Ceyda Sönmez - Moleküler Biyoloji ve Genetik, Temel Bilimler Fakültesi, Gebze Teknik Üniversitesi
Başlangıçtan itibaren insanlar ebeveynlerin kendine özgü özelliklerini torunlarına aktarılabileceğinin farkındaydılar. Bu konuyla ilgili ilk spekülasyonlar eski Yunan öğrencileri tarafından kaynaklandı ve teorilerin bazıları yüzyıllar boyunca devam etti. 1850'lerin başlarında, Avusturyalı bilim insanı Gregor Mendel'in yeşil bezelyeler ile yaptığı bir dizi deney ile bezelyelere özgü özelliklerin miras kalan izleri gözlemledi ve sonucunda bugün genler olarak bildiğimiz kalıtım birimini tanımladı. Böylece genetik bilimi çalışmalarının temeli atıldı. [1,2]
Genom düzenleme, genomdaki spesifik DNA dizilerinin silinmesini, eklenmesini veya değiştirilmesini içerir. İnsan genomunda bölgeye özgü modifikasyonlar yapma yeteneği, genin kalıtımın temel birimi olarak tanınmasından bu yana genetik çalışmalar için bir amaç haline geldi. Başlarda klasik olarak genetik çalışmalar yalnızca spontane mutasyonların keşfine ve analizine dayanıyordu. Ancak yirminci yüzyılın ortalarında Muller ve Auerbach genetik çalışmalara yeni bir boyut getirdi. İki bilim insanı mutagenez yani genetik bilgide mutasyon sonucu değişikliğin meydana gelme oranının radyasyon veya kimyasal yöntemler ile artırılabileceğini gösterdi. [3,4] Daha sonraki yöntemler, bazı organizmaların genomuna mutasyon miktarının değişmesine yol açabilecek transpozon (zıplayan genler) elementlerinin eklenmesine dayanıyordu ancak bu prosedürlerin tamamı genomdaki rastgele bölgelerde değişiklikler üretti ve hedef gende istenilen değişikliğin yapılmasını sağlayamadı. Ardından 1970 yılında araştırmacılar, genlerin DNA molekülü boyunca önceden belirlenmiş bölgelerden ayrılmasını ve tekrarlanabilir bir şekilde yeniden yerleştirilmesini sağlayan bir dizi enzim keşfettiler. Böylece genomik değişikliklerin hedeflenen gende meydana gelmesi ilk olarak 1970’lerde mayada ve farelerde gerçekleştirildi. [4-6] Bu gibi genetik gelişmeler genetik mühendisliğinin ortaya çıkma senaryosunu hazırlamış ve 1980 yılından itibaren genom düzenlemenin insan yaşamını önemli ölçüde etkileyebilecek çeşitli amaçlar için kullanılabileceği bilim insanları tarafından literatüre kazandırılmıştır. [1,2] Örneğin, mutasyona uğramış genlerin veya bölgeye özgü modifikasyonların düzeltilmesi yoluyla gen iyileştirme olarak bilinen gen terapisiyle çekinik gen bozukluklarının neden olduğu Kistik Fibroz, Hemofili, Kas Distrofisi ve Orak Hücre Anemisi gibi hastalıkların ya da kanser gibi sonradan edinilmiş genetik hastalıkların veya AIDS gibi bazı viral enfeksiyonların tedavisi gerçekleştirilebilir. [2,7] Daha da ilerisi belirli bir genetik bozukluktan sorumlu olan genin ortadan kaldırılmasıyla hastalık tamamen önlenebilir. Ayrıca tarımda bitki DNA'sının manipüle edilmesi, mahsul verimini optimize etmek ve bitki hastalıklarını kontrol etmek için kullanılabilir. Benzer şekilde bakteriyel genomlar, çeşitli endüstriyel uygulamalarda ürün verimlerini artırmak için hassas bir şekilde ayarlanabilir. Bu sebeple uzun yıllardır araştırmacılar geniş bir alan yelpazesindeki sorunları ele almak için kolay ve uygun maliyetli genom düzenleme araçları geliştirmeye çalıştılar. Son olarak, araştırmacıların çabaları DNA'yı neredeyse her lokusta düzenleyebilen sağlam bir moleküler araç olan CRISPR'ın geliştirilmesiyle meyvesini verdi. CRISPR (Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar) teknolojisi yaşam bilimlerinde adeta bir devrimi ateşledi ve birçok laboratuvarda hızla standart bir araç haline geldi.
CRISPR temelde yabancı DNA veya RNA'ya karşı kazanılmış bağışıklık olan prokaryotik bir sistemdir. İlk olarak Escherichia coli'nin genomunda işlevi bilinmeyen tekrardan meydana gelen çok değişken bir dizi olarak keşfedildi ve 2005 yılında, bu değişken dizilerin plazmid gibi yabancı materyallere karşı bir bağışıklık belleği görevi gördüğü anlaşıldı. Ayrıca bu bölgeler araştırılırken CRISPR tekrarlarına komşu bazı genler ortaya çıktı. Bulunan genler CRISPR ile ilişkili genler (Cas genleri) olarak adlandırıldı ve bazı Cas genlerinin viral dizilerin yakalanmasına aracı olurken, diğerlerinin ise istilacı viral genomların bölünmesine ve inaktivasyonuna aracılık ederek onarım mekanizmalarında rol oynadığı tespit edildi. [8] CRISPR / Cas sistemleri sırasıyla birden fazla Cas proteini kompleksi ve tek bir büyük Cas proteini içeren Sınıf 1 ve Sınıf 2 olarak sınıflandırılır ve ayrıca çeşitli alt türlere ayrılır. [9]
CRISPR/Cas mekanizması şu şeklide gerçekleşir: İstilacı genetik materyali tanımlar, onu küçük parçalara böler ve kendi DNA'sına entegre eder. Aynı ajan tarafından ikinci bir enfeksiyonda, CRISPR lokusunun transkripsiyonu gerçekleşir. RNA işlenmesinin ardından Cas proteinleriyle kompleksler oluşturan küçük RNA fragmanları (crRNA'lar) ikinci defa istila eden ajanı tanır ve yok eder. [8] Bu doğal mekanizmaya dayalı olarak CRIPSR tekniği, herhangi bir organizmanın genomunun hedefe özgü DNA dizilerinin düzenlenmesini sağlayacak şekilde geliştirilmiştir. En yaygın kullanılan tip II CRISPR / Cas9 sistemi çift sarmallı DNA'nın bölünmesinden sorumlu olan nükleaz (Cas9), kompleksi hedefe yönlendiren bir RNA kılavuzu (guide RNA) ve hedef DNA’yı içerir. [10,11]
Kılavuz RNA, hedef DNA ile birleştiğinde Cas-9 proteini bu kompleksi tanır ve DNA çift sarmalının bölünmesine sebep olur. Homolog bir DNA (donor DNA) varlığında ise onarımına aracılık eder. Bu sürecin sonunda istenilen gen inaktif edilebir(knock-out), belirli bir dizinin genoma entegrasyonu sağlanabilir(knock-in) veya alellerin yer değiştirmesi gerçekleşebilir. Bu alandaki son çalışmalara örnek olarak Kaliforniya Üniversitesi ve Utah'daki araştırmacılar orak hücre anemisine neden olan hemoglobin geninin mutasyonunu düzeltmede başarılı oldular. Orak hücre anemisi taşıyıcıları olan hastalardan CD34 + hücreleri izole edildi, CRISPR-Cas9 tarafından düzenlendi ve 16 hafta sonra mutasyona uğramış genin ekspresyon seviyelerinde bir azalma meydana geldi. [13]
Diğer tekniklerle karşılaştırıldığında sadeliği ve hassasiyeti nedeniyle CRISPR/Cas9 sistemi genetik düzenlemeyi destekleyen çok yönlü ve en yaygın kullanılan araç konumundadır. [14,15] İki bilim kadını Almanya Berlin Max Planck Patojen Bilimi Bölümü'nden Emmanuelle Charpentier ve ABD Kaliforniya Üniversitesi'nden Jennifer A. Doudna tarafından keşfedilen bu araç, temel araştırmalarda birçok önemli keşfe katkıda bulundu. Bu sebeple Charpentier ve Doudna 7 Ekim 2020'de İsveç Kraliyet Bilimler Akademisi tarafından verilen Kimya 2020 Nobel Ödülü'ne layık görüldüler.
CRISPR yöntemiyle beraber çağ atlayan genom düzenlemedeki çalışmalar genetik manipülasyondaki gelişmelerin etkisiyle model organizmalar üzerindeki çalışmalardan evrimsel çalışmalara, gıda organizmalarının iyileştirilmesine ve tıbbi uygulamalara kadar geniş bir alanda etkisini göstermeye hızlı bir şekilde devam etmektedir. Özellikle genetik hastalıkların potansiyel tedavi yöntemi olarak düşünüldüğünde gelecek için pek çok vaatte bulunmaktadır. Hatta önümüzdeki 5 yıl içinde biyomedikal inovasyonun en önemli alanları arasında olması beklenen insan genom düzenlemesi şimdiden biyoloji ve tıp alanında ses getiren çalışmalara imza atmaktadır.
Referanslar
Friedmann T. A brief history of gene therapy. Nat Genet. 1992;2(2):93-8. Review
Misra S. Human gene therapy: a brief overview of the genetic revolution. J Assoc Physicians India. 2013;61(2):127-33. Review.
Rothstein RJ. One-step gene disruption in yeast. Methods Enzymol. 1983;101:202–11.
Scherer S, Davis RW. Replacement of chromosome segments with altered DNA sequences constructed in vitro. Proc Natl Acad Sci USA. 1979;76:4951–5.
Smithies O, Gregg RG, Boggs SS, Koralewski MA, Kucherlapati RS. Insertion of DNA sequences into the human chromosomal beta-globin locus by homologous recombination. Nature. 1985;317(6034):230–4
Thomas KR, Folger KR, Capecchi MR. High frequency targeting of genes to specific sites in the mammalian genome. Cell. 1986;44:419–28.
Ginter EK. [Gene therapy of hereditary diseases]. Vopr Med Khim. 2000; 46(3):265-78. Review. Russian.
Marraffini LA, Sontheimer EJ. CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea. Nat Rev Genet. 2010;11(3):181-90. Review.
Cho S, Shin J, Cho BK, (2018). “Applications of CRISPR/Cas System to Bacteial Metabolic Engineering” Int J Mol Sci 19(4): 1089
Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 2012;337(6096):816-21.
Cong L, Ran FA, Cox D, Lin S, Barretto R, Habib N, et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 2013;339(6121):819-23.
Şekil1: CRISPR/Cas9 sistemi. Ekim 2020 tarihinde https://innovativegenomics.org/education/digital-resources/what-is-crispr/ adresinden erişildi.
DeWitt MA, Magis W, Bray NL, Wang T, Berman JR, Urbinati F, et al. Selectionfree genome editing of the sickle mutation in human adult hematopoietic stem/progenitor cells. Sci Transl Med. 2016;8(360):360ra134.
Vieira GV, Cecílio NT, Arruda LM, Sales KU. Visão geral do mecanismo básico de ação. In: Pereira TC, organizador. Introdução à técnica de CRISPR. Ribeirão Preto: Cubo; 2016. Cap. 2. p. 54.
Gori JL, Hsu PD, Maeder ML, Shen S, Welstead GG, Bumcrot D. Delivery and Specificity of CRISPR/Cas9 Genome Editing Technologies for Human Gene Therapy. Hum Gene Ther. 2015;26(7):443-51. Review.