Cite this ArticleCopy Citation | Download Citations
Yoneda, M., Molinolo, A. A., Ward, J. M., Kimura, S., Goodlad, R. A. A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine. J. Vis. Exp. (104), e53042, doi:10.3791/53042 (2015).
Translate text to:
Please note that all translations are automatically generated.
Abstract
Bir sonraki analiz veya ölçülmesi için farenin ince bağırsak ve kolon tüm bağlar hazırlanması zaman alıcı ve zor olabilir. Biz hızla elle elde edilebilir olanı üstün ve aynı kalitede bütün montaj hazırlıkları hazırlamak için kesmek için basit bir cihazın kullanımını ve 'roll' fare bağırsakları açıklar. Cihaz 4 paslanmaz çelik çubuklar ve bir kesme kılavuzu hareket eden bir üst tutan bir taban ihtiva eder. Çubuklar, ince bağırsakta [üçe ayrılır] ve kolon lümeni içine yerleştirilir. Çubuklar ve numuneler daha sonra, cihazın tabanından tutma yuvalarına filtre kağıdı ya da bir marka kartı üzerine yerleştirilir. Cihazın üst sonra konumlandırılmış ve kesim kılavuzu olarak hizmet vermektedir. Üst kısmın merkezinde iki açılı bölümler bir bıçak ya da bistüri rehberlik etmek için kullanılan ve çubukların üstünde uzunlamasına bağırsak kesilir. Bağırsak bölümleri kesilmiş, sonra, en çıkarılır ve kart, TissUE ve çubuklar yavaşça cihazından çıkartılmış ve tezgah üzerine yerleştirilir. Çubuklar yavaşça dümdüz ve filtre kağıdı veya kartın yatan parça üzerine bağırsak segmentleri sopa yanlara alınır. Son preparat, daha sonra tetkik veya sabit ve sonraki analiz için saklanır. Preparatlar normal veya genetiği değiştirilmiş fare modelleri bağırsak değişikliklerin incelenmesi için paha biçilmezdir. Preparasyonlar iltihabı (kolit), hasar, kanser öncesi lezyonlara etkileri çalışmasında ve miktar tayini için kullanılmıştır (aberant kript odağı (ACFs) ve odaklar (MDFs) tüketilmiş musin) ve polipler veya tümörler.
Introduction
Fare ve genetiği değiştirilmiş fare 1-3 değişik patolojiler özellikle kanser ve gastrointestinal sistemde inflamasyona ilişkisi çalışma için paha biçilmez bir modeldir. Bu genellikle ince bağırsakta ve / veya kolon bütün bağlar hazırlık gerektirir.
Bütün bağlar hazırlanması ofset makas hassas çifti ile yapılabilir ancak fare 4 başına yaklaşık 20 dakika sürebilir. Bu farelerin önemli miktarda gerektirir karşılaştırmalı çalışmalar, çok pratik değildir (istatistiksel analize grup konu başına 10 demek). Buna ek olarak, geçen süre doku bozulması riskini arttırır. Bu sorunu hafifletmek için bir girişimde çeşitli kesim hazırlık yardımlarının deneme yol açtı. İlk kesim bahçeleri ile, metal plakalar, bir dizi dayalı, ancak plakalar doku gizlenmiş ve kesme kontrol etmek ve böylece zor oldu.
Bir Bayağıbiz sonra yarım kalem şekli bir neşter (Şekil 1) için iyi bir rehber yapmak nasıl görebiliyordu l altı taraflı kalem nihayet, kesme cihazı için ilham kaynağı oldu. Bu dört kesim kılavuzları 5 ile bir çerçeve için bir tasarım sonuçlandı. Şekil 4'te hazırlıkları makas hazırlama ve cihaz hazırlığı arasındaki farkı göstermek olarak bu cihazın etkinliği dramatik oldu.
Orijinal cihazların üstleri metal birkaç parçaya, ancak daha sonra olanlardan inşa edilmiştir ve güncel model Duralüminyum sağlam bir parça dışarı işlenmiş oldu. Baz yüksek kalite yüksek yoğunluklu reçine dışarı işlenmiş oldu.
Cihaz büyük ölçüde hızlandırır ve geniş bir uygulama yelpazesi var hazırlıklar, kalite ve tutarlılığını artırır fare bağırsak bütün bağlar hazırlanması için büyük bir kullanım olduğunu kanıtlamıştır.
Protocol
Çeşitli deneysel prosedürler ve insancıl ötenazi konak kurumları etik komite tarafından uygun düzenleyici kurumlar tarafından onaylanmıştır. Ötenazi normal servikal dislokasyon CO2 boğulmaya kullanılarak elde edilir.
1. Cihaz
- Makine Bu yazıda tarif edildiği gibi, yüksek yoğunluklu asetil reçinesi katı bloğu üzerinden cihazın tabanına ana bölümü. Her Sonunda çubuklar almaya bu 2,5 mm'lik bahçeleri arasından 3 mm yüksek yükselmiş şeritler ve parça makine oluşturmak (Şekil 2 ve Şekil 3).
- Yuvarlatılmış uçları olan bir 2,4 mm çapında paslanmaz çelikten çubukları sağlayın.
NOT: Kapağın ana çerçeve duralumin plakanın dışında işlenmiş oldu. Bitmiş cihazların sınırlı sayıda Dr. Goodlad temin edebilirsiniz.
Cihazın 2.
- Makas kullanarak karın boşluğundan küçük bağırsak ve kolon parçalara ayırve eldivenli parmakları. Bağırsak uzağa çekerek hafifçe kavisli bir forseps ile tutarak tarafından mezenterin çıkarın.
- Soğuk fosfat tamponlu salin (PBS, pH 7.4) bir 10 ya da 20 ml diş uydurma plastik şırınga sığacak böylece daha geniş sonunda aşağı kesilmiş bir Gilson tipi pipet kullanarak ile bağırsakları durulayın.
- Kağıt havlu bir levha üzerine ince bağırsak (SB) dışarı Lay ve uzunluğu (proksimal, orta ve distal - SB1, SB2 ve SB3) üç eşit parçaya bölün makas kullanarak. Çekum çıkarın ve kolon yatıyordu.
- Makasla barsak segmentleri içine birkaç çok küçük kesikler sıvı kaçmak ve bağırsakların üzerindeki kağıt havlu bir sayfa yerleştirin ve yavaşça sıvıyı dışarı sıkmak ve kuru leke hazırlıkları üzerinde bir parmak çalışmasına izin vermek için yapın.
- Bölümleri kaldırın ve daha önce fosfat tamponlu tuzlu su içinde bir çanak içinde ıslatılarak ıslatılmıştır, paslanmaz çelik çubuklar yerleştirin.
NOT: bağırsaktayani istenirse içedönük (tersyüz).
- Cihazın tabanına uyacak şekilde boyutuna kartı ya da filtre kağıdı kesme bir parça etiketleyin. Neredeyse tüm çözümleri etkilenmez olarak Kalem, en iyisidir. Otopsi tarih, deneysel kod ve hayvan kimlik numarası önerilmektedir.
- Cihazın taban içine kartı veya filtre kağıdı yerleştirin. Cihazın tabanındaki yuvalara çubukları ve bağırsakları yerleştirin. Bölümlerinin yakın ucu standart bir şekilde yerleştirildiğinden emin olun. Proksimal uçları kart etiketleri yakın olmalıdır.
- Tabanının üzerine cihazın üst parçasını yerleştirin. Uzunlamasına bölümleri kesmek için bir neşter bıçak yönlendirmek için açılı çubuklarını kullanın.
NOT: Doku yavaşça ve dikkatlice bıçakla hareket etmez emin olmak için bir parmak ile düzenlenen olup olmadığı olur.
- Cihazın üst parça çıkarın. Dikkatle (onların çubuklar hala) filtre kağıdı ve dokuları çıkarın.
NOT: fil altına yerleştirilen sert karta bir parçater kağıt kaldırma yardımcı olacaktır.
- Segmentlerde (PBS batırılmış bir eldivenli parmak ucu ile) Hafif ıslak. Çubuk Rulo, yan gut açmak ve düz yaymak için yan. Doku daha sonra filtre kağıdı uyacaktır.
- Görme herhangi brüt lezyonlar için hazırlıklarını incelemek.
- Sığ bir banyo (ya da sandviç kutusu) içeren fiksatif ile filtre kağıdına yapıştırılmış doku aktarın.
NOT: Doku filtre kağıdına yapışır ya da karta sıkıca bağlı kalacaktır sonra. Fiksatif çeşitli hazırlama korumak için de kullanılabilir. Bu Carnoy akışkan iyi hücre çoğalma yöntemleri için ideal bir bağnazlıktır bağırsak hücre proliferasyonu 6 çalışma için kullanılması gerektiğini tavsiye edilir; Bununla birlikte, formalinin ya da diğer uç noktaları gerekli olduğunda diğer pek çok sabitleyici de kullanılabilir.
- Fiksasyon (genellikle 3 saat) sonra,% 70 etanol içinde hazırlıkları aktarın. Gerekene kadar Numuneler daha sonra saklanabilir. Hazırlıklar cBir cepheden çalışılmış ve / veya H & E veya diğer histolojik boyama teknikleri, immünohistokimya ve / ya da in situ hibridizasyon için histolojik numune hazırlanması için kullanılabilir.
NOT: Uzun süreli sabitleme immünohistokimyasal reaktivitesi ve / veya in situ hibridizasyon reaktivite azaltabilir. Polipropilen sandviç kutuları hazırlıkları çok sayıda saklamak için idealdir.
- Çeşitli bağırsak segmentlerden sabit dokuların Gerekirse 'İsviçre rulo' haline ve yukarıda tarif edilenler de dahil olmak üzere histolojik yöntemler 6 tüm aralığı ile boyanmış olabilir. Bir 'İsviçreli rulo' yapmak için bağırsak segmentleri bir entomolojik pim ile emniyete ve balmumu 6 gömmek için işlenen bir kokteyl çubuğu veya bir kürdan etrafında haddelenmiş filtre kağıdından, kaldırılır.
- Gerekirse, anormal kript odakları 7 görselleştirmek için metilen mavisi ile toplu doku leke.
- Sabit hazırlıklarını Puaneğlence.
Representative Results
Polipler (Şekil 4) doku aydınlatmak yan soğuk bir ışık kaynağı olan bir stereomikroskop altında tespit etmek kolaydır. Bir polip puanlama sonra ele alınabilir ve farklı operatörler anlaşmaya ulaşabilir sırayla gözlenen zaman kalem işaretleri ile kart işaretlemek için yararlıdır. Doku ayrıca [metilen mavisi ile] tanımlamak için lekeli toplu olabilir anormal kript odaklar 8 veya üzeri ya da trans yanması ile gelen aydınlatma ile tüketilmiş odaklar (MDFs) 9 müsin (Şekil 5).
Lezyonların konumu da bir konumsal bazda 8 gol yapılabilir. Bu bir ilk bilinen çeşitli boyutlarda birkaç ızgaraları germek ve bir asetat levha üzerine baskı, sonra bir bilgisayar çizim paketinde 10 kare bir ızgara hazırlamak, bu birkaç kez kopyalama ve ihtiyacı yapmak için Intaglio bir yararlıdır [(Şekil 6) ve Bu] yapmak için nispeten basit bir program. Bir sonra l uyan bir kılavuz bulabilirsiniz bölümün ength ve ilgi olaylarını puan için kullanabilirsiniz.
Bir kez, attı parçası veya dokunun her ileri analiz için çıkarılabilir veya bütün bölümleri histolojik kesit bir 'İsviçre rulo' içine çekilebilir. Bu prosedür teknik zorlu 10 olarak tarif edilmiş olmasına rağmen hazırlıkların bile düz ve doğa bu prosedür çok daha basit hale getirir. Makro hazırlık 'makro polip' ve 'mikro polipler' 11,12 (Şekil 7) puan kullanılan İsviçreli rulo puan için kullanılabilir.
Cihazın ilham bir kalem geldi nasıl Şekil 1.. Bir kesim kılavuzu olarak hareket etmek yarım kalem şeklini kullanarak fikrine Biyolojik Servis ünitesi kurşun Tartışmalar.53042 / 53042fig1large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil orijinal cihazın 2. Fotoğraf. Orjinal cihaz elle hazırlanan metal birkaç adet, inşa edildi. (A) aygıtı toplandı. (B) cihazın üst. Konumunda çubuklar göstermek için kaldırıldı Lütfen Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Yeniden tasarlanan cihazın Şekil 3. Fotoğraf. (A) kapağın ana çerçeve duralumin plakanın dışında işlenir. (B) (siyah görülen) bazBir kanal oturan 4 çıkarılabilir çubuklarına sahip olan, yüksek yoğunluklu bir asetil bir katı reçine blok yapılmıştır. . Kapak (A) taban (B) üzerine yerleştirilir: baz (siyah) üzerine yerleştirilen bir filtre kağıdı (beyaz) (C) cihazın son görünüşüdür gösterilmiştir. Santimetre Ölçüler gösterilir. Çubuklar yuvarlatılmış uçları olan çapı 2,4 mm idi. Daha fazla bilgi için referans 5'e bakınız. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Ile yapılan Şekil 4. Gut hazırlık makas ve cihazı kullanarak ofset. (A) bağırsak ofset makas kullanılarak hazırladı. (B) bağırsak kesici gut boyunca bile eni gösteren ve hazırlanan bağırsakları sayım yapan doku daha iyi tanıtımı, ve çok daha kolay polip gözlem. Hücre Çoğalması 6 Şekil 3'ten Modifiye. Ünite ile Ölçek çubuğu gösterilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5. aberant kript odağı metilen mavisi ile lekelendirilmiştir kolon bütün montaj görülen. Bütün kolon dökme oklarla gösterilmiştir aberant kript odağı tespit etmek metilen mavisi ile boyanmıştır monte edin. Ünite ile Ölçek çubuğu gösterilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Dosyaları / ftp_upload / 53042 / 53042fig6.jpg "/>
Şekil 6. pozisyonel puanlama için asetat sayfaları için şablon. 10 kareler ızgara Çeşitli boyutlarda asetat kağıtlara basılır. Kesim bağırsak bölümünün uzunluğu uyan ızgara üzerinde yatırılır ve ilgi olaylar her karede lezyonların sayım numarası gibi puanlanır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil H & E lekeli fare ince bağırsağın 7. İsviçreli rulo. Gösterilen küçük bağırsak İsviçreli rulo iyi bağırsak tümör oluşumunun in vivo model özelliği, bir Apc (Min / +) fare olduğunu. Oklar temsilci adenomlar gösterir. Ünite ile Ölçek çubuğu gösterilir.42 / 53042fig7large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Discussion
Iki operatör tam 6 dakika içinde fare otopsi böylece cihaz ölçüde sürecini hızlandırır. Bu bariz brüt lezyonlar ve tartma ve büyük organların sabitlemek için bir görsel kontrol içerecektir. Ayrıca operatörler, durulama kurulayın ve mide, çekum, ince bağırsak ve kolon tartmak ve tüm bağlar hazırlamak için izin verecektir. Basık doku çok hızlı bir şekilde sabit ve dolayısıyla bozulma eserler önlemek olabilir.
(Dışında hızı) cihazın önemli avantajlarından biri Cihaz sonra sonraki analiz ve çok daha kolay ölçümü yapar çok daha kaliteli hazırlıkları üretimini üretebilirsiniz olmasıdır. Yüz puanlama En (örneğin polip numarası, çap ve yük hacmi gibi) makroskopik kanserojen ve pre-kanserojen lezyonlar ölçülmesi için idealdir. Preparatların bile doğa üstü 'İsviçre rulo' içine yuvarlanan ve böylece mikro p o histolojik analiz kesit için ideal hale getirirolyp 'sayısı da ölçülebilir. Aberant kript odağı ve diğer ön-neoplastik lezyonlar, tüm bağlar ile görselleştirilebilir.
Çeşitli kolit modellerinde inflamatuar değişiklikler aynı zamanda tüm bağlar ile gözlenebilir.
Ayrıca bağırsağın değişik bölgelerinde bu olayların niceliksel ve mekansal konumu tespit edilebilir. Tekniğin sınırlandırılması cihazının kullanımı özellikle neşter ile doku puanlama, bazı maharet gerektirir. Çoğu operatör birkaç dakika uygulama kısa bir süre sonra tekniği hakim olabilir. Preparatlar sadece birkaç dakika alır, ancak anında korunması gerekiyorsa, küçük numuneler daha sonra tespit veya dondurulmuş ve her zamanki gibi hazırlanan doku kalan alınabilir.
Materials
|Name||Company||Catalog Number||Comments|
|Delrin||Ryan Plastics, Earls Barton, UK||High-density acetal resin similar material would suffice|
|Duralumin plate||Metal Supplies Ltd, Park Road,Dukinfield. SK16 5LP UK||Aluminium allow dating back to 1909 so alterative suppliers are available|
|Finished device(s) ready for use||Contact Dr Goodlad firstname.lastname@example.org||Contact email@example.com for supply details|
References
- Goodlad, R. A. Cancer Handbook. Alison, M. R. John Wiley and Sons, Ltd. 243-262 (2007).
- Ward, J. M., Treuting, P. M. Rodent intestinal epithelial carcinogenesis: pathology and preclinical models. Toxicol Pathol. 42, 148-161 (2014).
- Sundberg, J. P., Hogenesch, H., Nikitin, A. Y., Treuting, P. M., Ward, J. M. Training mouse pathologists: ten years of workshops on the Pathology of Mouse Models of Human Disease. Toxicol Pathol. 40, 823-825 (2012).
- Wasan, H. S., Novelli, M., Bee, J., Bodmer, W. F. Dietary fat influences on polyp phenotype in multiple intestinal neoplasia mice. Proc Natl Acade Sci USA. 94, 3308-3313 (1997).
- Rudling, R., Hassan, A. B., Kitau, J., Mandir, N., Goodlad, R. A. A simple device to rapidly prepare whole mounts of murine intestine. Cell Prolif. 39, 415-420 (2006).
- Alferez, D., Goodlad, R. A. To best measure cell proliferation in samples from the intestine. Cell Prolif. 40, 231-240 (2007).
- Park, H. S., Goodlad, R. A., Wright, N. A. The incidence of aberrant crypt foci and colonic carcinoma in dimethylhydrazine-treated rats varies in a site-specific manner and depends on tumor histology. Cancer Res. 57, 4507-4510 (1997).
- Park, H. S., et al. Effects of epidermal growth factor and dimethylhydrazine on crypt size, cell proliferation, and crypt fission in the rat colon. Cell proliferation and crypt fission are controlled independently. Am J Pathol. 151, 843-852 (1997).
- Femia, A. P., Dolara, P., Caderni, G. Mucin-depleted foci (MDF) in the colon of rats treated with azoxymethane (AOM) are useful biomarkers for colon carcinogenesis. Carcinogenesis. 25, 277-281 (2004).
- Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1. Exp Toxicol Pathol. 55, 91-106 (2003).
- Goodlad, R. A., et al. Inhibiting vascular endothelial growth factor receptor-2 signaling reduces tumor burden in the ApcMin/+ mouse model of early intestinal cancer. Carcinogenesis. 27, 2133-2139 (2006).
- Mandir, N., Englyst, H., Goodlad, R. A. Resistant carbohydrates stimulate cell proliferation and crypt fission in wild-type mice and in the Apc(Min/+) mouse model of intestinal cancer, association with enhanced polyp development. Br J Nutr. 100, 711-721 (2008).