Summary
Gen silme ve protein aşırı ekspresyonu proteinlerin işlevleri çalışmak için sık kullanılan yöntemlerdir. Bu makalede, bir nüfus protein konsantrasyonu fonksiyonu ve tek hücreli düzeylerde fenotip gelişimi analiz için bir protokol
Abstract
Gen silme ve protein aşırı ekspresyonu proteinlerin işlevleri çalışmak için sık kullanılan yöntemlerdir. Bu makalede, bir nüfus protein konsantrasyonu fonksiyonu ve tek hücreli düzeylerde fenotip gelişimi analiz için bir protokol
Protocol
A. Hücre Kültürü ve Protein İndüksiyon
Bu bölümde, hücre kültürü, maya hücreleri bir ayarlanabilir organizatörü protein ifade indüksiyon takip koşulları, hücre döngüsü Nocodazole ile senkronizasyonu, açıklamaktadır.
- Yaban tip maya suşu W303 (leu2-3, 112 trp1-1 can1-100 ura3-1 ade2-1 his3-11, 15) kontrolü altında ilgi bizim gen (ENTH2) içeren yüksek kopyasını (2μ) plazmid DNA ile dönüştürdü. metionin repressible organizatörü (MET25). Metionin 2mm metionin yoksun medya maksimum ifade sağlar promotor aktivitesi bastırmak için yeterli olacaktır. Bu nedenle, bir dizi metionin konsantrasyonları istenilen düzeyde protein ifade etmek için kullanılabilir. 1 W303 hücrelerinde plazmid DNA Dönüşüm standart prosedürlere göre LiAc-TE yöntemi kullanılarak yapılır. 2
Not: Bu deney, sadece arka plan düzeyde protein ekspresyonunu sağlamak için metionin 2mm varlığı gecede büyüyen hücreleri tarafından yapılmalıdır . Ertesi sabah, protein ekspresyonu metionin hemen sonra hücre döngüsü senkronizasyonu (yaklaşık 4 saat) yoksun medya hücreleri resuspending tarafından uyarılan olmalıdır. Ancak, tüm belirtilerin analizi için zaman ders verme ENTH2 bağımlı hücre bölünmesi fenotipi (genellikle protein indüksiyon 3 4-6h sonra) ENTH2 önemli bir konsantrasyon hücreleri inşa etti sonra tetiklenen olduğunu bulduk çok uzun fenotip (en azından 16h). Biz metionin 0.2mm varlığı gecede büyüyen hücrelerin morfolojik fenotip bastıran ama metionin yoksun medya transfer fenotip-indükleyici seviyeleri hızla artabilir kritik altı kütle protein konsantrasyonu sağlar bulduk. Bu zaman görece kısa bir süre içinde hücre bölünmesi kusurun ağır belirtileri ayrıntılı analizi izin verir . Biz bu nedenle, deneyci bir durumda ayrı ayrı fenotip indüksiyonu için alt eşik metionin konsantrasyonunu belirlemek öneririz.
- Seçici medya metionin 0.2mm standart, steril teknikleri kullanılarak steril bir erlene 50 ml son dönüştürülmüş hücreleri ve inokülasyon içeren bir tabak altı koloniler seçin. 30 gece boyunca inkübe ° 200 rpm'de sallayarak ile C (standart maya kültürü koşulları hakkında daha fazla bilgi için, bkz. Ref 4)
- 600Nm kültürün optik yoğunluk ölçerek Ertesi sabah, hücre yoğunluğu tahmin. Oda sıcaklığında 5 dk 2200 rpm'de dönüyor hücrelerin 20 OD 600Nm eşdeğer steril bir santrifüj tüpüne ve hasat içine aktarın.
- 0,4 OD 600Nm / ml 'lik bir konsantrasyon içinde süspanse edin hücreleri YPD ve DMSO 1mg/ml, bir hisse senedi, 15μg/ml son bir konsantrasyon Nocodazole eklemek. 200rpm az titreme ile 30 ° C'de 4 saat inkübe edin.
Not: alfa-faktörü kullanarak G0 aşamasında ya da hidroksiüre kullanarak G1-S aşamasında tutuklama dahil olmak üzere alternatif tutuklama yöntemleri kullanılabilir. Mitoz tutuklanmaktan Nocodazole kullanarak amaçları için yeterince basit ve etkili olduğunu buldular.
- 4 saat sonra, eşit büyüklükte tomurcukları olan hücreleri mikroskop altında inceleyen sayısını sayma mitoz tutuklandı hücre yüzdesi kontrol edin. Tutuklama% 90 daha fazla ise, sonraki adıma geçin. Mitotik tutuklanması istenen yüzdesi elde edilene kadar Aksi takdirde, Nocodazole hücreler korumak.
- Hasat hücreler santrifüj 2200 5min rpm ve buz gibi su ile üç defa yıkamak. En son yıkama aşamasından sonra, seçici besiyerleri ~ 0.5 OD 600Nm / ml bir hücre yoğunluğu metionin eksik pelet tekrar süspansiyon haline getirin. Yarım hücre hacmi yeni bir steril tüpe aktarın ve nihai bir 0.2mm konsantrasyonu metionin eklemek. Bu etkileri için protein ekspresyonu bazal düzeylere nedeniyle kontrol olarak görev yapacak. Bu, (zaman = 0h) deney noktası ilk işaretler. 6h hücreleri her saat başı analiz edin.
Fenotip Geliştirme B. Analizi
Not: Aşağıda açıklanan tüm analiz yöntemleri aynı anda yapılması gerekmez .
Batı Blot protein ekspresyon düzeylerinin belirlenmesi
- Her zaman noktada, 2200 rpm'de 5 dakika santrifüj kültür ve hasat 2 OD 600Nm hücrelerin benzerleri OD 600Nm ölçer.
- 1ml steril su pelletini tekrar süspansiyon 1.5ml Eppendorf tüp transferi. Bir pelet almak için santrifüj tekrarlayın. Süpernatant aspire.
- 50μl SDS-PAGE Laemmli örnek tamponu (50mm Tris, pH 6.8,% 2 SDS,% 10 gliserol,% 2 oranında β-mercaptoethanol ve% 0.006 Bromophenol Mavi) pelletini tekrar. Asitle yıkanmış cam boncuklar (0.2-0.4 mikron çaplı) ve 1 dakika için vorteks 50μl ekleyin.
- 95 ° C ısıya blo kaynatın tüplerck, 2 dakika 30 saniye boyunca tekrar vortex ve 5 dakika kaynatmaya devam edin. -20 ° C'de protein örnek Freeze
- Nitroselüloz membran üzerine% 12 SDS-PAGE jel, transfer protein örneklerinin çalıştırın ve Batı ilgi protein tespit etmek için uygun antikorlar ile blot gerçekleştirmek. Bu örnekte, 1:2000 dilüsyon (1XPBS,% 5 yağsız süt kuru dut-Tween fare anti-HA antikor (Covance, Princeton, NJ) ile inkübe ENTH etki alanları etiketli hemaglutinin (HA) varlığı prob ,% 0.1 Tween). HRP, dut-Tween, keçi 1:2500 titrede anti-fare sekonder antikoru (Pierce) etiketli oda sıcaklığında 1s membran üzerindeki birincil antikor bağlamak için izin verilir. Supersignal Batı Pico Chemiluminescent Yüzey HRP etiketli anti-fare antikor tespit etmek için kullanılır.
- Dansitometrisi protein ekspresyon düzeyleri sayısal olmalıdır.
Bu bölümde iki yöntem anlatılmaktadır artan protein konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak izleme fenotipi geliştirme. İlk yöntem hücre nüfus tabanlı bir tek hücre düzeyinde ikinci çalışmalar.
Kantitasyonu, hücre bölünmesi fenotip ve hücre ölümü
- Her zaman noktada, 5 dakika 2200 rpm'de santrifüj yoluyla, steril teknikleri ve hasat hücreleri kullanarak steril Eppendorf tüpüne 1 ml hücre süspansiyonu aktarın.
- Süpernatantı aspire ve mavi 30μl Metilen steril su 1mg/ml bir stok takip 70μl medya pelet, tekrar süspansiyon haline getirin. Metilen mavisi, dolayısıyla ölü hücreler, mavi renk tarafından tespit edilebilir sitoplazmada indirgeyici bir ortamda renksiz olur, mavi bir hayati boya.
- Pipet ~ 6μl temiz bir cam slayt bu süspansiyon ve açılan üzerinde lamel yerleştirin. Ince bir cam arayüzler arasındaki hücreler, düzgün bir tabaka oluşturur lamel yavaşça basınız.
- 9 parçaya bölünür lamel Böl ve Şekil gösterilen kadran başına 3 fotoğraf çekmek. 2. Hücre / alan sayısı doğru kantifikasyon izin vermek için 30 hücre daha büyük olmalıdır. Hava kabarcıkları hazırlık zarar Her lamel önce yaklaşık 15 dakika boyunca görüntülenebilir.
- Altında çalışma fenotip gösteren hücrelerin sayısını. ENTH2 aşırı ekspresyonu üzerine indüklenen hücre bölünmesi kusur, hücre ölümüne yol açan ve bu yüzden, biz de kendi mavi renk tarafından belirlenen ölü hücrelerin sayısını saymak.
- Fenotipik hücrelerinin yüzdesini hesaplayın.
- Şekil gösterildiği gibi veri çizilir. 3.
Fenotipe özgü kusurları floresan mikroskopi kullanılarak görselleştirilmesi
Hücre bölünmesi arızalı hücreleri, ENTH2 aşırı ekspresyonu üzerine görüldüğü gibi, genellikle hücre duvarı defektleri ve septin mislocalization3 (GFP füzyon proteinleri olarak görüntülenebilmekte) ile karakterizedir. Maya hücre duvarı maya hücre duvarlarında kitin geri dönüşümsüz olarak bağlar Calcofluor Beyaz (CFW) ile boyanarak kolayca görüntülenebilmekte.
- Oda sıcaklığında 5 dakika 2200 rpm'de santrifüj steril Eppendorf tüp ve hasat hücreleri kültür her zaman noktası, kısım 1 ml az.
- Karanlıkta, oda sıcaklığında 5 dakika süreyle steril su ve inkübe 1mg/ml CFW çözüm 100μl hücre pelletini tekrar.
- Santrifüj ve 1X PBS ile 3 kez yıkama Hasat hücreleri.
- 100X büyütme 100μl 1X PBS pelet ve UV optik kullanarak mikroskop altında resim (hücre duvarı) ve FITC filtresi (GFP-septin) tekrar
- B.2.1 bölümünde aşağıdaki adımları 4-6 hücre duvarı defekti ve septin mislocalization hücre yüzdesi niceliğini
B.3. Tek hücre düzeyinde fenotip gelişimi Belirlenmesi: Time-lapse video mikroskopi.
- Bir bardak slayt içbükey bir depresyon ile% 70 alkol ile temizleyin ve kurumaya bırakın.
- Agaroz tamamen eriyene kadar mikrodalgada steril bir cam tüp içinde metionin eksik 5ml seçici medya 0.06g agaroz kaynatın.
- Agaroz hızla pipet 200μl slayt depresyon medya içeren ve altında hiç hava kabarcığı kalmamasına dikkat, temiz bir cam üzerine başka bir slayt ters.
- Jel katılaşır, yüzeyleri her zaman paralel tutarak, en sorunsuz uzak depresyon slayt slayt taşımak. Bu agaroz yatak yüzeyi depresyon slayt yüzeyi ile aynı hizada olmasını sağlar. Agaroz yatak çevresindeki hassas bir doku ile slayt bölgeyi temizleyin. Slayt artık kullanıma hazırdır.
- Zamanda = 4 saat, oda sıcaklığında 5 dakika 2200 rpm'de santrifüj steril Eppendorf tüp ve hasat kültür hücreleri transferi 1ml.
Not: Bu daha sonraki bir zaman noktası, bu yüzden bu fenotip gelişimi garanti protein ekspresyonu yüksek düzeyde sağlamak için seçilecek tavsiye edilir . Pilot deneyler determin için gereklicase-by-case bazında e indüksiyon kez.
- Metionin yoksun taze seçici medya 100μl supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri aspire edin.
- Lamel kenarlarına vazelin uygulayın. Daha sonra agaroz yatak merkezinde hücre süspansiyonu bir damla koyun ve hafifçe üzerlerine lamel basarak eşit yaymak.
- Vazelin ile lamel kenarlarında Seal ve oje ile kenarlarını kaplayan konumunu düzeltmek. Oje kuruyana kadar bekleyin.
- Isıtılmış bir sahnede, mikroskop, slayt yerleştirin ve yeterince aralıklı en fazla 10 hücre içeren bir alan seçin. Hücre bölünmeleri, alan, zaman içinde kalabalık alacak.
- Alanında ~ 5 saat boyunca her 5 dakikada bir görüntü çekin. Fenotip ilerlemesi ImageJ yazılımı (kullanarak bir film görüntüleri montaj tarafından incelenecektir Rasband, WS, ImageJ Sağlık, Bethesda, Maryland, ABD, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri -2005 )
Not: Biz Zeiss Axiovert 200M mikroskop kullanımı, Zeiss Axiocam MRM monokrom dijital kamera ve Carl Zeiss Axiovision görüntü elde etme canlı hücre görüntüleme yazılımı (sürüm 4.4). Sıcaklık kontrolü Pecon Tempcontrol cihaz tarafından 37, 30 ° C'de muhafaza ısıtılmış bir sahnede slaytlar koyarak elde edilir .
Önlemek için tekrar tekrar odaklanmak yeniden ayarlayarak, otomatik olarak, her zaman noktada birkaç z yığın görüntüleri kazanmak ve daha sonra film montaj, en iyi odak görüntü seçebilirsiniz görüntü elde etme yazılım programına uygundur. Bazı görüntü elde etme yazılımlar zaman ders deneyler için otofokus seçeneği var. Bu, ne zaman kullanılabilir bu seçeneği kullanmak için uygundur.
Vahşi tip maya hücreleri 30 en iyi büyümeye ° C dolayısıyla sıcaklık kontrolü kritik öneme sahiptir. Yeterli ısı sağlamak amacıyla, ısıtmalı aşamaya ek olarak harici bir ısı kaynağı sağlamak için yardımcı olur. Örneğin, görüntüleme süresi boyunca iletilen beyaz ışık mikroskop bırakın.
Ayrıca agaroz yatak ve hücre sandviç hazırlarken hava kabarcıklarını önlemek için kritik öneme sahiptir. Hava kabarcıkları arasına sıkışan zamanla ısıtıldığında genişler ve görüntülü alanında uzak hücreleri itmek eğilimindedir.
Alanı içinde bireysel hücre pozisyonları sağlamak için de önemlidir, özellikle yeniden odaklama girişimleri sırasında, görüntüleme işlemi süresi boyunca kayda değer değişikliği yoktur . Görüntü sabitleme eklentileri film monte edildikten sonra ImageJ hücre konumundaki küçük değişiklikler düzeltmek için mevcuttur. ( http://www.cs.cmu.edu/ ~ Kangli / kod / Image_Stabilizer.html ).
Discussion
Bu protokol, protein aşırı ekspresyonu üzerine morfolojik bir fenotip (uygun hücre bölünmesi geçmesi mümkün maya hücresi) gelişimini izlemek anlatılmaktadır. Bu işlemi yaparken, daha hızlı ve belirsiz sonuçlar hücreleri zarar verebilir olarak tavsiye santrifüj hızda peletleme maya hücreleri hasat hatırlamak önemlidir. Metilen mavisi ve Calcofluor beyaz toksik olarak hemen önce görüntüleme hücreleri yaşamak için ilave edilmelidir. Bu işlem aynı zamanda kolayca hedef kontrollü bir organizatörü ifade edilir, protein baskı koşulları altında gözlenen fenotipleri için adapte olabilir.
Acknowledgments
Brian G. Coon ve Claudia B. Hanna yararlı tartışmalar ve destek için teşekkür ederiz. Bu proje, Dep start-up fonları tarafından desteklenen. Biyolojik Bilimler, Purdue Üniversitesi R. Claudio Aguilar ve R. Claudio Aguilar Purdue Kanser Merkezi aracılığıyla bir Amerikan Kanser Derneği Kurumsal Araştırma Bursu.
Materials
|Name||Type||Company||Catalog Number||Comments|
|Nocodazole||Reagent||Sigma-Aldrich||M1404|
|Methylene Blue 1% (w/v)||Reagent||VWR international||VW6276-0|
|Calcofluor White||Reagent||Sigma-Aldrich||F3543|
|Petroleum Jelly||Reagent||VWR international||VW3339-2|
References
- Rönicke, V., Graulich, W., Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. Use of conditional promoters for expression of heterologous proteins in Saccharomyces cerevisiae. Methods Enzymol. 283, 313-322 (1997).
- Gietz, R. D., Woods, R. A. High efficiency transformation with lithium acetate in Molecular Genetics of Yeast: A Practical Approach. Oxford University Press Inc. New York. 121-134 (1994).
- Mukherjee, D., Coon, B. G., Edwards, D. F., Hanna, C. B., Longhi, S. A., McCaffery, J. M., Wendland, B., Retegui, L. A., Bi, E., Aguilar, R. C. The yeast endocytic protein Epsin 2 functions in a cell-division signaling pathway. J Cell Sci. 122, 2453-2463 (2009).
- Sherman, F. Getting started with yeast in Guide to Yeats genetics and Molecular Biology. Academic Press Inc. San Diego. 3-21 (1991).