Wright'ın leke temeli, malzemeleri, tekniği ve kullanımları
Wrigth'in lekesi Amerikalı patolog James Homer Wright tarafından 1902'de Romanowsky'nin lekesinden yaratılan bir renklendirme tekniğidir. Romanowsky'nin lekeleri dengesiz olduğu için, Wrigth solvent ve fiksatif olarak metanol kullandı.
Bu renklenme polikromatiktir, yani boyanın emdiği yapıya bağlı olarak birkaç renk ürettiği anlamına gelir. Bu boyama tekniği, diferansiyel beyaz kan hücresi sayımı yapmak ve periferik kan ve kemik iliğinde kırmızı kan hücrelerinin, trombositlerin ve lökositlerin morfolojisini incelemek için yaygın olarak kullanılmıştır..
Kanın farklı hücre hatlarında anormallikler görülebildiğinden, lösemi veya bakteriyel veya paraziter enfeksiyonlar gibi hastalıkların teşhisini kolaylaştıran, uygulaması çok önemlidir..
Belki de bunlar, bu tekniğin kullanıldığı en yaygın uygulamalardır, ancak bunlar sadece onlar değildir. Aynı zamanda, burun akıntısı, fekal mukus, balgam, deri gibi diğerlerinin yanı sıra kan ve kemik iliği dışındaki örneklerde de faydalıdır..
indeks
- 1 Wright'ın lekesinin temeli
- 2 Malzemeler
- 2.1 Hazırlık
- 2.2 Tamponlu tampon çözeltisi
- 2.3 Renklendirmeyi gerçekleştirmek için gereken ek malzemeler
- Wright leke 3 Bileşenleri
- 3.1 Metanol
- 3.2 Amortisör
- 3.3 Eosin (Y)
- 3.4 Metilen mavisi
- 4 Tekniği
- 5 Yardımcı Program
- 5.1 Hematoloji
- 5.2 Nazal Salgı
- 5.3 Parazitoloji
- 5.4 Solunum yolu enfeksiyonları
- 5.5 Bakteriyoloji
- 5.6 Mikoloji
- 6 Wright'ın boyamasıyla kan örneğinin yapıları nasıl gözlenir??
- 7 İyi boyama için öneriler
- Wrigth boyamada 8 yaygın hata
- 8.1 Çok soluk boyama
- 8.2 Renklendiricinin çökeltileri
- 8.3 Aşırı kırmızımsı veya mavi renklenme ile lekelenme
- 9 Depolama modu
- 10 Kaynakça
Wright'ın leke temeli
Wright'ın boyaması, bir asit boyadan (eozin Y) ve bazik bir (metilen mavisi) ve oksidasyon ürünlerinden oluşan bir metil alkol çözeltisinden oluşan Romanowsky'nin lekesinden doğdu..
Wright'ın boyamasında kullanılan boyaların karışımı, Romanowsky diye bilinen etkiye neden olur, yani, lökositlerin çekirdeklerine ve nötrofilik granüllere güzel bir mor renklenme sağlarken, kırmızı kan hücreleri pembe renkle boyanır..
Wright boyasının tipik renk aralığını vermekten sorumlu olan bileşenler mavi B ve eozin Y'dir. Gözlenen etki, boyaların kimyasal yapılara bağlanmasına ve mavi B ve eozin Y etkileşimlerine bağlı olacaktır..
Nükleik asitler, nükleer proteinler ve bazı hücre tiplerinin reaktif olgunlaşmamış sitoplazması gibi asidik yapılar, mavi B'yi (bazik boya) sabitler..
Hemoglobin gibi temel yapılar, bölünmüş eozinofillerin granülleri, diğer hücresel yapılar arasında, eozin Y'yi (asit boya) sabitler..
Lekelenmenin sonucu, Wright boyasının pH'ı, tampon ve yıkama çözeltisi gibi farklı faktörlerden etkilenebilir; yanı sıra boyama ve sabitleme süresi.
Bu nedenle, reaktiflerin hazırlanmasındaki her adım çok önemlidir ve her ayrıntı dikkate alınarak yapılmalıdır..
malzemeler
Wright boyama. 100 mL için gereklidir:
0.3 gr Wright boya tartılır, 97 ml metanol ve 3 ml gliserol ölçülür.
hazırlık
Bir harçta, ağır miktarda Wright'ın boyasını yerleştirin ve toz tamamen çözülene kadar yavaş yavaş gliserolü ekleyin..
Daha sonra metanol ilave edilir, karıştırılır ve amber renkli bir şişeye dökülür..
Çözeltiyi kullanmadan önce hafif hareketlerle ve filtre ile çalkalanmalıdır..
Tamponlanmış tampon
Bir litre damıtılmış su içinde, 3.76 g disodyum hidrofosfat (Na2HPO4 2H20) artı 2.1 gr potasyum dihidrojen fosfat (KH)2PO4).
Kullanılan tüm reaktifler çözülene kadar iyice karıştırın. PH'ı 7,2'ye ayarlayın. Bir cam kavanozun içine dökün ve oda sıcaklığında tutun.
Renklendirmeyi gerçekleştirmek için gereken ek malzemeler
Ek olarak, renklendirme tekniğini uygulamak için başka malzemeler de gereklidir, bunlar: nesneleri veya örtüleri taşıyan tabakalar, renklendirme köprüsü, yıkama için su veya tampon ile pisetalar, renklendirme zamanlarını almak için bir kronometre ve bazı kurutma malzemeleri (emici kağıt, gazlı bez veya pamuk).
Wright leke bileşenleri
metanol
Alkol (metanol) slayta bulaşan kanın fiksatörü olarak işlev görür.
Temel olarak indirgeyici bir reaktif, kurutucu ve pıhtılaştırıcı fiksatiftir. Bu nedenle, işlevi proteinleri pıhtılaştırmak ve çözünmez hale getirmektir, ancak bunları denatüre etmeden.
Metanol, tüm laboratuarlarda lekeleri gidermek için en yaygın kullanılan reaktif maddedir, çünkü etanol ile elde edilenlerden daha iyi sonuçlar verir. İdeal konsantrasyon% 99.
Amortisör
Tampon (tamponlu çözelti), boyanın pH'ını ayarlama veya sürdürme işlevine sahiptir, çünkü 7.2'ye ayarlanmış bir pH, hücre yapılarının boyaları doğru bir şekilde emmesi için zorunludur..
Öte yandan, metanol fiksasyonunun geçişi hücreleri kurutur ve tampon onları tekrar hidratize etmeye yardımcı olur.
Eosin (Y)
Eosin, bazik bileşenler için bir afiniteye sahiptir, çünkü bir asit boyasıdır. İki tip eozin birbirine çok benzer, bu nedenle ikisinden biri kullanılabilir ve aynı sonucu elde edilir..
Biri eozin Y, sarı eozin veya tetrabromofloreserin ve diğer eozin B, mavimsi eritrosin B veya dibromodinitrofloresin olarak adlandırılır. Ancak, en yaygın kullanılan eozin Y'dir.
Bu boyanın en önemli özelliği negatif kutupsallığıdır, bu da hücresel yapılar tarafından pozitif yük çekmesini sağlar.
Metilen mavisi
Temel renklendirmedir. Başlıca özelliği metakromazyadır, yani bütün yapılar aynı renkte boyanmaz, renklendirdiği yapıların kimyasal bileşimine bağlıdır.
Bazıları açık veya koyu maviye, bazıları ise koyu mor veya soluk lilaya dönüşecek.
teknik
1-Numunenin yayılmasını, ince bir filmin slayt veya lamel üzerinde kalması için gerçekleştirin..
2-Havayı yaklaşık 2 saat kurumaya bırakın.
3-Kuru lekeyi, numune yukarı bakacak şekilde boyama köprüsüne veya boyama tepsisine yerleştirin.
4-Tüm yüzeyi kaplayana kadar kağıdı Wright boyasıyla damla damla kaplayın. 5 - 8 dakika bekletin.
5-Boya, kenarlara dökülmeden lamı tamamen kaplamalıdır. Renklendirme süresi boyunca buharlaşmaya başlarsa, ilave damlalar yerleştirilmelidir..
6-Ardından eşit miktarda amortisör ekleyin, karakteristik metalik parlaklık görünene kadar az miktarda üfleyin. 10 ila 15 dakika sürer.
7-Musluk pembesi görünene kadar yumuşak jeti yerleştirerek musluk suyuyla yıkayın.
8-Alkol emdirilmiş bir gazlı bez ile lamın arkasına takılı olan boyayı çıkarın.
9-Daldırma yağını mikroskopta görüntülemek için yerleştirmeden önce lekenin çok iyi kurumasını sağlayın.
yarar
hematoloji
Periferik kan lekelerini bulaşması, kalın kan lekelerini incelemek ve kemik iliği örneklerinden hücreleri incelemek için idealdir..
Bu boya kombinasyonunun kimyasal özellikleri nedeniyle, hücresel yapılar kolayca farkedilebilir ve mevcut farklı hücre türlerini ayırt edebilir..
Burun sekresyonu
Bu teknik, alerjik rinit tanısında burun salgısının hücrelerini (epitel hücreleri, parçalı eozinofiller, polimorfonükleer) tanımlamak için çok faydalıdır..
parazitoloji
Bu anlamda, çalışma için yararlı olmuştur Leishmania sp cilt ülserlerinde deri altı hücresel dokunun histiyositleri içinde. Aynı şekilde, dışkı örneklerinde lökositleri tanımlamak için kullanılır (fekal lökogram).
Bu durumda, doktorun dışkıda bulunan lökositozun polimorfonükleer veya tek çekirdekli olup olmadığını bilmesi ilgi çekicidir. Dışkı lökogramındaki bu bulgu, sırasıyla bakteri veya viral bir enfeksiyon olup olmadığını gösterecektir..
Öte yandan, kanda dolaşan parazitler eritrosit içinde veya plazmada serbest bulunabilir. İstenen parazitler Plasmodium spp, Trypanosoma cruzii ve filarias, ve veteriner hekimlikte Theileria equi ve Babesia caballi, Özellikle atlarda bebeklerin nedensel etkenleri.
Wright ve Giemsa boyaması hemoparazitleri normal hücresel bileşenlerden ayırt edebilir. Bunun için iki tür forma kullanabilirsiniz:
İnce uzanıyor
Kan, slayttaki ince bir film gibi yayılır. Çekirdeğin ve sitoplazmanın özelliklerini ortaya çıkaran Wright boyası ile lekeli.
Kalın damla
Bu metodoloji, daha fazla miktarda kandaki parazitlerin varlığını araştırmak için kullanılır..
Bunun için slayt üzerine büyük bir damla kan damlatılır. Bir kez orada, başka bir sürgünün kenarını kullanarak merkezden dışarı doğru daha büyük ve daha büyük daireler çizerek defibrinlemelisiniz.
Son olarak, kalın yaymada parazitleri gözlemlemek için, eritrositler su ile çözülmelidir.
Solunum yolu enfeksiyonları
Solunum seviyesinde bu teknik de faydalıdır, çünkü balgam örneklerinde, bronşiyal veya bronkoalveolar lavajda bulunan hücreler tanı koymak için önemlidir..
Benzer şekilde, polimorfonükleer hücreler ve mononükleer hücreler burada ayırt edilebilir..
bakteriyoloji
Bu tekniğin bakteriyolojide kullanımı sınırlıdır, çünkü bakterilerin boyanması için iyi değildir, bu nedenle boyanması için diğer özel renklendirme teknikleri kullanılır..
Ancak, dahil etme organları ile epitel hücrelerini aramak için kullanılmıştır Chlamydia trachomatis üretral veya endoservikal mukozanın lekelerinde, bunun için en iyi yöntem olmadığı kabul edilmelidir..
Kırmızı kan hücreleri arasındaki spiral tipte bakterileri gözlemlemek de mümkündür. Borrelia burgdorferi Enfekte hastalarda, hem de morula veya dahil organları Ehrlichia sp kan bulaşmasında lenfosit, monosit veya nötrofil sitoplazmasında.
mantarbilim
Histoplazma capsulatum Wright'ın lekesi ile lekelenmiş, çeşitli doku örneklerinin mikroskobik incelemesi ile sıklıkla teşhis edilen patojenik bir mantardır..
Wright'ın boyamasıyla kan örneğinin yapıları nasıl gözlenir??
İyi boyama için öneriler
Kan örneklerinin uzatılması kendiliğinden havada kurutulmalıdır. Boyalar daha iyi bir fiksasyon elde etmek ve aşırı renklenmeyi önlemek için mümkün olduğunca ince olmalıdır.
Yüksek kalitede boyama için, lekenin hazırlanmasından sonraki iki saat boyunca lekelenmenin yapılması tavsiye edilir. Öte yandan, ideal örnek antikoagülan içermeyen kılcal kandır..
Bununla birlikte, venöz kan kullanılıyorsa, hücre yapılarını deforme edebildiğinden, heparin değil EDTA antikoagulanı olarak kullanılmalıdır..
Hazırlanan renklendiricinin bozulmasını önlemek için kuru yerlerde muhafaza edilmelidir..
Yıkama işlemi sırasında nötr pH'a ayarlanmış su kullanılması tavsiye edilir..
Son olarak, laboratuvarda kullanılan boyama yöntemlerinin her zaman test edilmesi önerilir..
Bu, kalite kontrol olarak numuneleri veya genişletilmiş desenleri boyayarak yapılır. Bu adım önemlidir, çünkü bu lekenin uygun şekilde hazırlanmasını ve renklenme zamanlarının iyi bir şekilde standartlaştırılmasını sağlar.
Desen sayfası çok renkliyse, çözülmesi gereken sorunlar var..
Wrigth renklendirmesinde sık karşılaşılan hatalar
Çok soluk boyama
Genellikle çok kısa boyama süresi veya çok abartılı bir yıkamadan dolayı çok soluk lekeler. Boya ile temas süresinin uzatılması veya yıkama süresinin azaltılması ile düzeltilir..
Boya çökeltileri
Lekede boya çökeltilerinin varlığı birkaç nedene sahip olabilir, ancak en sık nedenleri şunlardır: süzülmemiş boya kullanımı, düzensiz renklendirme köprülerinde lekelenme, toz veya gresli kirli tabakalar kullanmak, iyi bir yıkama yapmamak Boyama bitirmek.
Çok kırmızımsı veya mavi renkle lekelenme
Tampon, renklendiricinin pH'ından sorumludur. Belirtilen (asit) 'in altında pH değerine sahip boyalar çok kırmızı lekelere neden olur.
Boyanın pH'ı (alkalin) üzerindeyse, aşırı mavimsi bir leke elde edilir..
Depolama modu
Reaktif oda sıcaklığında saklanmalıdır.
referanslar
- Gutiérrez V. Honduras'ın San Pedro Sula kentinde Ehrlichiosis canina tanısı için Wright boyama yöntemi ile Elisa testi arasındaki karşılaştırmalı çalışma. 2008. Veteriner Hekimliği Unvanına Başvurulacak Derece Tezi. San Carlos de Guatemala Üniversitesi.
- López-José L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña S, Cerón-González G, Franco-Cendejas F. Mikrobiyoloji laboratuvarında temel boyama. Engellilik Araştırmaları. 2014; 3 (1): 10-18.
- "Wright'ın lekesi" Vikipedi, özgür ansiklopedi. 18 Mayıs 2018, 12:05 UTC. 8 Ara 2018, 20:37
- Calderón A, Cardona J, Vergara Ó. Frekansı Babesia spp. montería, Córdoba (Kolombiya) 'nın atlarında. Rev. udcaactual sapkınlık. 2013; 16 (2): 451-458.
- Forbes B, Sahm D, Weissfeld A (2009). Bailey & Scott'un mikrobiyolojik tanısı. 12 ed. Arjantin. Panamericana S.A Editörden.
- Retamales E, Mazo V. Halk Sağlığı Enstitüsü Şili Hükümeti. Kan sayımı okumak için kan lekelerinin lekelenmesi için öneriler.