Gen Klonlaması (Moleküler Klonlama)
Prof. Dr. Mustafa Arda
Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi
Temel Mikrobiyoloji 1
01. Genel Bilgiler
02. Gen taşıyan DNA (veya RNA')nın Elde Edilmesi
03. Genin Yerinin Belirlenmesi
04. Genin Çıkarılması
05. Vektör DNA'nın Elde Edilmesi
06. Gen DNA'sının Vektör DNA'sı ile Birleştirilmesi
07. Rekombinant Plasmid DNA'sının Alıcı Hücreye Aktarılması
08. İstenilen Geni Taşıyan E. coli 'lerin Seçimi (Seleksiyon)
09. Gen Ürününün Kontrolü
01. Genel Bilgiler
Rekombinant DNA teknolojisinin başlıca uygulama yöntemleri arasında gen klonlamasının önemi ve yeri çok fazladır. Hatta, esasını oluşturur. Gen klonlaması, basit olarak, bir genin identik kopyalarının elde edilmesi veya bir bireyden orijin alan identik projeni gruplarının oluşturulması olarak tanımlanabilir. Bir tek bakterinin uygun katı besi yerinde üreyerek milyonlarca identik nesil oluşturması ve gözle görülebilecek koloni meydana getirmesi de buna örnek verilebilir. Ancak bu tanım, bugün biyoteknolojide, aşağıdaki tarzda uygulamaya konulmaktadır. Önemli bir ürünün (veya proteinin) sentezini kodlayan genin ait olduğu hücre (prokaryotik veya ökaryotik) genomundan (veya kromozomundan) özel yöntemlerle (genellikle, restriksiyon endonukleaz enzimleri ile) kesilerek çıkarılması, bunun bir taşıyıcı (vektör) DNA'sı ile birleştirilerek alıcı bir hücreye (prokaryotik veya ökaryotik) transfer edilmesi, bu alıcı hücrede genin ekspresyonunun sağlanmasıdır.
Gen klonlamasının genel şeması yandaki şekilde gösterilmektedir.
Yukarıda kısaca tarif edilen klonlamanın olumlu sonuç verebilmesi, konu üzerinde çalışanların bilgi, becerisi ve kullanılan yöntemlere bağlıdır. Birçok aşamalardan oluşan teknoloji, bu basamakların uyumlu işbirliği ile gerçekleştirilir.
Gen klonlamasında önemli olan aşamalar kısaca şöyledir (genel prensipler).
1) Gen taşıyan DNA'nın (veya RNA) saf olarak elde edilmesi,
2) Genin yerinin belirlenmesi,
3) Genin çıkarılması,
4) Taşıyıcı (vektör) DNA'nın elde edilmesi,
5) Gen DNA'sının vektör DNA'sı ile birleştirilmesi,
6) Oluşan rekombinant vektör DNA'nın alıcı hücreye aktarılması,
7) Seleksiyon,
8) Gen ürününün kontrol edilmesi.
02. Gen taşıyan DNA (veya RNA')nın Elde Edilmesi
Klonlamanın ilk ve önemli aşamasını oluşturan bu kısımda, istenilen ürünün iyi tarzda sentezini kodlayan geni içeren prokaryotik (veya ökaryotik) hücre genomunun (DNA veya RNA) saf ve bol olarak elde edilmesi yer almaktadır. Ayrıca, gen bankalarından da yararlanılabilir.
İstenilen geni taşıyan hücre bakteri ise, bu mikroorganizma katı kültür ortamlarında üretilerek, tür özelliklerini tam olarak gösteren tek bir koloni seçilir ve bunun sıvı ortamda saf kültürü yapılır. Sonra, logaritmik üreme döneminde kültür santrifüje edilerek çöktürülür, tortu birkaç kez yıkanır ve bir süspansiyon elde edilir. Bu süspansiyon özel yöntemlerle (kaynatmak, alkali ile muamele, SDS, vs.) lize edilir. Ayrıca, lizozim, proteinaz, RNaz, SDS, tris ve EDTA karışımı da kullanılarak, hücre duvarı, sitoplasmik organeller, ribosom ve proteinlerin giderilmesi sağlanır. Sonra, ekstrakt pürifiye (etanol, kloroform) edilerek saf DNA süspansiyonu elde edilir. Aynı amaç için diğer yöntemlerden biri de seçilebilir.
DNA diğer hücre komponentlerinden daha kolay ve saf separe edilebilir. Çünkü: DNA'nın kendine özgü bir kimyasal yapısı ve fiziksel özellikleri vardır.
Şöyle ki:
1) Bakterilerde kromozom uzunluğu oldukça büyüktür. Örn., E. coli 'de kromozom 1.1 - 1.4 mm uzunluktadır. 2) DNA, fiziksel ve kimyasal muamelelere oldukça dirençlidir. Halbuki, diğer hücre komponentleri daha duyarlıdırlar ve kolayca tahrip olurlar.
3)DNA diğer hücre komponentlerinden daha fazla dansiteye sahiptir. DNA'nın bu özel karakterleri, hücre ekstraktlarından da daha kolay ayrılmasını ve pürifiye edilmesini sağlar. Özellikle, alkolde iplik görünümünde bir yumak oluşturması ve cam çubuğa yapışması, ekstraktlardan kolayca ayrılmasına yardımcı olur.
Bakteri DNA'sında intron bulunmadığı için, genleri kullanmak daha kolay olmasına karşın ökaryotik hücre DNA'sında intronların varlığı bunların doğrudan kullanılmasına engel teşkil etmektedir. Bu dezavantajları gidermek için, hücrelerdeki olgun mRNA'lardan yararlanılır. Çünkü, bunlarda intron bulunmamakta ve sadece kodlayan eksonlardan oluşmaktadır. Revers transkriptase enzimi yardımı ile cDNA'ya çevrilerek kullanılırlar.
Plasmid DNA'sı hazırlamak için de, sitoplasmasında plasmid içeren konak hücre (bakteri) uygun koşullarda üretilerek, kolonilerden saf sıvı kültürler elde edilir. Bu sıvı kültürleri, bakteri içinde plasmid replikasyonunu artırmak için, 300 mikrogram / ml spectinomycin veya 150 mikrogram / ml chloramphenicol ilave edilerek 16-20 saat etkide bulundurulur. Sonra, yukarıda bakteride bildirilen işlemler aynen uygulanarak bakteriler lize edilir ve bunlardan plasmid ve bakteri DNA'sı ekstre edilerek alınır. Sonra, içinde Cesium chloride ve Ethidium bromide bulunan bir tüpe konarak santrifüje edilir. Bu işlemin sonucunda kromozomal DNA üstte plasmid DNA altta toplanır. Buradan plazmid DNA'sı toplanarak alınır. Eğer daha fazla plasmide ihtiyaç varsa, tekrar bunlar, CaCI2 ile permeable hale getirilmiş E. coli 'ye transfer edilir ve fazlaca üretimi sağlanır veya yeterli ise denemelerde kullanılır. Plasmid DNA'sı elde etmede ve saflaştırmada başka yöntemlerden de yararlanılabilir.
Bazı plasmidler de (pUC serisi) çok çabuk ürediğinden büyük bir sorun ortaya çıkarmazlar.
Viruslara ait genetik materyal (DNA veya RNA) hazırlamak için bir çok basit veya komplike yöntemler bulunmaktadır. Araştırıcılar kendilerinin olanak ve tecrübelerine göre en uygununu seçmek durumundadırlar. Önemli olan nokta, virusların bol ve saf olarak elde edilmesidir. Bu amaçla, virus süspansiyonlarına, etrafındaki protein tabiatındaki kapsidi veya, zarflı viruslarda da zarfı gidermek için bazı kimyasal maddelerin ve solüsyonların katılmasıdır.
Genellikle, DNA ve RNA viruslarında, viruslar santrifugasyonla klasifiye edildikten sonra, tüpteki süspansiyona SDS, Proteinaz K, fenol, kloroform, isopropanol, izoamil alkol, etanol, EDTA gibi bazı kimyasal maddeler ilave edilerek viruslar etrafındaki protein tabakasından kurtarılarak sadece DNA veya RNA'lar elde edilebilir.
Bakteriyofajlar için de saptanmış benzer yöntemlerden birinden yararlanılır.
Genler her zaman genomik DNA veya RNA da bulunmadığı göz önüne alınarak, gerekli durumlarda hücre içindeki mRNA'dan da aynı derecede yararlanılabilir.
Ökaryotik hücrelere ait genlerin elde edilmesi de yine benzer fakat özel yöntemler kullanılarak DNA'ları ekstre edilir ve saflaştırılır. Sonra, RE'lerden uygun olanlarından biri ile kesilerek gen taşıyan segmentler elde edilir ve bunlar klonlamada kullanılırlar.
Not: Bakteri, virus, plasmid, faj vs. DNA'larını saf olarak elde edebilmek için bir çok prosedür hazırlanmış ve pratiğe konulmuştur. Bunlardan birinin seçimi ve kullanılması araştırmalara bağlıdır.
03. Genin Yerinin Belirlenmesi
Her ne kadar genin yerinin belirlenmesi mümkünse de, klonlamada genellikle, istenilen geni taşıyan DNA'nın (veya kısa segmentlerinin) saf bir süspansiyonunun hazırlanması, amacı gerçekleştirmede yeterli olabilmektedir.
Genlerin elde edilmesinde ve yerlerinin saptanmasında bazı yöntemlerden yararlanılır. Bunlar da kısaca şöyledir:
1) İn vitro sentez: Eğer istenilen gen ürünü bir protein ise ve yapısı (amino asit sayısı, türü ve sırası) biliniyorsa, bu proteini kodlayan DNA sekanslarını belirleyerek in vitro koşullarda sentezini sağlamak mümkündür. Bu tarzda elde edilen DNA segmenti, klonlamada başarı ile kullanılabilir. Örn., insülin ve somatostatin hormonlarını kodlayan genlerin in vitro sentezleri gibi.
Bu yöntem başarılı olmasına karşın zaman alıcı ve masraflıdır. Çok miktarda amino asit sayısına sahip olan proteinleri kodlayan DNA segmentleri, ayrı ayrı sentezlendikten sonra birleştirilirler. Son yıllarda, özel aletler (DNA sentetizerler) yardımı ile istenilen uzunlukta DNA sekansları kolayca sentez edilebilmektedir.
2) Hibridizasyon yöntemleri: Bu teknikler daha ziyade gen taşıyan DNA sekanslarının yerlerini belirlemede kullanılmaktadırlar. En fazla yararlanılan yöntemler şunlardır:
a) Southern blot hibridizasyonu: Bu teknikte, materyallerden elde edilen ve bir RE ile kesimi yapıldıktan sonra oluşan saf DNA segmentlerinin agarose jel elektroforezde seperasyonu yapılır. Agarose jelden sonra nitroselüloz filtresine transfer edilerek burada, işaretli (32P, biotin) problar kullanarak hibridizasyon sağlanır ve otoradiografik veya renk oluşumuna göre genin yeri belirlenir. Konu üzerinde ileriki bahislerde ayrıntılı bilgi verilmektedir.
Yeri saptanan DNA segmenti, agarose jel üzerinden çıkarılarak klonlamada kullanılır.
b) Northern blot hibridizasyon: Bu yöntemde, agarose jel üzerine RNA separe edilerek işlemler aynen Southern blotta olduğu gibi devam ettirilir. Hibrid molekülleri ortaya koymada da işaretli DNA veya RNA problarından yararlanılır.
3) İstenilen genler her zaman DNA üzerinde değildir. Genetik materyal olarak RNA taşıyan viruslarda, genler RNA da bulunurlar. Böyle durumlarda tek iplikçik viral RNA saf olarak elde edildikten sonra, buna revers transkriptaz (RT) enzimi ile tek iplikcikli komplementer DNA (cDNA) sentezlenir. Bu RNA-DNA kompleksinden RNA çıkarıldıktan sonra, bu cDNA iplikçiğine de Pol. I enzimi yardımı ile ikinci bir cDNA sentezlenerek çift iplikcikli DNA molekülü haline çevrilir. İşlemler, Southern blot tekniğindeki gibi yürütülür.
Bazı durumlarda, geni, DNA'dan değil de, bunun bir komplementeri olan ve hücre içinde sentezlenen mRNA'dan yararlanılabilir. Bu durumda mRNA'ya komplementeri olan çift iplikcikli DNA sentezlenir.
Yukarıda bahsedilen ve genin yerinin belirlenmesi ve izolasyonuna yönelik çalışmalar oldukça uzun, zaman alıcı ve bazen de başarısız olabilmektedir. Bu nedenle, pratikte daha etkin olan basit uygulamalar kullanılmaktadır. Şöyle ki, bir RE ile kesilerek çeşitli boylarda DNA segmentleri elde edildikten sonra klonlama işlemine geçirilir ve gen taşıyan bakteri kolonileri seleksiyonla seçilerek saf olarak üretilir ve genin ekspresyonu araştırılır. Aşağıda bu teknik izah edilmektedir.
04. Genin Çıkarılması
DNA'larında istenen geni taşıyan bakteriler üretildikten ve DNA'ları çıkarıldıktan sonra saflaştırılır ve bir süspansiyon elde edilir. Bu DNA süspansiyonu bir (veya gerekirse iki) restriksiyon endonukleaz ile muamele edilerek DNA'lar değişik boylarda olmak üzere çok sayıda segmente bölünür. Doğaldır ki bu kadar çok sayıda segment (genomik DNA fragmenti) arasında istenilen (hedef) geni taşıyan sayısız sekans bulunacaktır. Elde edilen DNA fragmentleri, ayrı ayrı uygun vektörle bağlandıktan sonra klonlanır. Agar üzerinde oluşan koloniler, istenilen gen (hedef gen) yönünden teker teker incelenirler.
Aracı moleküllerle (vektör DNA'sı ile) birleşecek olan segmentler, vektörlerin (plasmid, faj, fajmid, cosmid, vs.) bakteri içindeki üremesini engellemeyecek bir boyutta ve en önemlisi de iyi eksprese olması gereklidir. Bu nedenle, vektörle birleşen her DNA segmentinde istenen gen bulunmadığı gibi, gen içeren çok büyük veya küçük segmentler de vektörlerle birleşseler bile, bakteriye girmeyebilir veya girse bile eksprese olmayabilirler.
Klonlamada yararlanılan bazı restriksiyon endonukleazlar bakteri genomunda kesme yaptıktan sonra oluşan segmentlerin uçları bir birinin komplementeri olup yapışkan bir özellik taşırlar (yapışkan uçlar, cohesive ends). Oluşan bu serbest uçlar tekrar birleşebilir ve sirküler bir durum alabilirler (resirkularizasyon). Bu özelliğe, vektör DNA'sında da rastlanır. Her RE'nin kesiş yeri farklı olduğu gibi oluşturduğu yapışkan uçların baz sıraları ve sayıları da değişiktir.
Gerek bakteriye ait DNA segmentlerinin ve gerekse vektör DNA'sının kendi aralarında tekrar birleşmesi, rekombinant DNA molekülü elde etmede güçlükler yaratmakta ve gen segmentinin vektörle birleşmesini önlemektedir. Bu olumsuz duruma mani olmak için bazı metotlardan yararlanılır.
Eğer genomik DNA (bakteri kromozomu), EcoRI enzimi ile kesilmişse, kesik yerlerin uçlarında birbirinin komplementeri olan ve kolayca birleşen iki yapışkan uç meydana gelir. Bu durum aşağıda gösterilmiştir (EcoRI için).
EcoRI enzimi DNA da 6 bazlık bölgeden ve G/A arasından karşılıklı (asimetrik) olarak keser. Eğer segment 6 bazdan çok uzunsa, tam bir kopma gerçekleşemez. Buna benzer durum aynı enzimle kesilen vektör DNA'sında da oluşur.
Resirkülarizasyonu önlemek için bazı yöntemlerden yararlanılır. Bunlardan bazıları çok kısa olarak belirtilmiştir.
1) Kopolimer (homopolimer) ile kullanılması: EcoRI, (PstI, Hind III, vs. gibi) ile kesilerek oluşturulan yapışkan uçlar, enzimatik (Nukleaz S1) yöntemlerle kesilerek çıkarılır ve küt uçlar oluşturulur. Bu uçlara 3'-uçlarına, kopolimer segmentler (poli G veya poli C gibi) ilave edilerek DNA segmentlerinin her iki ucunda birbirleriyle birleşmeyen poli G(GGGG....G) veya poli C(CCCC...C) uçları meydana gelir. Aynı segmentin her iki ucunda poli C veya sadece G olursa bu segmentler resirkülarize olamaz. Çünkü, poli C'lar birbirinin komplementeri değildir. Kopolimer segmentleri ilave etmede terminal nukleotid transferaz (terminal transferaz) enziminden yararlanılır.
Küt uçlara homopolimer ilavesinin genel aşamaları yandaki şekilde gösterilmektedir.
Burada önemli olan nokta, genomik hedef gen sekanslarının 3'- uçlarına poli G ilave edilmişse, vektör DNA'ya poli C ilave edilir (her iki ucuna).
Bazı durumlarda, yapışkan uçlar giderilmeden de kopolimer segmentler ilave edilebilir ve resirkularizasyon önlenebilir. Yapışkan uçların kapatılması, bu uçların kalıp olarak kullanılması ile gerçekleştirilir.
Yapışkan uçlara homopolimer ilavesinin genel aşamaları yandaki şekilde gösterilmektedir.
Her iki tarzda, eğer genomik DNA segmentleri için poli G'ler (veya poli C'lar) kullanılmışsa, aynı enzimle kesilen vektör DNA uçlarında bu sefer C (veya poli G ler) kullanılarak, vektör DNA'sı ile genomik DNA segmentleri arasında birleşme sağlanır. Bu uçlar birbirlerinin komplementeridirler.
2) Alkaline fosfotase kullanılması: Yapışkan uçları gidermede dana intestinal alkaline fosfotase enzimi, bakteriyel alkaline fosfotase enzimine, tercih edilmektedir. Bu enzim DNA segmentinin iki ucundaki fosfat moleküllerini (5'-P) çıkararak resirkularizasyonu önler. Bu enzimle sadece vektör DNA muamele edilir, genomik DNA segmentlerine uygulanmaz. Çünkü, bunlarda bulunan 5'-P ucu birleşme için yeterlidir.
3) Spesifik linkerlerin kullanılması: Çalışmanın amacına uygun olarak, Hae III, Bal I, HpI, vs. gibi enzimlerin biri ile kesilerek oluşturulan küt uçlara (veya yapışkan uçlar çıkarılarak meydana gelen küt uçlara) sentetik çift iplikcikli oligonukleotidlerden oluşan spesifik linkerler (adaptör moleküller) ilave edilir. Ancak, bu moleküllerin yapışkan uç oluşturacak enzimlerden biri için (Örn., EcoRI, PstI, Hind III, vs.) spesifik kesim bölgelerine sahip olması gerekir. Bu nedenle de EcoR1 linkeri, PstI linkeri, vs. gibi isimler ile anılırlar. Bu linkerler ilave edildikten sonra, kendine ait RE ile kesilerek yapışkan uç meydana getirilir, gerekirse benzer işlem vektör DNA'da da yapılabilir.
Küt uçlara spesifik linker ilavesi yandaki şekilde gösterilmektedir.
4) İki ayrı RE ile kesim: Yukarda açıklanan yöntemlerden ayrı olarak, bir enzim yerine, yapışkan uç oluşturan iki ayrı enzim de kullanılabilir. Şöyle ki, vektör DNA, Hind III ve Bam HI ile kesilince, vektör DNA'sının bir ucunda Hind III ve diğer ucunda da Bam HI'e ait yapışkan uçlar meydana gelir. Bu uçlar birbirinin komplementeri olmadığı için birleşemezler. Aynı işlem, genomik DNA segmentleri için de uygulanır. Bunlar da kendi aralarında birleşemezler. Bu aşamadan sonra, vektör DNA segmentleri jel elektroforezine tabi tutularak büyük segmentler çıkarılır ve genomik DNA segmentleriyle birleştirilirler.
İki farklı restriksiyon endonukleaz enzimi ile kesim ve transfer aşamaları yandaki şekilde gösterilmektedir.
Eğer denemede, vektör olarak pBR322 plasmidi kullanılmışsa tetr geni hem Hind III ve hem de Sal I ile kesilince genden bir küçük segment koparılır. Böylece gen inaktive olur. İşte, vektörün geride kalan büyük segmentinin uçlarında farklı yapışkan uçlar olacağından birleşme de (resirkularizasyon) olamaz. Elektroforezden sonra, bu büyük segmentler, çıkarılarak in vitro koşullarda genomik DNA segmenti ile birleşmeye tabi tutulur. Çünkü, bu da iki enzimle kesilerek hem Hind III ve hem de Sal I'e ait yapışkan uçlara sahiptir.
5) Küt uçların kullanılması: Olanaklar yetersiz olduğu durumlarda küt uçlar, DNA ligaz enzimi ile birleştirilmeye çalışılabilir. Ancak, çok zayıf bir birleşme olur ve bu işlem zaman alıcıdır. Onun için küt uçlar pek kullanılamazlar.
6) Çok sayıda genomik DNA segmenti ve vektör DNA kullanarak da resirkularizasyon riski azaltılabilir.
05. Vektör DNA'nın Elde Edilmesi
Yukarıda açıklandığı tarzda hazırlanan genomik DNA segmentleri ile vektör DNA'sı birleşecek duruma getirilir. Diğer bir ifade ile her iki DNA uçlarında karşılıklı birleşmeye elverişli yapışkan uçlar sağlanır. Eğer genomik DNA'da Hind III kullanılmışsa, vektör DNA'da da aynı RE, yani Hind III, kullanılmalıdır.
RE'ler, büyük olan genomik DNA üzerinde çok sayıda kesim yerlerine sahiptir. Bu nedenle, değişik boylarda çok sayıda DNA segmentleri meydana gelebilir. Durum, vektör DNA'ları için de benzeridir. Ancak, bazı RE'lerin vektör DNA üzerinde hiçbir kesim yerine sahip olmamasına karşın, diğerlerinin 1, 2, 3.... çok sayıda kesim yeri olabilir ve vektör DNA'da değişik boyda segmentler oluşabilir. Rekombinant DNA molekülü elde etmede, vektör DNA'da sadece bir kesim yerine sahip olan RE'ler (Örn., Hind III. Sal I, Pst I, vs.) tercih edilir. Bu enzimler vektör DNA'yı kestiklerinde hem yapışkan uçlar meydana getirirler ve hem de sirküler vektör DNA'sını sadece açarlar. Herhangi bir parça koparıp çıkarmazlar.
Vektörlerde bulunan antibiyotik rezistenslik (ampr, tetr, vs.) genlerinden biri RE ile kesilerek ayrılır ve bunun içine yabancı gen aktarılarak gen inaktive edilir.
Genomik DNA'da bir RE ile kesimde, çok sayıda kesim yeri olduğundan, değişik boylarda ve fazla miktarda DNA segmentleri meydana gelecektir. Prokaryotik veya bir ökaryotik tek bir hücre genomunda istenilen gen veya klonlanması arzu edilen hedef gen, genellikle, bir tanedir. Bu da RE ile kesimde meydana gelen DNA segmentlerinden birinde bulunur. Ancak, klonlamada tek bir hücre genomu değil de milyarlarca hücre DNA'sı kullanıldığına göre, milyarlarca hedef gen taşıyan genomik DNA segmenti ve bunun da yüzlerce (hatta binlerce) katı sayıda istenilen geni taşımayan (ancak, diğer genleri taşıyan) fragmentler oluşacaktır. Bu nedenle, genomik DNA (gen DNA'sı) ile vektörün birleşmesini garantilemek için, birleşme işlemi aşamasında çok sayıda vektör kullanmak gerekecektir. Eğer vektör olarak plasmid kullanılacaksa, bunun da uygun metotlarla sayısının çok artırılmasına çalışılmalıdır.
Birleşme aşamasında kullanılacak vektörün amaca uygun olarak seçilmesi ve iyi yöntemlerin kullanılması uygun sayıda hibrid DNA'sı elde etmek için gereklidir. Vektörlerde bazı spesifik markerlerin (ampr, tetr, kanr, lac+, vs.) bulunması, istenilen geni taşıyan kolonileri bulmada büyük yardımcı olurlar. Klonlamada doğal plasmidler yerine suni plasmidlerden daha çok yararlanılır.
06. Gen DNA'sının Vektör DNA'sı ile Birleştirilmesi
Yukarıda belirtildiği tarzda ve saf olarak hazırlanan genomik DNA segmentleri ile vektör DNA (eğer plasmid ise) 37°C - 40°C'de birlikte 3-5 dakika inkubasyona bırakılır. Böylece, karşılıklı yapışkan uçların birleşmesi sağlanır. Yapışkan uçları birbirine bağlamada, ortama, DNA ligaz enzimi de ilave edilir ve birleşme sağlamlaştırılır. DNA ligaz enzimi bu işlevini, DNA'nın bir ucundaki 5'-P ile diğer DNA'nın 3'OH ucu arasında fosfodiester bağları kurarak gerçekleştirir.
Bu birleşmenin gerçekleşmesi için alternatif yöntemler de bulunabilir. Gerekirse onlar da denenebilir.
Araştırıcılar, kendi deneyimlerine, bilgilerine ve olanaklarına göre en uygun ve etkili olanını seçebilirler.
Bu işlem sonunda birleşen moleküller (rekombinant plasmid) oluşabileceği gibi resirkularizasyon nedeniyle birleşmeyen genomik DNA segmentleri ve plasmid DNA'sı da meydana gelebilecektir. Ayrıca, plasmidle sadece genomik DNA segmenti değil, ortamda çok sayıda bulunan diğer genleri taşıyan veya taşımayan ve uygun uzunluktaki segmentler de birleşebilirler.
07. Rekombinant Plasmid DNA'sının Alıcı Hücreye Aktarılması
Vektör olarak plasmidlerin (pBR322, pUC, vs.) kullanıldığı durumlarda alıcı hücre olarak ta bu plasmidlerin ait olduğu uygun konakcı E. coli (veya eğer plasmid bir basile ait ise, alıcı hücre de, uygun bir basil olmalıdır. Örn., pUB110 plasmidi B. subtilis 'e aittir), seçilerek kullanılır.
Vektör ve genomik DNA segmentleri birleşmesinden oluşan konjugat, yeteri miktarda konakcı E. coli ile birlikte bulundurulduktan sonra, içinde uygun bir sıvı besi yeri ve Ca+2 iyonları bulunan erlenmayere transfer edilirler. E. coli 60-90 dakika kadar 37°C'de üretilir. Ortama katılan CaCI2 E. coli 'nin yüzeyini, sirküler plasmid DNA'sı için geçirgen hale getirir ve rekombinant plasmid kolayca bakteriye transfekte olur (transfeksiyon).
Bu inkubasyon sırasında başlıca 4 durum meydana gelebilir.
1) Hiçbir plasmid içermeyen E. coli 'ler,
2) Resirkülarize olmuş plasmid içeren E. coli 'ler (bunlarda istenen gen sekansları yoktur. Ancak ampr, tetr genleri sağlam olarak bulunur),
3) İstenilen gen sekanslarını içermeyen plasmidli E. coli 'ler (bunlar diğer gen sekanslarını veya özel gen taşımayan sekansları içerirler),
4) İstenilen gen sekanslarını içeren plasmidli E. coli 'ler.
E. coli ile rekombinant plasmid DNA'sı (pBR322) uygun ısıda bırakılırsa yaklaşık 60 dakikalık bir inkubasyondan sonra erlenmayerde milyarlarca mikroorganizma meydana gelecektir. Ancak, yabancı genlerin E.coli 'ye girme oranı 10-8 - 10-9 arasındadır. Bu bakımdan çok fazla mikroorganizma kullanılmalı ve çok iyi bir seleksiyon yapılmalıdır.
Denemede kullanılan alıcı suş E. coli 'de rezistenslik faktörleri taşıyan hiçbir plasmid bulunmamaktadır. Bu nedenle de amp ve tet’e duyarlıdır ve bu nedenle de her iki antibiyotiği ayrı ayrı veya birlikte içeren besi yerinde üremezler.
08. İstenilen Geni Taşıyan E. coli 'lerin Seçimi (Seleksiyon)
İstenilen geni taşıyan plasmidli E. coli kolonilerini diğerlerinden ayırmak, gen aktarma tekniğinin en önemli bir aşamasını oluşturur. Bunu sağlamak için,
1) Koloni seleksiyonu: Sıvı ortamda üretilen Saf E. coli kültüründen içinde amp ve tet içeren yarı katı besi yerlerine ayrı ayrı ekilir ve üretilirler.
a) Eğer E. coli içine hiç plasmid girmemişse, bu E. coli 'ler her iki ortamda da üreyemezler. Çünkü, dirençlilik genleri almadıklarından ve kendisinde de bulunmadığı için bir koloni oluşturamazlar (madde 1).
b) Eğer E.coli içine rezirkülarize olmuş plasmid girmişse, böyle E.coli her iki ortamda da üreyebilir. Çünkü, plasmiddeki genler aktif durumda olduğu için E. coli 'ye dirençlilik kazandırır ve amp ve tet'li ortamlarda üremesini sağlar (madde 2).
c) İstenmeyen gen sekanslarını içeren E. coli 'ler, sadece, aktif olan geni (ampr geni) taşıdıklarından ve tetr geni de inaktive olduğundan, ampisilinli ortamda üreyebilirler (madde 3).
d) İstenilen geni taşıyan E.coli 'ler de aynen (c) de belirtildiği, ampisilinli ortamda ürer, tetrasiklinli besi yerinde üreyemezler.
Bu durum karşısında, ampisilinli ortamda üreyip te, tetrasiklinli ortamda üreyemeyen kolonilerden biri seçilerek saf olarak üretilir ve deneme bir defa tekrar edilir (ekimler replica plating tarzında yapılır ve koloni seçimi ampisilinli ortamdan yapılır). Durum aynı ise, seçilen koloni saf olarak üretilir ve E.coli 'ler içinde istenilen genin var veya yok olduğu araştırılır.
Vektör DNA olarak pUC8/9 plasmidinden yararlanılmış ve bu plasmidin laktoz geni (beta galactosidase) RE ile kesilerek buraya yabancı gen yerleştirilmişse, bu genin aktivitesi ortadan kalkar. Eğer, böyle bir konjugat (kimerik plasmid) taşıyan E. coli, ampisilin ve Xgal (5-bromo -4chloro -3-indolyl -beta- D- galactopyronoside) içeren ortama aktarılırsa, E.coli ler ürer ancak, enzim sentezlenemediği için Xgal'ı ayrıştıramaz ve kolonilerin etrafı renksiz olarak görülür. Bu tür koloniler (lac, ampr) seçilir ve saf olarak üretilir. Eğer beta galactosidase geni sağlamsa, inaktive olmamışsa, sentezlenen enzim, Xgal'ı ayrıştırarak koloni etrafında mavi renk meydana getirir (lac+, ampr dirençli koloniler).
Ancak, her iki tür plasmidle yapılan böyle çalışmalarda da, istenilen gen ile diğer yabancı gen veya DNA sekanslarını taşıyan plasmidli E. coli 'leri birbirinden ayırmak oldukça güçtür. Kolonilerin teker teker ve saf olarak üretilip genin ekspresyonu kontrol edilmelidir ki bu da oldukça zahmetli ve zaman alıcı bir işlemdir. Bunun yerine,
2) Koloni hibridizasyonu: Tetrasiklinli ortamda üremeyip te ampisilinli besi yerinde üreyen kolonilerden saf kültür yapıldıktan sonra, kültürden bir agarın yüzeyinde düzgün ve uygun aralıklarla nokta tarzında ekimleri yapılır. Uygun bir ısı ve süre inkubasyona bırakıldıktan sonra, kolonilerin iyi gelişmesi sağlanır. Sonra kolonilerin üzerine bir filtre kağıdı değdirilir ve koloniler simetrik olarak kağıda geçirilir. Kağıt 0.5 N NaOH ile muamele edilerek, bakterilerin denatürasyonu (iki iplikcikli DNA'nın tek iplikcikli hale dönüştürülmesi) sağlanır. Tek iplikçikler kağıda fikse edildikten sonra, üzerine radyoaktif (32P) tek iplikçik cDNA veya RNA prob ilave edilir ve bir süre bekletildikten sonra (hibridizasyon için) prob ile komplementer olan bakteri DNA tek iplikçiği birleşir ve çift iplikcikli radyoaktif DNA segmenti oluşur (hibridizasyon). Bundan sonra, üzerine X-ışınlarına duyarlı film kapatarak, radyoaktivitenin filme etkilemesi sağlanır (Otoradyografi). Film üzerindeki radyoaktif bölgeler siyah lekeler halinde görülür. Bu bölgelerde istenilen gen DNA'sı olduğundan, agar üzerinde yeri belirlenir ve koloniler alınarak istenilen gen yönünden incelenirler.
Koloni hibridizasyon tekniği yandaki şekilde göstrilmektedir.
3) Dot blot hibridizasyonu: Bakterilerde plasmidin aranmasında, işaretli problar kullanılarak dot blot hibridizasyon yönteminden yararlanılabilir.
4) İstenilen geni taşıyan plasmidin saptanmasında plasmid DNA profil testi kullanılabilir.
5) İmmunolojik yöntemle saptama: Bakteriye yeni aktarılan genin ekspresyonu sonu sentezlenen gen ürünü protein (antijen) immunolojik yöntemlerle ortaya konulabilir.
a) Eğer, gen ürünü protein, bakteri içinde kalıyorsa ve dışarı çıkamıyorsa, bu zaman gen ürününe karşı tavşanlardan elde edilen antikorlar (monoklonal antikor daha duyarlıdır) 32P ile işaretlenir. Agar üzerinde üremiş ve kloroform buharına tutularak lize edilmiş mikroorganizmalar buradan nitroselüloz kağıtlarına aktarılır ve fikse edilir. Mikroorganizma içinde bulunan gen ürünü proteinler (antijenler) de kağıt üzerinde fikse edilirler. İşaretlenmiş antikorlar, bu proteinler üzerine yayılarak birleşmesi (antijen-antikor reaksiyonu) sağlanır. Otoradyografi ile, birleşen yerler, siyah lekeler halinde ortaya çıkarlar.
b) Gen ürünü proteinler hücrelerden dışarı çıkıyorsa, agar jel diffüzyon yönteminden yararlanılabilir. Agara, gen ürününe karşı hazırlanmış antikorlar katıldıktan sonra, açılan deliklere mikroorganizma ekstraktları konur. Uygun bir inkubasyon süresi sonunda antijen içeren deliklerin etrafında oluşan presipitasyon çizgilerine göre değerlendirme yapılır.
c) Bakteri ekstraktları ile, ELISA ve RIA gibi teknikler de kullanılarak genin eksprese olduğu ve istenen gen ürününü sentezinin sağlandığı ortaya konabilir.
09.Gen Ürününün Kontrolü
Bakteri içinde, veya aynı zamanda dışa salgılandığı durumlarda filtratlardan, gen ürünü saptandığı hallerde aktivite, saflık, zararsızlık, yan etkileri vs., etkinliklerinin dikkatlice incelenmesi gerekmektedir. Bakteri içinde veya filtratlarda bulunan gen ürünleri, bakterilere ait endo- ve ekzo proteinlerle, toksin veya toksik substanslarla, enzimlerle, metabolitlerle, vs. yabancı ve zararlı maddelerle kontamine olabilirler. Bu nedenle gen ürününün bunlardan ayrılması ve saf olarak elde edilmesi (pürifikasyon) gereklidir. Bunun ilk aşamasını klonlamada kullanılan mikroorganizmaların iyi seçilmesi oluşturur. Ayrıca, bakteri içinde bulunan endoenzimler ve dışa salgılanan ekzoenzimler (hidrolitik enzimler) sentezlenen gen ürünü proteinini hidrolize ederek ayrıştırabilir ve etkinliğini bozabilirler. Bazen de gen ürünü, bakteri için toksik olabilir.
Elde edilen ürünlerin, kobay, fare veya tavşanlarda toksisite testleri, yan etkileri ve etkinliği de araştırılır.Ayrıca, antijenik yeteneği de çeşitli immunolojik yöntemlerle belirlenir ve gerekli diğer kontrolleri de yapılır. Sonra çeşitli metotlarla saflaştırılır ve dozu ayarlanır.
[1] Kaynak : Temel Mikrobiyoloji