DNA ölçümü nedir?
DNA kantifikasyonu, genetik numunelerin doğru analizini sağlayan temel bir laboratuvar işlemidir.
Geniş anlamda, DNA kantifikasyonu, bir numunedeki DNA konsantrasyonunu belirlemek için kullanılan herhangi bir işlemdir. Genellikle aşağı akış deneylerinden önce gerçekleştirilen DNA ölçümü, deneysel sonuçların geçerliliğini sağlamada hayati önem taşır.
DNA kantifikasyonu nasıl yapılır?
DNA miktar tayininin gerçekleştirilebileceği birkaç farklı teknik vardır. Bunlardan bazıları (UV-Vis spektrofotometri gibi) numunede herhangi bir değişiklik gerektirmezken, diğerleri (florometri teknikleri gibi) numunenin daha ayrıntılı incelemeye olanak sağlamak için moleküler işaretleyicilerle boyanmasını veya boyanmasını içerir.
Belirli bir uygulama için en iyi seçim, gerekli doğruluk derecesi, ekipman için yapılan sermaye harcaması ve sarf malzemelerinin maliyeti dahil olmak üzere birçok faktöre bağlıdır.
1. UV-Vis Spektrofotometri
UV-Vis spektrofotometrisi (veya yakından ilişkili UV spektrometrisi), DNA ölçümü için en yaygın yöntemlerden biridir. Spektrumun ultraviyole ve görünür bölgelerindeki ışık frekanslarının soğurulmasını veya iletilmesini ölçer.
Bir “boş” referans solüsyonunun (DNA’nın içinde asılı olduğu tampondan oluşan) absorpsiyon / iletim profillerinin DNA örneğininkiyle karşılaştırılması, hızlı ve doğrudan DNA ölçümü sağlar. Spektrofotometrik tekniklerin avantajları arasında analiz hızı, düşük maliyet ve numunenin doğrudan ölçümü vardır, bu nedenle hiçbir standart gerekmez. UV-Vis analizi ayrıca protein veya birlikte ekstrakte edilen tuzlardan kaynaklanan potansiyel kontaminasyon hakkında bilgi sağlar.
2. Florometri
Florometrik DNA niceleme teknikleri, tercihen DNA moleküllerine bağlanan moleküler boyaların kullanımına dayanır. Tipik olarak, bu boyalar (PicoGreen veya SYBR Green gibi) çift sarmallı DNA’ya özgüyken, UV-Vis DNA ölçüm yöntemleri RNA ve DNA arasında ayrım yapmaz.
Floresans testi hazırlandıktan sonra, belirli bir numunenin floresansını standart bir eğri ve bilinen konsantrasyondaki bir dizi DNA numunesi ile karşılaştıran bir florometre kullanılarak DNA ölçümü gerçekleştirilir.
Florometrik teknikler, UV-Vis DNA kantifikasyonu gibi absorbans bazlı yöntemlerden daha hassastır, bu da onları düşük DNA konsantrasyonlarını ölçmek için daha uygun hale getirir ve ilgilenilen analit için daha spesifiktir.
3. Gerçek zamanlı kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (PCR)
Kendi başına, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), mutlaka kantifikasyondan ziyade DNA amplifikasyonu için bir tekniktir . DNA örneklerinin tekrarlanan termal döngüsünü ve hedef DNA dizilerini kopyalamak için yüksek sıcaklıkta DNA polimeraz enzimlerinin kullanımını içerir.
Gerçek zamanlı PCR veya kantitatif PCR (qPCR) teknikleri, ilk numunedeki DNA dizilerinin konsantrasyonunun hesaplanmasını sağlamak için DNA amplifikasyonunu DNA kantifikasyonuyla birleştirir. 3 Birçok farklı qPCR varyasyonu geliştirilmiştir ve laboratuvarların satın alabileceği çeşitli qPCR kitleri mevcuttur. Teknik olarak çoğu qPCR tekniği, çift sarmallı DNA’yı veya ilgilenilen spesifik DNA dizilerini ölçmek için floresan boyamaya dayanan bir florometri alt kümesidir.
4. Jel elektroforezi
Elektroforez, DNA, RNA ve proteinler gibi makromoleküllerin boyut ve/veya yüklerine göre ayrılması için bir yöntemdir. İlk olarak, bir agaroz jeli gibi bir matris üzerine bir DNA örneği biriktirilir. Jele bir elektrik alanı uygulanarak DNA moleküllerinin içinden geçmesine neden olur. Daha küçük moleküller gözenekli jel içinde daha uzun moleküllere göre daha kolay hareket ettiğinden, numunedeki DNA parçaları doğal olarak uzunluklarına göre ayrılarak belirli boyutlardaki DNA parçalarından oluşan “bantlar” oluşturur.
DNA ölçümü için, bu bantların yoğunluğu başlangıç örneğindeki belirli bir DNA fragmanının konsantrasyonunu belirlemek için kullanılabilir. Bu DNA ölçümü yöntemi, belirli bantların veya çizgilerin varlığına bağlı olarak DNA veya RNA kontaminasyonunu gösterebilir. Bu yöntem genellikle spektrofotometri veya floresan nicelemesinden daha fazla zaman alır ve niceleme açısından daha az doğrudur, ancak DNA fragmanlarının boyut dağılımı hakkında bilgi sağlayacaktır.
5. Kılcal (Kapiler) elektroforez
Kılcal elektroforez, ayırmanın bir jel yatağı yerine ince bir kılcal içinde yapılması dışında, jel elektroforezine benzer şekilde çalışır. İşlem ayrıca tipik olarak otomatikleştirilir.
Bu DNA kantifikasyon tekniği kılcal bir tüpte gerçekleştirildiğinden, yalnızca minimum miktarda numune gerektirir: tipik olarak yaklaşık 1 – 2 μL . Parçalar kılcal boru boyunca hareket ettikçe ve uzunluklarına göre ayrıldıkça, parçaları uzunluk sırasına göre ölçmek için araya giren bir boya kullanılır.