8 Aralık 1542'de İskoçya'da, Linlithgow Sarayı'nda doğdu. Babası İskoçya Kralı V. James, annesi ise Mary adlı bir Fransızdır. V. James kısa süre sonra ölünce, altı günlük hâliyle İskoçya'nın Kraliçesi oldu. Tahta geçene kadar ülkeyi vekiller idare etti. Bu fırsattan istifade eden İngiltere Kralı VIII. Henry, Mary altı aylıkken Greenwich Akdi'nin imzalanmasını sağladı. Buna akde Mary, on yaşına geldiğinde Edward'la evlenecek, İngiltere'ye taşınacak ve Kral VIII. Henry, Mary'nin nasıl büyüdüğünü görebilecekti. Fakat Kardinal Beaton buna karşı çıktı ve Mary'i İngiltere'den uzaklaştırmak istedi. Mary'ye 9 Eylül 1543'te taç giydirildi. Bu durum İskoçya ile İngiltere arasında bir krize yol açtı.
Fransa Kralı II. Henry, Fransa ve İskoçya'yı birleştirmek için kendi üç yaşındaki oğlunu Mary yle evlendirmek istedi. Bu teklif kabul edildi. Beş yaşındaki Mary Fransa'ya gönderildi ve burada eğitim aldı. 1561'de ise İskoçya'ya döndü. İskoçya o dönemde Katoliklik ve Protestanlık arasında bölünmüştü. Mary bir Katolik'ti. Onun dönüşü, Protestanlık'ı resmî din yapan soylulara ve onları destekleyen İngiltere'ye karşı bir tehdit oluşturdu.
Mary, İngiliz tahtına yerleşmek için Lord Danley'le 29 Temmuz 1565'te evlendi. Elizabeth bu evlilikten endişe duymaya başladı; zira Mary ile Danley, İngiltere tahtının vârisleriydi. Mary'nin 1566'da James adlı bir oğlu oldu. Lord Danley Şubat 1567'de öldürüldü. Mary Nisan 1567'de Bothwell Kontu ile evlendi. Halkın desteğini yitiren Mary, Moray önderliğinde ayaklananlar karşısında yenildi ve soylularca tahttan indirildi. Lochleven Kalesi'ne hapsedildi ve tahtını bir yaşındaki oğlu James'e bıraktı. 1568'de hapisten kaçarak üvey kardeşi Moray'a savaş açtı, ancak Langside Savaşı'nda yenildi. 16 Mayıs 1568'de İskoçya'yı terk etmek zorunda kaldı. Elizabeth'in yönetimindeki İngiltere'ye sığındı.
Elizabeth'ten sonra İngiltere tahtına en yakın vâris olması ve İngiliz Katoliklerinin ayaklanıp Katolik dinini egemen kılma ve Mary'yi tahta geçirme planları, Mary'nin İngiltere için tehlike oluşturmasına ve on sekiz yıl boyunca tutsak bir yaşam sürmesine yol açtı.
Mary, Elizabeth'e karşı düzenlenen birçok komploya karıştı. Aleyhinde toplanan delillere dayanılarak 1586'da ölüme mahkûm edildi. Oğlu, VI. James adıyla İskoçya ve I. James adıyla İngiltere kralı oldu.