Tarihi figürlerin yer aldığı kaotik müze gecelerinin Müzede Gece'de hayat bulmasının ardından Larry Daley ( Ben Stiller ), Night in Museum 2'de yeni arkadaşlarına veda etmek zorunda. Tüm sergiler, en son teknolojiye, yani sanal hologramlara, dünyanın en büyük müzesi olan Washington'daki Smithsonian'a gönderilmelidir. Ancak 24 saat sonra bile Larry, eski müze parçalarından birinden bir çağrı almıyor: Kovboy Jedadiah ( Owen Wilson ), ona, karakterleri gece canlandıran Ahkmenrah'ın tabletinin de yanlışlıkla Washington'a gönderildiğini bildirdi ve şimdi onunla bütün müze geceleyin orada alt üst oluyor.Larry, kötü firavun Kahmunrah'a ( Hank Azaria ) ve dostları İmparator Napolyon'a, Al Capone'ye ve Korkunç İvan'a bir son vermek için aceleyle Washington'a gider. Bu macerada, havacılığın çekici öncüsü Amelia Earhart'tan ve yine canlanan ve kargaşayı kontrol altında tutmaya çalışan Başkan Teddy Roosevelt ( Robin Williams ) gibi eski arkadaşlarından enerjik destek alıyor.