15.14: PCR
Genel bakış
Polimeraz zincir reaksiyonu veya PCR, DNA segmentlerini kopyalamak için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Üstel amplifikasyon nedeniyle, PCR sadece birkaç saat içinde milyonlarca veya milyarlarca DNA kopyaüretebilir. Bir PCR reaksiyonunda, ısıya dayanıklı bir DNA polimeraz enzimi, termocycler adı verilen otomatik bir makinenin içindeki bir dizi sıcaklık değişimi yle orijinal DNA'yı güçlendirir.
PCR Moleküler Biyolojide Devrim Yapan Çok Yönlü Bir Yöntemdir
Kary Mullis 1983 yılında PCR'yi geliştirdi ve 1993 yılında Nobel Kimya Ödülü'ne layık görüldü. Bir DNA dizisini kopyalamanın nispeten hızlı, ucuz ve hassas bir yolu olan PCR, moleküler klonlama, gen mutagenezi, patojen tespiti, gen ekspresyonu analizi, DNA kantitasyonu ve dizilemesi ve genetik hastalık tanısı gibi çok sayıda uygulama için paha biçilmez bir araç haline gelmiştir.
PCR Reaksiyon Döngüsü
PCR hücrelerde oluşan doğal DNA çoğaltma işlemini taklit eder. Reaksiyon karışımı kopyalanacak bir şablon DNA dizisi, astar adı verilen bir çift kısa DNA molekülü, deoksinükleotid trifosfat (dNTP) adı verilen serbest DNA yapı taşları ve özel bir DNA polimeraz enzimi içerir.
PCR yüksek sıcaklıklarda bir dizi adım içerir, bu tür sıcaklıklarda işlevsel bir DNA polimeraz enzim gerektiren. En sık kullanılan DNA polimeraz Taq polimeraz, Thermus aquaticusadını , polimeraz başlangıçta izole edildi bakteri. DNA polimeraz bir DNA molekülünü sıfırdan sentezleyemiyor, ya da de novo. Bunun yerine, DNA polimeraz kısa DNA molekülleri ekler, astar denilen, tamamlayıcı baz eşleştirme yoluyla DNA şablonuna bağlamak. Astarlar, DNA polimerazın yeni dNTP'ler takabileceği 3' hidroksil grubu sağlar. Bir PCR'de dört tip dNTP vardır, DNA molekülündeki her nükleotit için bir tane: dATP, dCTP, dGTP ve dTTP.
Her PCR döngüsü üç adımdan oluşur: Denatürasyon, Annealing ve DNA Sentezi.
- Denatürasyon. PCR döngüsü, reaksiyon karışımının yüksek bir sıcaklığa ısıtılmasıyla başlatılır ve DNA çift sarkının iki iplikçik halinde ayrılmasına neden olur. Bu "erime" işlemi genellikle 90°C-100°C sıcaklıkta gerçekleşir.
- Tavlama. Reaksiyon karışımı hızlı bir şekilde soğutularak (genellikle 50°C-65°C'ye kadar), iki astarın şablon DNA iplikçiklerindeki tamamlayıcı dizilerine bağlanmasını sağlar.
- DNA Sentezi (Primer Uzantısı). Reaksiyon karışımı bu kez tekrar ısıtılır, bu kez DNA polimerazın şablon iplikçikteki bazlarla eşleşen dNTP'ler ekleyerek astarları genişletmesini sağlayan bir sıcaklığa (genellikle 60°C-75°C) kadar.
Tipik bir PCR termocycler meydana gelen bu üç adım, 20-40 tekrarlanan döngüleri içerir. DNA moleküllerinin sayısı her döngüde iki katına çıktığı için, DNA katlanarak yükseltilir.
PCR sınırlamaları
Eğer bilim adamı genomun belirli bir bölümünü güçlendirmek istiyorsa, bilim adamı uygun astarları tasarlamak için hedef DNA dizisinin en azından bir kısmını bilmelidir. Bir diğer potansiyel sorun da astarların kısmen benzer DNA dizilerine özgü olmayan annelikleri dir. Bu sorun, reaksiyon koşulları optimize edilerek kontrol edilebilir. Son derece hassas bir algılama yöntemi olan PCR, kontaminasyona karşı da savunmasızdır ve dna'nın kirlenmesi bile yanıltıcı sonuçlara neden olabilir. PCR'de kullanılan DNA polimerazlar hatalara yatkın olabilir. Eğer bir mutasyon ilk birkaç döngü içinde gerçekleşirse, güçlendirilmiş DNA'nın çoğu mutasyonu taşıyacaktır.