Overview
Bu video, aksesuar bezlerinin erkek sineklerden ayrıştırılmasını açıklar ve izole bezin tek bir hücre süspansiyonuna ayrıştırılacağı bir örnek gösterir.
Protocol
Bu protokol, RNA'yı Drosophila Erkek Aksesuar Bezlerinin İkincil Hücrelerinden İzole Etmek için FACS tabanlı bir Protokol olan Immarigeon ve ark.'dan bir alıntıdır, J. Vis. Exp. (2019).
1. Çözümler ve Malzeme Hazırlama
-
Aşağıdaki çözümleri hazırlayın.
- Serum Takviyeli Orta (SSM) Hazırlayın: Schneider'ın Drosophila ortamı% 10 ısı inaktive fetal sığır serumu ve% 1 Penisilin-Streptomisin ile tamamlanır.
- 1x tripsin enziminin aliquotlarını hazırlayın (örneğin, TrypLE Express Enzimi) ve oda sıcaklığında saklayın.
- Papain aliquots hazırlayın [50 U/mL] (-20 °C'de saklanır ve sadece bir kez çözülür).
- 1x fosfat tampon salin (PBS, oda sıcaklığında saklanır) hazırlayın.
-
Aksesuar bezlerinin fiziksel ayrışması için birden fazla alev yuvarlatılmış pipet ucu hazırlayın.
NOT: İşlenmemiş plastiğe yapışma eğiliminde olduklarından aksesuar bezlerini işlemek için düşük tutma ipuçları kullanın. Alev yuvarlama işlemi uç açıklığı azaltır ve ucun kenarlarını yumuşatır. Bu, hücre zarlarını kesmeden peptidaz sindirimi sonrası verimli bir ayrışma sağlar.
- Keskin bir bıçakla bir adet 200 μL ucu kesin ve ucunu yuvarlamak için bir alevin üzerinden hafifçe geçirin, böylece açıklık 2.7.
- Uç açıklığı bir alevin yakınında bir saniyeden daha az geçirerek birden fazla 1.000 μL ucun açılmasını daraltın. Aşırı erimeyi veya tıkanmasını önlemek için ucu hafifçe döndürün. Yapılan uçları daha dardan daha geniş bir şekilde sıralayın. Bu, aspirasyon hızını zamanlayarak yapılabilir. En dar uçların verimliliğini test etmek için küçük ölçekli bir AG örneğini ayırmaya çalışın.
NOT: Bu uçlar mekanik ajitasyon için kritik öneme sahiptir. Kaliteli alev yuvarlatılmış pipet uçları, hücre canlılığını korurken tam ayrışma sağlar. Bu nedenle, bu uçlar yeniden kullanım prosedürünün sonunda su ile iyice yıkanır. Bu, günden güne tekrarlanabilir ayrışmaya izin verir.
2. Aksesuar Bezlerinin Diseksiyonu
- 20 ila 25 erkek Drosophila'yı buzdaki cam bir kaba koyun.
- SSM'de 1 erkeği parçalara ayrıştırın. Üreme sistemini çıkar ve aksesuar bezi çiftini boşalma kanalı dışındaki diğer tüm dokulardan temizleyin.
NOT: Serbest bırakılan sperm kümeler oluşturabileceğinden ve ayrışma işlemini bozabileceğinden testisleri çıkarın. Boşalıcı ampulü çıkarın, bu da yüzerken kullanımı zorlaştırır.
- Önlüklerle, aksesuar bezlerini oda sıcaklığında SSM ile dolu bir cam plakaya aktarın. SSM'de 20 çift bezden oluşan bir parti elde etmek için 2.2-2.3 adımlarını 20 kez tekrarlayın.
NOT: Bu adımlar 15 ila 20 dk'da elde edilecektir. GFP floresan mikroskop kullanılarak izlenebilir.
- Oda sıcaklığında 1-2 dakikalık bir yıkama için aksesuar bezlerini 1x PBS'ye aktarın.
NOT: Daha iyi ayrışma için bezleri PBS ile durulamak zorunludur. Bununla birlikte, hücreler PBS'de stres belirtileri gösterdiğinden, bu adımın süresi sınırlanmalıdır; PBS'deki ayrışmış ikincil hücreler hızla şişer ve ölür.
- Ayrışma çözeltisini elde etmek için 20 μL papain [50 U/mL] ile 180 μL 1x tripsin enzimini seyreltin (yukarı veya aşağı ölçeklemek için her erkek için 9 μL tripsin enzimi ve 1 μL papain tutun). Forseps ile aksesuar bezlerini bu çözeltiye aktarın.
- Aksesuar bezlerinin ucunu (ikincil hücreler içeren) proksimal kısımdan izole edin. Glandüler bir lobun ortasını sıkıca sıkıştırmak ve ikinci bir tokanın keskin ucuyla kesmek için ince önps kullanın. Ayrışmayı iyileştirmek ve hücre sıralama süresini azaltmak için aksesuar bezlerinin ve boşalma kanalının proksimal kısmını çıkarın.
NOT: Distal kısmın 20 çift bezden parçalanması 15 ila 20 dakika sürecek ve peptidazlar tarafından sindirim böylece oda sıcaklığında başlayacaktır.
- Tüm bez uçları parçalandıktan sonra, Adım 1.2.1'de hazırlanan özel bir 200 μL pipet ucu kullanarak bunları 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın. Bezleri kullanmadan önce geniş, yuvarlak ve ıslak olmalıdır.
NOT: Pipet aksesuar bezi dokusu için, uçlar her zaman uygun çözelti ile önceden ıslatılmalıdır (tripsin enzimi veya SSM, bu amaç için her birinden bir tüp tutun). Kirlenmeyi önlemek için numuneler arasında uçları dikkatlice durulayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
|Name||Company||Catalog Number||Comments|
|Binocular microscope for dissection|
|Binocular with light source for GFP|
|Bunsen|
|Plastic microtubes 1.5 mL||Eppendorf|
|Fine dissection forceps|
|Foetal bovine serum||Gibco||10270-106||heat inactivated prior to use|
|Glass dishes for dissection|
|Ice bucket|
|P1000||Gilson|
|P20||Gilson|
|P200||Gilson|
|Papain||50U/mL stock|
|PBS||home made|
|Penicillin-Streptomycin||Gibco||15070-063|
|Schneider’s Drosophila medium||Gibco||21720-001|
|Tipone 1250 μL graduated tip||Starlab||S1161-1820|
|Tipone 200 μL bevelled tip||Starlab||S1161-1800|
|TrypLE Express Enzyme||Gibco||12604013|