduğunda güvenilirdir. Ne zaman r yaklaşık yüzde 50'si R(0), rezonans enerji transfer verimliliği maksimuma yakındır ve daha kısa mesafeler güvenilir bir şekilde belirlenemez. Verici-alıcı mesafesi aşıldığında R(0) değeri yüzde 50, eğrinin eğimi o kadar sığdır ki daha uzun ayırma mesafeleri çözülmez.
Kritik Förster mesafesini bilmenin pratik önemi, değerin belirli bir prob çifti için FRET tarafından belirlenebilen ayırma mesafeleri aralığı için bir kılavuz sağlamasıdır (bkz. Tablo 1). Verici-alıcı mesafeleri Förster mesafesine yakın olduğunda enerji transferi ölçümü mesafe değişimine çok duyarlı olduğundan, hedef moleküler etkileşimin yaklaşık boyutları bir floresan boya çifti seçiminde en önemli faktördür. Kararlı durum veya zamanla çözümlenmiş ölçümlerin gerçekleştirilip gerçekleştirilmediğine bağlı olarak göz önünde bulundurulması gereken diğer faktörler arasında kimyasal kararlılık, kuantum verimi ve florofor bozunma ömürleri yer alır. Yaygın floresan rezonans enerji transfer teknikleri için dahili mesafe referansı bulunmadığından, transfer verimlilikleri ölçülerek hesaplanan mesafeler, donör-alıcı çiftlerinde ölçülen spektroskopik verilerden türetilen bir Förster mesafesine göredir.
Förster mekanizması tarafından rezonans enerjisi transferi olgusu bazı açılardan karmaşıktır, ancak sonuçta ortaya çıkan etkisinde basit ve güvenilirdir. Förster mesafeleri, verici ve alıcının spektral özelliklerinden doğru bir şekilde tahmin edilebilir ve teoride henüz bir istisna tanımlanmadığından, verici-alıcı molekül çiftini birbirine çok yakın yerleştiren herhangi bir koşulda rezonans enerji aktarımının meydana geldiği varsayılabilir. Dipol transferini tanımlayan teorideki karmaşıklık, transfer mekanizmasının kendisinden değil, mesafe dağılımlarının (rastgele olmayan dağılımlar dahil) ortaya çıkmasından ve donör ve alıcı moleküllerin difüzyonundan kaynaklanmaktadır. Bir dizi geometri ve zaman diliminde enerji transferinin mesafe bağımlılığının ortalamasını almak için adımlar atıldığında, FRET etkileşimli moleküller arasındaki uzaysal dağılımların incelenmesi için güvenilir bir tekniktir.
Optik Mikroskopide FRET Tekniklerinin Uygulanması
Floresan rezonans enerji transferi araştırmaları için mikroskop konfigürasyon parametreleri, floroforların, numunenin ve görüntüleme modlarının gereksinimlerine göre değişir, ancak hemen hemen her dikey veya ters mikroskop FRET mikroskopisi için uyarlanabilir (bakınız Şekil 7). Genel olarak, mikroskop, düşük karışma seviyelerine (minimum engelleme seviyesi) ve florofor spektrumlarına yakından karşılık gelen bant geçiş bölgelerine sahip kaliteli girişim filtrelerine bağlı yüksek çözünürlüklü (12-bit) soğutmalı ve yoğunlaştırılmış bir CCD kamera sistemi ile donatılmalıdır. Dedektör hassasiyeti, filtre bant geçişinin ne kadar dar olabileceğini belirler ve yine de minimum spektral sızıntı gürültüsü ile kabul edilebilir hızlarda veri toplamanın ilerlemesini sağlar. Çoğu durumda, görüntü kaymalarını en aza indirmek veya ortadan kaldırmak için görüntüleri elde etmek için uyarma ve emisyon filtresi tekerleklerine veya kaydırıcılarına bağlı tek bir dikromatik ayna kullanılmalıdır.
Geniş alan floresan mikroskobu, kontrastı azaltan ve görüntü bozulmasına yol açan önemli odak dışı sinyale sahip görüntüler vermek için odak düzleminin üstünde ve altından kaynaklanan florofor emisyonundan muzdariptir. Bu sorun, rezonans enerji aktarımının bir sonucu olarak üretilen doğal olarak düşük sinyal seviyeleri nedeniyle FRET mikroskopisinde daha da karmaşık hale gelir. Dijital dekonvolüsyon teknikleri, odak düzleminden uzaktaki sinyalleri azaltmak veya ortadan kaldırmak için optik kesitleme ile birleştirilebilir, ancak süreç hesaplama açısından yoğundur ve birçok dinamik FRET görüntüleme deneyi için yeterince hızlı olmayabilir. Lazer tarama konfokal teknikleri, gerçek zamana yaklaşan aralıklarla seri optik bölümlerin toplanmasını sağlarken, yanal çözünürlükte önemli bir gelişme sağlamak için FRET mikroskopisine uygulanabilir.Konfokal mikroskopinin en büyük dezavantajı, rezonans enerji transferi deneylerinde florofor verici ve alıcı çiftlerinin seçimini kısıtlayan, belirli bir sistem için mevcut standart lazer çizgileriyle uyarma dalga boylarının sınırlandırılmasıdır. Multifoton uyarımı ayrıca FRET teknikleriyle birlikte kullanılabilir ve ilgili daha uzun uyarım dalga boyları nedeniyle hücrelere daha az zarar verir. Ek olarak, otofloresan artefaktları ve numunenin ışıkla ağartılmasının, multifoton uyarımın sınırlı uyarım hacmi özelliği içinde meydana gelme olasılığı daha düşüktür.
Çeşitli floresan rezonans enerji transferi görüntüleme motifleri ile kültürdeki canlı hücreleri gözlemleyebilen tipik bir mikroskop konfigürasyonu Şekil 7'de sunulmaktadır. Tersine çevrilmiş doku kültürü mikroskobu, hücreleri incelemek ve kaydetmek için sütun üzerinde standart bir tungsten-halojen lamba yuvası ile donatılmıştır. standart aydınlık alan, faz kontrastı veya diferansiyel girişim kontrastı (DIC) aydınlatma. Son iki kontrast artırma tekniğinin, hücresel mimari içindeki floroforların uzamsal konumunu ortaya çıkarmak için floresan ile kombinasyon halinde kullanılabileceğini unutmayın. Geniş alan floresan ve parlak alan görüntü yakalama için mikroskop trinoküler kafasına standart bir Peltier soğutmalı CCD kamera sistemi eklenmiştir.
Rezonans enerji transferi deneyleri, geniş alan aydınlatması (ark deşarj lambası) veya yüksek hızlı bir Nipkow disk sistemi ile donatılmış gerçek zamanlı bir tarama konfokal eki kullanılarak multispektral ile gerçekleştirilir. Argon-krypton lazer ışını, konfokal tarama kafasına geçmeden önce spesifik uyarma dalga boylarını seçmek için önce akustik-optik ayarlanabilir dalga boyu cihazından süzülür. Görüntüler, ayrı kanalları okuyan ve bir ana bilgisayara kuyruklanan iki yüksek çözünürlüklü Gen III yoğunlaştırılmış soğutmalı CCD kamera kullanılarak toplanır. Numunenin yanal olarak taranması (x ve y) ve eksenel (z) düzlemler, üç boyutlu görüntü rekonstrüksiyonu için optik bölümlerin toplanmasını sağlar. Çeşitli görüntü işleme yazılım programları, gösterilen mikroskop konfigürasyonuyla uyumludur.
Fenomenin temel ilkelerine dayanarak, bir optik mikroskopla floresan rezonans enerji transferi ölçümleri yapılırken bir dizi önemli pratik nokta göz önünde bulundurulmalıdır:
- Verici ve alıcı floroforların konsantrasyonları yakından kontrol edilmelidir. Floresan rezonans enerji transferine ulaşmanın istatistiksel olarak en yüksek olasılığı, bir dizi alıcı molekül tek bir verici molekülü çevrelediğinde ortaya çıkar.
- Artefakt, verici-alıcı moleküler oranını ve dolayısıyla rezonans enerji transfer sürecinin ölçülen değerini değiştirebileceğinden, fotoağartma ortadan kaldırılmalıdır.
- Verici floresan emisyon spektrumu ve alıcı absorpsiyon spektrumu, önemli bir örtüşme bölgesine sahip olmalıdır.
- Vericiyi uyarmak için kullanılan dalga boyu bölgesinde alıcının minimum doğrudan uyarılması olmalıdır. Sabit durum FRET mikroskopi ölçümlerinde yaygın bir hata kaynağı, alıcı filtre setleri ile donör emisyonunun saptanmasıdır.
- Hem vericinin hem de alıcının emisyon dalga boyları, dedektörün maksimum hassasiyet aralığı ile örtüşmelidir.
- Donörden donöre kendi kendine transfer olasılığını azaltmak için donör absorpsiyon ve emisyon spektrumları minimum örtüşmeye sahip olmalıdır.
- Verici molekül, rezonans enerji transferinin gerçekleşmesi için floresan olmalı ve yeterince uzun ömür sergilemelidir.
- Verici, oryantasyon (-kare) faktörünün değerindeki belirsizlikleri en aza indirmek için düşük polarizasyon anizotropisi sergilemelidir. Bu gereklilik, emisyonları birbiriyle örtüşen birkaç uyarma geçişinden kaynaklanan donörler tarafından karşılanır.
- Antikor etiketleme teknikleri kullanılırken, donör ve alıcı florokromlarla konjuge edilmiş reaktifler biyolojik aktivitelerinde değiştirilmemelidir. Aktivitedeki herhangi bir azalma, ortaya çıkan rezonans enerji transferi ölçümlerinin geçerliliğini ciddi şekilde etkileyecektir.
- Floresan rezonans enerji transferi, verici ve alıcı moleküllerin uygun dipol hizalamasına sahip olmasını ve birbirinden 10 nanometre içinde konumlandırılmasını gerektirdiğinden, moleküllerin eklendiği reaktiflerin üçüncül yapısı dikkate alınmalıdır. Örneğin, bir protein üzerinde donör-alıcı moleküller farklı yapısal konumlara (karboksi veya amino terminali gibi) bağlanabildiğinde, proteinler etkileşime girse bile FRET'in gözlemlenmemesi mümkündür, çünkü donör ve alıcı moleküller Etkileşen moleküllerin zıt uçlarında bulunur.
- FRET araştırmaları için yeşil floresan protein mutantları ile etiketlenmiş canlı hücreler, etiketli proteinin doğal muadili ile aynı hücre içi habitatı ve özellikleri benimsediğini doğrulamak için geleneksel immünohistokimyasal teknikler kullanılarak analiz edilmelidir.
Floresan rezonans enerji transferi olgusunun optik mikroskopta bir araç olarak anlamlı veriler sağlaması için hem numune hazırlama hem de görüntüleme parametreleri optimize edilmelidir. Uygun verici ve alıcı probların seçimi ve bunların moleküler etiketler olarak kullanılma biçimleri büyük bir zorluktur. Ek olarak, enerji transferine izin veren bir etiketleme stratejisi açıklandıktan sonra, ölçümün kendisini gerçekleştirmek için geniş bir teknik yelpazesi kullanılabilir. Nicel floresan mikroskobu incelemelerinin çoğu, floresan emisyonunun yoğunluğunu ölçerek yürütülür. FRET'in floresan yoğunluğuna dayalı tespiti, tipik olarak, verici ve alıcı kromoforlarına karşılık gelen iki dalga boyunda emisyon yoğunluğunun nispi miktarlarındaki değişiklikleri izleyerek elde edilir. Floresan rezonans enerji transferinin gerçekleşmesi için koşullar uygun olduğunda, alıcı emisyonunda bir artış (ben(A)) donör emisyonunda eşlik eden bir azalmaya eşlik eder (İD)) yoğunluk.
Verici veya alıcının nispi emisyon yoğunluğundaki bir değişiklik rezonans enerji transferinin göstergesi olarak alınabilse de, geleneksel yaklaşım iki değerin oranını kullanmaktır. Ben(A)/Ben(D), bir FRET ölçüsü olarak. Oranın değeri, verici-alıcı çiftleri arasındaki ortalama mesafeye bağlıdır ve yol uzunluğu ve uyarıcı ışık huzmesi tarafından erişilen hacimdeki farklılıklara duyarsızdır. Moleküler çiftler arasındaki bağıl mesafede bir değişikliğe neden olan herhangi bir numune koşulu, verici ve alıcı emisyon oranında bir değişiklik üretir. Sonuç olarak, FRET, bir donör floroforunun tercihli olarak uyarılması ve enerji aktarımı nedeniyle söndürme ile üretilen donör floresansında bir azalmanın eşlik ettiği etkileşimli bir alıcı floroforun artan emisyonunun saptanmasıyla mikroskopta gözlemlenebilir. Yoğunluk izleme yaklaşımını kullanan FRET ölçümü, kararlı hal floresan rezonans enerji transferi görüntüleme.
Uygun verici ve alıcı problar, absorpsiyon ve emisyon spektral özelliklerine göre seçilir. Maksimum rezonans enerji transferi için, verici emisyon spektrumu, alıcının absorpsiyon spektrumu ile büyük ölçüde örtüşmelidir. Ek olarak, alıcı floroforun vericinin maksimum uyarımında minimum doğrudan uyarımı olmalı ve alıcı emisyonunun meydana geldiği dalga boyu bölgesinde verici ve alıcı arasında önemli emisyon örtüşmesi olmamalıdır. Uygulamada, bu gereksinimleri karşılayan donör-alıcı çiftlerini belirlemek zor olabilir. Durum, ticari olarak temin edilebilen floresan filtre setlerinin sadece istenen dalga boylarını geçirmede tamamen etkili olmaması ve tasarım geçiş bandının dışında küçük bir ışık yüzdesinin iletilebilmesi nedeniyle genellikle karmaşıktır. Çok iyi karakterize edilmiş ve kontrollü ifade sistemleri kullanılmadıkça, verici ve alıcı floroforların kesin konsantrasyonunun belirlenmesi zor olabilir. Otofloresan, ışıkla ağartma ve arka plan floresansı için ek düzeltmeler de gerekebilir.
Canlı bir hücre kültüründe hücre içi protein-protein ilişkisinin tipik bir araştırması, karmaşık bir dizi etkileşimden kaynaklanan hücresel ölümün fiziksel bir süreci olan apoptoz ile ilişkili olaylar için Şekil 8'de gösterilmektedir. Doğrudan olaylar zincirine dahil olan gen ürünleri, FRET tarafından spesifik ilişkileri araştırmak için aynı hücrede birlikte ekspresyon için floresan protein ailesinin uygun üyelerine (bu durumda BFP ve GFP) füzyon yoluyla etiketlenebilir. Apoptozla ilgili proteinler mitokondri içinde etkileşime girer ve programlanmış hücre ölümü ilerledikçe bağlanmada kademeli bir azalma gösterir. Bu nedenle, donör emisyonunun bir görüntüsü (Şekil 8(a)), yalnızca BFP etiketli proteinlerden gelen floresan içerirken, karşılık gelen alıcı emisyon profili (Şekil 9(b)) GFP ile etiketlenmiş proteinlerden kaynaklanan sinyalleri (ve bazı katkılardan) gösterir. donör emisyonu). Aşağıda açıklandığı gibi bir FRET filtresi (Şekil 8(c)), iki protein arasındaki rezonans enerji transferinden türetilen floresansı ortaya çıkarır.
Genel olarak floresan rezonans enerji transferi ölçümlerinin doğruluğunu potansiyel olarak etkileyebilecek faktörler arasında, birçoğu optik mikroskoba oldukça özeldir. Mikroskopi incelemelerinde birincil hedef, yüksek çözünürlüklü görüntüler elde etmektir ve bu, donör ve alıcının absorpsiyon ve emisyon dalga boylarını spektral olarak ayırt etmek için kullanılan optik filtrelerin kalitesine ve performansına özel dikkat gösterilmesini gerektirir. Sinyal-gürültü oranını en üst düzeye çıkarmak için (örneği veya araştırılan süreci zararlı bir şekilde etkilemeden), uyarma ışığına maruz kalmanın yoğunluğunu ve süresini, verici ve alıcı floroforların ve dedektörün konsantrasyonu ile dikkatli bir şekilde dengelemek gerekir. yeterlik. Verici-alıcı floroforların konsantrasyonu aşırıysa, FRET ölçümlerinin doğruluğunu etkileyen kendi kendine sönme meydana gelebilir. Fotoağartma, tüm floroforlarla ilgili bir sorundur ve donör-alıcı oranını etkileyerek floresan ölçümlerini değiştirebilir. Aşırı aydınlatma yoğunluğu, özellikle canlı hücreler veya dokular içeren örneklere de zarar verebilir.
olarak bilinen bir teknik donör ışıkla ağartma floresan rezonans enerji transferi (pbFRETFRET'i ölçmek için fotoağartma işleminden yararlanan ), genellikle sabit numunelerin çalışmasında uygulanır. Piksel-piksel analizine dayalı olarak, yöntem, floroforla konjuge monoklonal antikorlarla etiketlenmiş hücre yüzeyi proteinleri arasındaki yakınlık ilişkilerini ölçmek için uygulanmıştır. Photobleaching FRET, bir floroforun yalnızca uyarılmış bir duruma yükseltildiğinde fotohasara duyarlı olduğu teorisi üzerine kurulmuştur. İstatistiksel olarak, herhangi bir zamanda moleküllerin sadece küçük bir kısmı uyarılmış haldedir ve bu nedenle, daha uzun floresan ömürleri olan floroforların fotohasar görme olasılığı daha yüksektir ve daha yüksek bir ışıkla ağartma oranı sergiler.
Bu kavramı destekleyen deneysel kanıtlar, bir floroforun ışıkla ağartma süresinin, uyarılmış durum ömrü ile ters orantılı olarak değiştiğini göstermiştir. Rezonans enerji transferinin meydana gelmesi, donör molekülün floresan ömrünü kısaltır ve onu fotoağarmaya karşı etkin bir şekilde korur. pbFRET hesaplamaları, rezonans enerji aktarımının yokluğunda donör için ölçülene göre donör foto-ağartma oranının azalmasına dayanır. FRET çalışmalarında fotoağartma ölçümü nispeten uzun bir zaman aralığı gerektirir ve bu nedenle en çok, geçici verilerin önemli olmadığı ve fotoağartma kaynaklı hücre fonksiyonu üzerindeki etkinin bir sorun olmadığı sabit hücre numunelerine uygulanabilir. Bazı açılardan, donör ışıkla ağartma tekniği, duyarlılaştırılmış emisyon ölçümünden daha az karmaşıktır, ancak zaman sabitlerinin birden fazla bileşen içeren ışıkla ağartma eğrilerine uydurulması bazı ek zorluklar sunar.
Enerji transfer verimliliği ayrıca şu şekilde belirlenebilir: alıcı fotoağartma donör emisyonu söndürmedeki değişikliğin, alıcı molekülün seçici olarak ışıkla ağartılmasından önceki ve sonraki değerin karşılaştırılmasıyla ölçüldüğü teknikler. Alıcının çıkarılmasından önce ve sonra aynı numune bölgelerinde donör floresan yoğunluğundaki değişimin analizi, yalnızca tek bir numune hazırlama gerektirme avantajına sahiptir ve enerji transfer verimliliğini hem donör hem de alıcı floresansıyla doğrudan ilişkilendirir.
Mikroskopta floresan rezonans enerji transferinin doğru ölçümü, tüm potansiyel hata kaynaklarının telafisini gerektirir. Alıcı emisyon filtresi ile donör floresansının ve donör emisyon filtresi ile alıcı floresansının (çapraz geçiş veya spektral sızma nedeniyle) tespitini düzeltmek için basit bir teknik geliştirilmiştir. Yöntem ayrıca FRET'in donör ve alıcı floroforların konsantrasyonlarına bağımlılığını da düzeltir. Minimum spektral bilgi gerektiren ölçüm stratejisi, üç filtre setinin bir kombinasyonunu kullanır ve kolaylıkla uygulanabilir. Verici, FRET ve alıcı filtre setleri, üç spesifik sinyali izole etmek ve maksimize etmek için tasarlanmıştır: sırasıyla donör floresansı, FRET'e atfedilebilen alıcı floresanı ve doğrudan uyarılmış alıcı floresanı. Uygulamada, sadece donör, sadece alıcı ve hem donör hem de alıcı içeren üç farklı numune, üç filtre setinin her biri ile incelenir ve elde edilen veriler, çapraz geçişi ve donör-alıcı konsantrasyonlarındaki kontrolsüz varyasyonları düzeltmek için aritmetik olarak manipüle edilir.
Şekil 9'da, floresan rezonans enerji transferi deneylerinde nicel sonuçlar elde etmek için üstesinden gelinmesi gereken iki önemli problem olan çapraz geçiş (spektral geçiş) ve filtre karışmasının şematik gösterimleri verilmiştir. Çapraz geçiş veya geçiş, Şekil 9'daki alıcı emisyon girişim filtresinin bant geçiş bölgesi ile verici floresan emisyon spektrumunun bir örtüşmesi ile kendini gösterir ve verici emisyon sinyalinin (istenmeyen dalga boyları) emisyon filtresinden iletilmesiyle sonuçlanır. Buna karşılık, filtre karışması, seri olarak birbirine yerleştirilmiş iki filtrenin belirli bir aralığı üzerindeki minimum zayıflama (engelleme) seviyesini tanımlar ve floresan setleri için uyarma ve emisyon filtrelerini eşleştirirken önemlidir. Dikromatik aynalar genellikle floresan filtre kombinasyonlarının karışma değerlendirmesine dahil edilir. İki emisyon filtresi aynı anda ışık yoluna nadiren yerleştirilse de, spektrumlar her iki kavramı aynı anda göstermek için Şekil 9'da bir araya getirilmiştir. İki filtre spektrumunun (mavi ve kırmızı eğriler) girişim filtreleri tarafından ışık geçirgenliğini temsil ettiğine, donör emisyon eğrisinin (yeşil) ise dalga boyuna karşı yoğunluğun bir grafiği olduğuna dikkat edin.
Potansiyel olarak önemli hatalara yol açabilecek ek faktörler, sabit durum FRET ölçüm teknikleri kullanıldığında düzeltme gerektirir. Ayrıca, verici ve alıcı florofor konsantrasyonlarının dikkatli kontrolü arzu edilir. Florofor konsantrasyonu belirlemeleri, uygulanmasıyla kısmen önlenebilir. zaman çözümlü donör konsantrasyonları hakkında kesin bir bilgi olmadan ortalama ömürleri elde etmek için bir yöntem sağlayan floresan ölçümleri. Teknik, donör-alıcı ayırma mesafelerinin nicel olarak belirlenmesini sağlar ve alıcının varlığında ve yokluğunda donör yaşam süresinin ölçümlerine dayanır. Zamanın bir fonksiyonu olarak floresan yoğunluğu azalmasının ölçülmesi, uyarılmış durum molekülünün emisyon dinamiklerini aydınlatır ve sonuç olarak, donör-alıcı etkileşiminin doğası hakkında daha ayrıntılı bilgi elde edilebilir. Yoğunluk azalmasının grafik çizimleri, sabit durum teknikleri kullanıldığında çözülmeyen floresan bozunma sürecinin zaman ortalamalı ayrıntılarını gösterir (bkz. Şekil 10(a)). Ortalama ömür için aynı değeri gösteren ölçümler, absorpsiyona normalize edilmiş sabit durum yoğunluğu olarak kaydedildiğinde, ilgili moleküller arası süreçlerdeki farklılıkları gösteren, zamanla çözümlenmiş veri grafiklerinde önemli ölçüde farklı bozunma eğrisi şekillerine karşılık gelebilir.
Floresan ömrü (τ) bir floroforun temel durumuna dönmeden önce bir molekülün uyarılmış durumda var olduğu karakteristik zamandır. Kısa bir uyarı ışığı darbesinin ardından basitleştirilmiş tek üstel bir biçimde floresan bozunmasını temsil eden, zamanın bir fonksiyonu olarak floresan yoğunluğu (T) denklem ile verilir:
nerede ben(0) uyarma ışık darbesinden hemen sonraki ilk floresan emisyon yoğunluğudur ve Bilişim Teknoloji) zamanda ölçülen floresan yoğunluğudur T. Floresan ömrü (τ) yoğunluğun azalması için gereken süre olarak tanımlanır. 1/e başlangıç değerinin (yaklaşık yüzde 37'si) ben(0) Şekil 10(a)) ve uyarılmış durumdan temel duruma floresan bozunması için hız sabitinin tersidir.
Kararlı durum FRET ölçümlerine karşı zamanla çözümlenmiş birincil genel avantajı, donör-alıcı ayırma mesafelerinin daha büyük nicel doğrulukla haritalanabilmesidir. Bu kısmen, floresan ömürlerinin yerel yoğunluğa veya konsantrasyona bağlı olmaması ve floroforların ışıkla ağartılmasından büyük ölçüde etkilenmemesi nedeniyle sonuçlanır. Bununla birlikte, floresans ömürleri florofor ortamına oldukça duyarlıdır ve benzer spektrumlara sahip moleküller bile farklı çevresel koşullar altında farklı ömürler gösterebilir. Saçılma, florofor yaşam sürelerini etkilemediğinden, yaşam boyu varyasyon ölçümleri, özellikle yerel moleküler süreçlerle ilgili bilgiler sağlayabilir.
Bir floroforun ömrü, hidrofobiklik, oksijen konsantrasyonu, diğer ortam bileşenlerinin iyonik gücü, makromoleküllere bağlanma ve uyarılmış durumu azaltabilen alıcı moleküllere yakınlık gibi faktörler dahil olmak üzere yerel mikro-ortamdaki çok sayıda değişken tarafından modifikasyona tabidir. rezonans enerji transferi. Ömür boyu ölçümlerin moleküler etkileşimlerin mutlak göstergeleri olarak hizmet edebilmesi ve florofor konsantrasyonundan bağımsız olması önemli bir pratik avantajdır.
Floresan ömürlerini ölçmek için yaygın olarak kullanılan iki genel teknik, şu şekilde kategorize edilir: zaman alanı (darbeli, bkz. Şekil 10(a)) ve frekans alanı (aynı zamanda faz çözümlü Şekil 10(b)) yöntemleri. Zaman alanlı ömür ölçümleri, darbeli uyarma ışık kaynaklarını kullanır ve floresan ömrü, doğrudan emisyon sinyalinin ölçülmesi veya foton sayma tespiti ile elde edilir. Frekans alanı yaklaşımı, uyarım ışık kaynağının (darbeli veya modüle edilmiş lazer sistemlerinden elde edilen) sinüzoidal modülasyonunu kullanır ve ömürler, floresan emisyon sinyalinin faz kayması ve demodülasyon derinliğinden belirlenir.Floresan ömür boyu görüntülemeye yönelik bu yaklaşımların her birinin belirli avantajları ve dezavantajları vardır ve her ikisi de geleneksel geniş alan, eş odaklı ve multifoton mikroskopisine yaygın olarak uygulanmıştır.
Şekil 10'da gösterilenler, floresan ömürlerinin belirlenmesi için zaman alanı ve frekans alanı tekniklerini temsil eden şematik diyagramlardır. Zaman alanı yaklaşımında (Şekil 10(a)), numune, uyarılmış türlerin ömründen çok daha kısa bir süreye sahip kısa bir lazer ışığı darbesi ile uyarılır ve üstel bozunma profili, zamanın bir fonksiyonu olarak ölçülür. Floresan bozunması genellikle tek bir florofor için tek üstel bir işlevdir, ancak uyarılmış durum çevrede çok sayıda gevşeme yoluna sahipse çok daha karmaşık bir karakter gösterebilir. Akusto-optik modülatöre bağlı sürekli dalga lazerinden sinüsoidal olarak modüle edilmiş ışık, frekans alanı deneylerinde floroforu uyarmak için kullanılır (Şekil 10(b)). Ortaya çıkan flüoresans emisyonu, uyarma ile aynı frekansta sinüzoidal olarak modüle edilir, ancak buna modülasyon derinliğinde bir faz kayması ve azalma eşlik eder. Tek bir üstel bozulma durumunda, floresan ömrü, faz kaymasının derecesi belirlenerek hesaplanabilir (φ) veya modülasyon oranı (m), Şekil 10(b)'de sunulan denklemleri kullanarak. İki değer aynıysa, floresan bozunumu gerçekten tek bir üstel fonksiyondan oluşur. Birden fazla floresan türü mevcut olduğunda (veya tek bir florofor karmaşık bir ortamla karşılaştığında), faz kayması ve modülasyon ömürleri geniş bir frekans aralığında değerlendirilmelidir.
Floresan ömrünü ölçmek için zaman alanlı teknik, esas olarak tek foton sayımına dayanır ve her uyarma darbesi tarafından üretilen fotonların yaklaşık yüzde 100'ünü toplamak için yeterli zamansal çözünürlüğe sahip bir algılama sistemi gerektirir. Faz çözümlemeli tekniklerin uygulanması nispeten daha az zahmetli olsa da, genellikle foton sayma yaklaşımı kadar hassas değildirler. Karmaşık multiflorofor ömürlerini çözmek için faz modülasyonu kullanıldığında, zarar verici uyarma aydınlatmasına uzun maruz kalma süreleri bazı örnekler için aşırı olabilir ve ayrıca canlı hücre süreçleri için yeterli zamansal çözünürlük sağlamayabilir. Tercih edilen teknik, hem araştırmadan istenen bilgilere hem de çalışılan numunenin türüne bağlıdır.
Floresan yaşam süresi ölçümlerinin FRET'in hassas bir göstergesi olduğu kanıtlanmıştır ve yaşam boyu ölçümlerinin canlı örneklerde kontrol edilmesi zor olan konsantrasyon ve ışık yolu uzunluğu gibi faktörlerden bağımsız olması nedeniyle canlı hücre çalışmalarında belirli avantajlara sahiptir. Floresan ömür ölçümü ile FRET çalışmaları gerçekleştirmenin birincil avantajı, benzer emisyon spektrumlarına sahip donör-alıcı çiftleri arasında bile enerji transferini ayırt etmenin mümkün olması gerçeğinde yatmaktadır. Floresans ömürleri doğrudan ölçüldüğünde (kararlı durum değerlerinin kullanılmasının aksine), donör veya alıcı floroforların fotodestrüksiyonu olmadan FRET'in belirlenmesi mümkündür. FRET, alıcıya enerji transferi yoluyla verici molekülün floresan ömrünü azalttığından, alıcının varlığında donör ömrünün doğrudan bir karşılaştırması (τ(DA)) kabul edenin yokluğunda buna (τ(D)), bir FRET verimlilik değerinin hesaplanmasını sağlar (E(T)) her görüntü pikseli için.
Tekniğe bağlı olarak, floresan ömrü ölçümleri, örneğin yüksek frekanslı tekrarlayan uyarı ışığı darbelerine veya sürekli sinüzoidal olarak modüle edilmiş ışığa maruz bırakılmasını gerektirir. Canlı hücrelerle yapılan çalışmalarda yüksek yoğunluklu aydınlatmanın etkisi her zaman değerlendirilmelidir. Yöntemden bağımsız olarak, alıcısız vericinin referans ömrü, verici-alıcı ölçümündekilerle aynı deneysel koşullar altında belirlenmelidir. Bunu tek bir numune ile gerçekleştirmenin bir yolu, enerji transferi deneyini takiben alıcının foto-ağartma ile yok edilmesinden sonra sadece donör ömrünü ölçmektir.
Biyolojik araştırmalarda, floresan rezonans enerji transferinin en yaygın uygulamaları, bir makromolekül (genellikle bir protein veya nükleik asit) üzerindeki iki bölge arasındaki mesafelerin ölçülmesi veya incelenmesidir. canlıda biyomoleküler varlıklar arasındaki etkileşim. Proteinler, donör ve alıcı olarak hizmet etmek için sentetik florokromlar veya immünofloresan floroforlarla etiketlenebilir, ancak floresan protein genetiğindeki ilerlemeler, araştırmacıların, farklı spektral özelliklere sahip çeşitli biyolojik floroforlarla belirli hedef proteinleri etiketlemesine olanak tanır. Pek çok durumda, amino asit triptofan, bir alıcı olarak hizmet veren herhangi bir sayıda dışsal sondaya bağlanabilen bir içsel donör floroforu olarak kullanılır.
Makromoleküller tek bir verici ve alıcı ile etiketlenirse ve verici uyarılmış durum ömrü boyunca iki florokrom arasındaki mesafe değişmezse, o zaman problar arasındaki mesafe, tartışıldığı gibi, enerji transferinin verimliliğinden kararlı durum ölçümleri yoluyla belirlenebilir. üstünde. Verici ve alıcı arasındaki mesafenin protein düzenekleri, membranlar, tek sarmallı nükleik asitler veya katlanmamış proteinler gibi bir dağılım eğrisi etrafında dalgalandığı durumlarda (Şekil 11'de sunulan senaryolara bakın), FRET yine de fenomenler, ancak zaman çözümlü ömür ölçümleri tercih edilir. Şekil 11'de, konformasyonel değişiklikler, ayrışma veya hidroliz, zar benzeri lipid veziküllerin füzyonu ve ligand-reseptör etkileşimleri dahil olmak üzere her iki duruma giren çeşitli biyolojik uygulamalar gösterilmektedir.
Optik mikroskopta floresan rezonans enerji transferinin ölçümü için çeşitli yöntemler mevcut olmasına rağmen, hiçbiri tamamen dezavantajsız değildir. Bazı teknikler daha ayrıntılı ve pahalı enstrümantasyon gerektirirken, diğerleri dikkatle doğrulanması gereken varsayımlara dayanmaktadır. Bazı yaklaşımlar, sabit numuneler için uygundur, ancak canlı hücre sistemlerine uygulanamazken, diğer yöntemlerin önemli düzeltici hesaplamaları veya veri analizi algoritmalarını içermesi gerekir. Bununla birlikte, FRET analizinin biyolojik uygulamaların faydası ve kapsamında daha fazla gelişme için büyük umut vaat ettiği kesindir. Enstrümantasyonda son yıllarda, özellikle zamana bağlı tekniklerle ilgili olarak çarpıcı gelişmeler meydana geldi.
Geçmişte son derece zor bir şekilde gerçekleştirilen floresan ömrü ölçümleri, artık olgun pikosaniye ve nanosaniye teknolojileri tarafından desteklenmektedir. Floresan prob geliştirmedeki ilerlemeler, biyolojik hedeflere yeni bağlanma mekanizmalarına sahip daha küçük ve daha kararlı moleküller üretti. Floroforlar ayrıca çok çeşitli içsel uyarılmış durum yaşamları ile geliştirilmiştir ve floresan proteinlerin genetik varyasyonlarında daha büyük bir çeşitliliğin geliştirilmesi için önemli bir çaba sarf edilmektedir. Birçoğu önceki floroforlardan daha küçük olan ve daha düşük ayırma mesafelerinde moleküler etkileşimlerin değerlendirilmesine izin veren tamamen yeni floresan malzeme sınıfları, etiketlemenin çok yönlülüğünü geliştirmeyi vaat ediyor ve FRET tekniğinin yeni uygulamalarına yol açıyor.
Katkıda Bulunan Yazarlar
Brian Herman ve Victoria E. Centonze Frohlich - Hücresel ve Yapısal Biyoloji Bölümü, Teksas Sağlık Bilimleri Merkezi Üniversitesi, 7703 Floyd Curl Drive, San Antonio, Teksas 78229.
Joseph R. Lakowicz - Floresan Spektroskopi Merkezi, Biyokimya ve Moleküler Biyoloji Bölümü, Maryland Üniversitesi ve Maryland Üniversitesi Biyoteknoloji Enstitüsü (UMBI), 725 West Lombard Street, Baltimore, Maryland 21201.
Thomas J.Fellers ve Michael W. Davidson - Ulusal Yüksek Manyetik Alan Laboratuvarı, 1800 Doğu Paul Dirac Dr., Florida Eyalet Üniversitesi, Tallahassee, Florida, 32310.
Hoechst kırmızı ve mavi spektrumları - kırmızı emisyon bize ne söylüyor? - Biyoloji
Uygulamaya Göre Gözat
Florofor ile göz atın
Arka plan
Bir lüminesans biçimi olan floresan, ışığı veya elektromanyetik radyasyonu emen bir madde tarafından üretilen ışığın emisyonudur. Floresan moleküller, absorbe edilen radyasyona tepki olarak daha uzun dalga boyunda ve daha düşük enerjide ışığı yeniden yayar. Özellikleri nedeniyle, floresan teknolojisi, floresan problar, boyalar ve diğer biyoaktif reaktifler kullanılarak floresan görüntüleme ve spektroskopide yaygın olarak kullanılmaktadır.
Floroforlar, floresan problar oluşturmak için tek başına veya moleküllere bağlı olarak kullanılan floresan bileşiklerdir. Floroforlar genellikle dört tip olarak sınıflandırılır: organik boyalar, floresan proteinler, kuantum noktaları (lüminesan nanokristaller) ve etiketsiz görüntüleme için uygun biyolojik yapılar. Çoğu florofor, düşük moleküler ağırlıklı (0,2-1 kDa) küçük moleküllü boyalardır ve bazıları GFP (yeşil), YFP (sarı) ve RFP (kırmızı) gibi nispeten büyük proteinlerdir. Floroforların geniş seçimi, boyut, biyouyumluluk, uyarma ve emisyon dalga boyu, yoğunluk, kuantum verimi, floresan ömrü ve maddelerle etkileşim gibi fiziksel özelliklerine bağlı olarak yaşam bilimleri ve temel araştırmalarda geniş bir uygulama yelpazesi sunar.
Şekil 1. Floresan moleküllerle etiketlenmiş lösemi hücreleri
Floresan problar, biyolojik moleküllerle kovalent olarak konjuge edilmiş tek floroforlar veya floroforlardır. BOC Sciences web sitesinde aşağıdaki gibi çeşitli floresan prob türleri sunulmaktadır:
Hücre ve Organel Lekeleri: Floresans, hücre ve organel yapısının görüntülenmesi ve hücre takibi için yeni bir yaklaşım getirdi. 238 amino asitlik bir protein olan Yeşil flüoresan proteini, ilk olarak 1961'de denizanası Aequorea Victoria'dan izole edildi ve flüoresan proteinlerin hücre biyolojisindeki uygulamalarını güçlendirdi. Kısa bir süre sonra, diğer türlerden daha fazla floresan protein keşfedildi ve izole edildi. Floresan protein teknolojisinin hızlı gelişimi üzerine, canlı hücrelerde etiketlenmiş biyomoleküllerin basit takibinin ötesinde geniş bir uygulama yelpazesi için genetik olarak kodlanmış floroforun kullanımı son zamanlarda tam olarak takdir edilmiştir.
Diğer protein olmayan floresan problar, hücrelerin ve hücre bileşenlerinin araştırılması için canlı veya sabit hücrelerdeki zarları, organelleri, nükleik asitleri ve proteinleri boyayabilir. Hücre boyama tekniği mikroskopi, akış sitometrisinde kullanılmaktadır ve kanserlerden bakteriyel enfeksiyonlara kadar hastalık teşhisindeki uygulama ilerlemektedir. Fungus Epicoccum nigrum'dan metabolize edilen uzun stokes vardiyalı bir floresan boya olan Epicocconone, insan kolon kanseri hücre hattı HCT-116'yı boyamak için rapor edildi ve 590 nm'de maksimum emisyon zirvesi gösterdi. Epicocconone, boyama için kullanılanlara benzer konsantrasyonlarda memeli hücrelerinin büyümesini etkilemediği için canlı hücre görüntüleme için uygundur.
DNA Lekeleri: DNA lekeleri, araştırmacıların DNA fragmanını ve miktarını görselleştirmesini sağlayan aşırı duyarlı boyalardır. Siyanin boyaları, fenantridinler ve akridinler, indoller ve imidazoller ve diğer bazı nükleik asit boyaları genellikle DNA boyamalarına dahil edilir. Akış sitometrisi ve mikroskopide Cy3 ve Cy5, DNA'yı etiketlemek için bir N-hidroksisüksinimidil ester (NHS-ester) reaktif grubu eklenmiş en popüler siyanin boyalarıdır. Ayrıca TOTO ailesi, TO-PRO ailesi, SYTO ailesi ve SYBR ailesi boyaları, farklı amaçlar için optimize edilmiş siyanin boyalarıdır. SYBR Green I, 1000 kat floresan yayan bir kompleks oluşturmak için tercihen çift sarmallı DNA'ya bağlanır. SYBR Green I, PCR, jel elektroforezi, akış sitometrisi ve mikroskopide DNA tespiti için kullanılmıştır.
Hoechst boyaları, 350 nm'de UV ışığı ve 460 nm'de floresan mavi ışıkla uyarılan bisbenzimidlerdir. Nispeten büyük Stokes kayması, çok renkli etiketleme deneyleri için uygun Hoechst boyalarını mümkün kılar. Hoechst boyaları, AT açısından zengin çift sarmallı DNA'nın küçük oluğuna seçici olarak bağlanma yoluyla DNA'yı boyar. Hoechst 33258, Hoechst 33342 ve Hoechst 34580 bu ailedeki ilgili lekelerdir.
Floresan Enzim Substratları: Birden fazla enzim için florojenik substratlar, enzimatik aktivite deneylerinde kullanılır. Genellikle bir floresan bileşik ve spesifik bir enzim substratından oluşurlar. Enzimatik bölünme üzerine, floresan substrat floresan parçayı serbest bırakır ve floresan verir; bunun oranları veya yoğunluğu enzimatik aktiviteyi ölçmek için kullanılabilir. Canlı hücre enzim deneyleri için geliştirilen bazı substratlar, çeşitli enzimlerin fizyolojik işlevlerini yerinde araştırmayı sağlar.
İyon Göstergeleri ve Sensörler: İnsanlardaki kalsiyum, sodyum, potasyum, çinko ve diğer metal iyonlarının konsantrasyonları, normal biyolojik işlevlerini garanti altına almak için uygun bir aralıkta tutulmalıdır. İyon göstergeleri genellikle hem membran geçirgen olmayan tuz formlarında hem de membran geçirgen AM ester formlarında mevcuttur. Hücrelere girişte, iyon göstergeleri hidroliz yoluyla salınır ve iyonlara bağlanır. Kalsiyum göstergeleri, kimyasal göstergeler ve genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri olarak sınıflandırılır. Kimyasal göstergeler, indo-1, fura-2, fluo-3, fluo-4 gibi kalsiyum şelatör BAPTA yapısına bağlı floroforlardır. Kalsiyum iyonlarının bağlanmasından elde edilen floresan kuantum verimi, uyarma/emisyon dalga boyu ve spektral kayma, bunların miktar tayini için kullanılır. Genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri, yeşil floresan proteinden türetilen floresan proteinlerdir.
Porfirin analogları, çevresel sistemleri ve biyolojik süreçleri tespit etmek için metal iyon veya anyon kemosensörleri olarak tasarlanmıştır. Sensör çerçevesi 2 tipte sınıflandırılabilir: Tip 1, bir raportör ve bir tanıma ünitesinden oluşur. Tanıma ünitesi, hedef analit ile etkileşime girecek şekilde dahil edildiğinde, raportörden bir fotofiziksel sinyal rapor edilecektir. Tip 2, aynı anda hem muhasebeleştirme hem de raporlama birimi olarak hareket eden tek bir bileşenden oluşur. Çeşitli fotofiziksel süreçlere bağlı olarak farklı tipte kemosensörler geliştirilmiştir.
pH Göstergeleri: Hücre, doku ve enzim aktiviteleri için hücre içi pH büyük önem taşır ve anormal pH değerleri genellikle kanser gibi bazı hastalıklarda görülebilen uygun olmayan hücre fonksiyonu ve büyümesinde rol oynar. Hücre içi pH ölçümü, hücrelerdeki fizyolojik süreçleri incelemek için kritik bilgiler sağlar. Niteliksel ölçüm, optik yol uzunluğu, sıcaklık, değişen uyarma yoğunlukları ve çeşitli emisyon toplama verimlerinden kolayca etkilendiğinden, pH'ı saptamak için oransal spektroskopi kullanılır. Ölçüm yöntemi, en az iki uyarma veya emisyon dalga boyu için analite karşı diferansiyel olarak hassas olan floresan probları gerektirir. BCECF, canlı hücrelerde en yaygın olarak kullanılan rasyometrik uyarma pH göstergesidir.
YORUM
Arkaplan bilgisi
Ki-67'nin akış sitometrik analizi, lenfoma hücre hatlarının büyüme fraksiyonunu belirlemek için tarif edildi (Schwarting ve diğerleri, 1986) ve ayrıca birçok kanser hücresi ve hematopoietik kök hücre üzerinde bir hücre döngüsü ve hücre proliferasyon analizine uygulandı. Pyronin Y ilk olarak 1889'da sentezlendi ve metil yeşili ile kombinasyon halinde (DNA boyaması için) RNA'yı boyamak için uygun bir histolojik/sitokimyasal boya olarak kullanıldı. Daha sonra, bozulmamış hücrelerdeki DNA ve RNA içeriğini tahmin etmek için akış sitometrik analizi için Pyronin Y ve Hoechst 33342'nin çift boyaması geliştirildi (Shapiro, 1981). Bu yöntemler, hücre döngüsü durumunu analiz etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır.
Bu tekniklerle birlikte, hücre döngüsü durumunun kinetiği, yeni sentezlenmiş DNA içeriğinin ve hücresel metabolizma parametrelerinin ölçülmesine dayanan hücre proliferasyon deneyleriyle değerlendirilebilir. Hücre çoğalmasının akış sitometrik analizi için, çoğalan hücrelerdeki genomik DNA, hücre döngüsünün S fazı sırasında hücrelerin timidin analoğu, 5'-bromo-2'-deoksiüridin (BrdU)'ya maruz bırakılmasıyla etiketlenebilir. Dahil edilen BrdU, hücreleri her fazın hücre döngüsüne göre ayırmak için floresanlı anti-BrdU antikorları ve floresan DNA boyası (örn. G2/M evreleri) (Rothaeusler ve Baumgarth, 2007). BrdU birleştirme yönteminin bir dezavantajı, eklenen BrdU'ya antikor penetrasyonu için hem membran geçirgenleştirme hem de sert DNA denatürasyon işlemlerinin gerekli olmasıdır. BrdU yönteminin sınırlamalarını aşmak için BrdU'ya alternatif olarak 5-etinil-2'-deoksiüridin (EdU) geliştirilmiştir (Cappella ve diğerleri, 2008 Cavanagh ve diğerleri, 2011 Salic ve Mitchison, 2008). Hücre proliferasyonu sırasında EdU muamelesinden sonra, EdU'nun dahil edilmesi daha sonra bir bakır (I) katalizli reaksiyon yoluyla bir floresan azit molekülü tarafından tespit edilebilir, bu da EdU ve floresan boya arasında stabil bir triazol halkası oluşumuyla sonuçlanır ("Klik reaksiyonu" olarak adlandırılır). Küçük boyutlu floresan boya hücreye kolayca nüfuz ettiğinden ve sağlam DNA çift sarmalında bile EdU ile kolayca reaksiyona girdiğinden, EdU yöntemi oldukça hassastır ve klasik bir BrdU birleştirme yönteminden çok daha hızlıdır. Ayrıca, EdU birleştirme tahlili, birçok uygulama için çok faydalı olan multipleks hücre yüzeyi/hücre içi boyama ile birleştirilebilir (Cappella ve diğerleri, 2008 Diermeier-Daucher ve Brockhoff, 2010). Click reaksiyonunun orijinal versiyonu, yüksek konsantrasyonda bakır ve reaktif oksijen türleri tarafından kolayca zarar gören GFP ve R-PE gibi bazı floroforların multipleks tespiti için kullanılamaz. Son zamanlarda, Click reaksiyonunun kimyasal modifikasyonu, GFP ve R-PE floresansının korunmasını ve parlak bir EdU sinyali elde edilmesini sağlar. Bu, en az üç farklı floroforu kapsayacak şekilde genişletildi (Alexa Fluor'sx000ae 488, Alexa Fluor'sx000ae 647 ve Pacific Blue's 02122, aşağıdaki İNTERNET KAYNAKLARINA bakın).
Membran geçirgen floresan boyaların kullanıldığı boya seyreltme deneyleri, şu anda hücre çoğalmasını da değerlendirmek için kullanılmaktadır. Karboksifloresan süksinimidil ester (CFSE veya CFDA-SE, karboksifloresan diasetat süksinimidil ester), sitoplazmaya giren ve hücre içi amino asitlere kovalent olarak bağlanan yaygın olarak kullanılan floresan boyalardan biridir (Lyons, 2000 Lyons ve diğerleri, 2013). Bu reaksiyon, orijinal hücre içinde floresan boyanın aşırı uzun süreli tutulmasıyla sonuçlandığından, başlangıçta bağışıklık hücrelerini izlemek için kullanıldı. Hücrelerin homojen hücre boyutuna sahip olduğunu ve simetrik bölünmeye uğradığını varsayarsak, her yavru hücre, ana hücre hacminin yarısına ve hücresel bileşenlerin yanı sıra etiketli CFSE boyalarına sahiptir. Bu nedenle, hızlı hücre proliferasyonlarından sonra nesil sayısını tahmin etmek için CFSE etiketlemesi uygulanabilir. Genellikle, CFSE boyası akış sitometrisi ile 6-8 nesil boyunca izlenebilir. CFSE boyasına benzer şekilde, boya seyreltme proliferasyon tahlili için başka floroforlar, geniş bir uyarma/emisyon spektrumu aralığını kapsamak üzere geliştirilmiştir (Tablo 2).Bu floresan boyalar, GFP türevleri veya FITC veya benzer floresan konjuge antikorların kullanıldığı çok renkli uygulamalar için daha uygundur. Ayrıca, bazı seyreltme boyaları, hücre proliferasyonu sırasında 10 jenerasyona kadar tespit edilebilen hücrelerin daha az doğal otofloresansa sahip olduğu kanallarda yayılır.
Tablo 2
Boya seyreltme proliferasyon testi için florofor listeleri
|Ticari ad||Eskimaksimum||emmaksimum||Eski. Lazer||Üretici firma|
|CFSE||495||519||488 nm||Çeşitli|
|CellTrace TM Menekşe||405||450||405 nm||Yaşam Teknolojileri|
|BD HorizonTM Mor Hücre |
Proliferasyon Boyası (VPD450)
|404||448||405 nm||BD Biosciences|
|Hücre Proliferasyon Boyası eFluor'sx000ae450||405||450||405 nm||eBiyobilim|
|CytoTrack TM Mavi||403||454||405 nm||BIO-RAD|
|Oregon Green 488 karboksilik asit |
diasetat, SE (karboksi-DFFDA SE)
|496||524||488 nm||Yaşam Teknolojileri|
|SNARF-1 karboksilik asit, asetat, SE||514||586||488 nm||Yaşam Teknolojileri|
|CytoTrack TM Yeşil||511||525||488 nm||BIO-RAD|
|CytoTrack TM Sarı||542||556||532 nm||BIO-RAD|
|CellTrace TM Uzak Kırmızı DDAO-SE||647||657||633 nm||Yaşam Teknolojileri|
|Hücre Proliferasyon Boyası eFluor||647||670||633 nm||eBiyobilim|
|CytoTrack TM Kırmızı||628||643||633 nm veya 640 nm||BIO-RAD|
Kritik Parametreler
Uygun hücre yoğunluğu
Hücre yoğunluğu optimize edilmelidir çünkü birleşik kültürler, hücre döngüsünün G0/G1 durmasına yol açan temas inhibisyonu yoluyla büyümenin durmasına neden olabilir. Aşırı konfluent aynı zamanda besin mevcudiyetinin yanı sıra ortam asitliğini de etkiler ve bu da deneysel sonuçları bozabilir. Genellikle hücreler, üstel büyümenin zaman penceresi (genellikle 50
Antikor titrasyonu ve floresan DNA boya konsantrasyonu
İlk kullanım için, sinyal pozitif popülasyonların tespitini en üst düzeye çıkarmak için Ki-67 veya yüzey antijenine karşı antikorların titre edilmesi gerekir (genellikle akış sitometrisi için 1:500-1:50). Floresan DNA boya konsantrasyonları, ampirik olarak belirlenmesi gereken hücre hatları ve/veya spesifik koşullar arasında değişiklik gösterebilir.
Pyronin Y konsantrasyonunun belirlenmesi
Uygun PY konsantrasyonu kritiktir. Düşük PY konsantrasyonu, gerçek RNA seviyesi ile PY floresansı arasında stokiyometrik korelasyon sağlamaz. Yüksek PY konsantrasyonu ayrıca PY floresansına müdahale eden PY-nükleik asit kompleksinin yoğunlaşmasına (çökelmesine) neden olur. Böylece optimal PY konsantrasyonu hücre hattı, hücre yoğunluğu ve durumu arasında değişiklik gösterecektir. Genellikle ilk kullanım için titrasyon gerekir (1 μg/ml'den 5 μg/ml'ye kadar).
Floresan protein analizi
TEMEL PROTOKOL 1 veya 2'yi GFP ve RFP gibi floresan proteinlerle kombinasyon halinde kullanmak için, PFA fiksasyonu ve ardından saponin geçirgenliği bu proteinlerin yapısının korunmasına yardımcı olduğundan ALTERNATİF PROTOKOL 1'i kullanmak en iyisidir. TEMEL PROTOKOL 1'deki değişikliklerin, GFP ve FITC spektrumları örtüştüğü için yapılması gerekebilir. Bu nedenle, Ki-67'yi tespit etmek için örtüşmeyen başka bir sonda düşünün. Bazı RFP türevleri de PI ile örtüşür ve bazı durumlarda alternatif DNA probları kullanılmalıdır.
Sorun giderme
Zayıf pozitif sinyal veya yüksek arka plan floresansı
Uygun lazer ve filtre kombinasyonlarını kontrol edin. Antikorların ve floresan DNA/RNA boyalarının konsantrasyonunu ve kuluçka süresini ayarlayın. Yüksek arka plan floresansı için FACS tamponundaki FBS/BSA konsantrasyonunu artırın. Bazı durumlarda (Örneğin., ALTERNATİF PROTOKOL 1), arka plan sinyallerini azaltmak için PFA konsantrasyonlarının ve inkübasyon sürelerinin ayarlanması gerekebilir. Yüzey boyama açısından sinyalin zayıf olduğu veya mevcut olmadığı durumlarda, konjuge antikor fiksasyona duyarlıysa üreticinin talimatlarını kontrol edin (örneğin, paraformaldehite uzun süreli maruz kalma, APC-Cy𡈧, PE gibi bazı floroforların emisyon spektrumlarını etkiler). -Cy𡈧).
Fiksasyon/yıkama işlemi sırasında hücre kümelenmesi ve yoğun hücre kaybı
Uygun olmayan fiksasyon prosedürü hücre kümelenmesine ve önemli hücre kaybına neden olabilir. Bunu önlemek için, bir Pasteur pipeti kullanarak hücre süspansiyonunu doğrudan soğuk etanole enjekte edin ve hemen iyice karıştırın. Alternatif olarak, %4 paraformaldehit gibi alkolsüz fiksatifler kullanın (bkz. ALTERNATİF PROTOKOL 1). Boyanmış numune, analizden önce bir hücre süzgecinden geçirilmelidir.
DNA hücre döngüsü probları için Yüksek Varyasyon Katsayısı (CV) veya geniş tepe noktaları
Numunenin en iyi şekilde sorgulanmasını sağlamak için numunelerin mümkün olan en düşük numune basıncı ayarında çalıştırıldığından emin olun. Numuneyi akış sitometresinin doğrusal ayarında/aralığında almak da önemlidir. Ek olarak, uygun hücre ve boya konsantrasyonu, daha iyi CV'ler veren ve numuneler arasındaki varyasyonu azaltan tutarlı histogramlar için kritik öneme sahiptir.
Beklenen Sonuçlar
G0 hücrelerinin Ki-67 ekspresyon seviyesindeki (Şekil 1A) ve RNA içeriğindeki (Şekil 1B) farklılıklar temelinde, Temel Protokol 1 ve 2, diğer çoğalan hücrelerden (G1, S, G2/M aşamaları). Genel olarak, G0 hücreleri daha düşük Ki-67 ve RNA seviyelerine sahiptir, dolayısıyla bu hücreler diğer çoğalan hücrelerden ayırt edilebilir. Çoğalan hücrelerin hücre döngüsü dağılımını tam olarak ölçmek için ModFit LT (Verity Software) ve MultiCycle AV (Pheonix Flow Systems) gibi uygun yazılımlar kullanılabilir (Darzynkiewicz ve Huang, 2004).
Ki-67/DNA ve DNA/RNA'nın farklı boyanmasıyla hücre döngüsü durumunun analizi. HeLa hücreleri sabitlendi ve ardından BASIC PROTOKOL 1 ve 2'ye göre Ki-67-FITC ve PI (A) veya Hoechst 33342 ve Pyronin Y (B) ile boyandı.
Önceki çalışmalar, hücrelerin küçük bir bölümünün G2/M hücrelerinde Ki-67 seviyesinde önemli bir artış gösterdiğini göstermiştir (Şekil 1A, yıldız işareti) (Landberg ve diğerleri, 1990). Bu hücreler erken mitotik hücreler olarak kabul edildi, ancak bu henüz kesin olarak kurulmamıştır. M fazı hücrelerini daha fazla ayırmak için Cyclins, MPM-2 ve fosfo-Ser10-histon H3 (M fazını saptamak için) gibi diğer belirteçlerin birleştirilmesi gerekir (Juan ve Darzynkiewicz, 2001 Landberg ve diğerleri, 1990 Vignon ve diğerleri., 2013).
Zaman Hususları
Ki-67'nin hazırlanması ve boyanması ve floresan DNA boyası boyaması 4 saat sürmelidir. Pyronin Y ve Hoechst 33342'nin boyanması 3 saat sürecektir. Akış sitometrisi yoluyla numunelerin analizi, konsantrasyonlara bağlı olarak numune başına 1 ila 10 dakika sürer. Toplam süre, toplam numune sayılarına bağlıdır.