Dijital PCR Nedir, Nasıl İşlev Görür?
PCR’nin en önemli uygulaması ya DNA’yı çoğaltmak, nicelendirmek ya da aynı reaksiyonda her ikisini birden yapmaktır. Konvansiyonel PCR’de, ilgilenilen DNA, birden fazla kopyasını almak için amplifiye edildi çünkü tek veya çift DNA molekülü aşağı akış analizleri için yeterli değildir. Bununla birlikte, geleneksel PCR kullanılarak gen ölçümü mümkün değildir, bu nedenle gen ekspresyonu ve nükleik asit ölçümü, geleneksel PCR ile yapılamaz.
Nükleik asit, viral yük ve patojen miktarının belirlenmesi için gerçek zamanlı termocycler adı verilen gelişmiş bir PCR makinesine ihtiyaç vardır. Floresan kimyası kullanılarak bir numunede bulunan nükleik asit miktarı kantitatif PCR ile ölçülebilir. Floresan boya veya hidroliz probu kullanılarak, göreceli miktar tayini, gen ekspresyonu, mikroRNA çalışmaları ve patojen yük ölçümü için gerçek zamanlı PCR’de yapılabilir.
Gerçek zamanlı PCR artık sitokinlerin kantifikasyonu için altın standart bir yöntemdir ve hatta TB tespiti için en güvenilir kantifikasyon makinesidir. Yine de, gerçek zamanlı PCR’nin çeşitli sınırlamaları nedeniyle, nükleik asidin kantifikasyonu için gelişmiş, sağlam ve daha doğru bir yönteme ihtiyaç vardır. Gerçek zamanlı PCR’yi kullanarak bilim adamları, bir numunede bulunan DNA veya RNA miktarını tahmin edebilir. Bununla birlikte, reaksiyon hazırlığı sırasında kullanılan büyük hacim nedeniyle, istenmeyen nükleik asitlerin miktarının belirlenmesine de yol açabilir. Buna ek olarak, fazlalık çok büyük olmasa da birkaç molekülün miktarı belirlenmez. Bu sorunun üstesinden gelmek için dijital PCR icat edilmiştir. Dijital PCR ilkesi, bir numuneyi daha küçük mikro hacimlere bölerek mutlak nicelendirmesine dayanır. Numuneyi daha küçük bir hacme bölmenin genel fikri, o mikro hacimde bulunan tek bir molekülü ölçmektir, böylece ölçümün kesinliğini arttırır.
Dijital PCR Nedir?
Dijital PCR Nedir, Nasıl İşlev Görür?Genellikle dPCR veya dePCR olarak bilinen dijital PCR, gDNA, cDNA veya RNA’nın mutlak ölçümü için kullanılır. 1999 yılında, Bert Vogelstein ve Kenneth Kinzler, kanser mutasyonlarının nadir genotiplerini analiz ederek “dijital PCR” yi keşfetmiştir. Dijital PCR kavramı 1992’de Sykes ve arkadaşları tarafından çıkarılmıştır. Yöntem, nadir alellerin tespiti ve nokta mutasyonlarının tespiti için sıklıkla kullanılmaktadır. Ayrıca, NGS sırasında klonal amplifikasyonda kullanılır.
Nükleik asidin kantifikasyonu için mevcut altın standart yöntem, floresan kimyasına dayanan gerçek zamanlı PCR’dir. Hidroliz bazlı floresan prob veya DNA interkalasyon boyası nükleik asit miktarının belirlenmesinde kullanılır. Özetle, floresan etiketli prob, diziye bağlandığı bir numunede tamamlayıcı ipliğini bulduğunda, hidrolize prob, makine tarafından tespit edilen floresan yaymaktadır. Katmanlı boya bazlı yöntemde, floresan boya yalnızca dsDNA’ya bağlanır ve floresan yayar. Yayılan floresan miktarı makine tarafından ölçülür. Ancak, “geleneksel qPCR” uygulaması standartlar gerektirmektedir. Standartlar, numuneyi ölçmek için temel olarak kullanılır, ayrıca numune hacminin aynı miktarda olması gerekir.
Buna ek olarak, çoğullama kantifikasyon testini gerçekleştirmek uzmanlık gerektirmektedir. Çoklama tahlillerinin gerçekleştirilmesi, rekabetçi tahlil doğası nedeniyle kolay bir iş değildir. Gerçek zamanlı PCR, nadir alellerin veya heterojen örneklerin saptanmasında genellikle uygulanamaz çünkü iki örnek arasındaki kantifikasyon sınırı 2 kattır. Bu problemler, bir numuneyi mikro hacimlere bölerek dijital formattaki toplam DNA molekül sayısını sayan dijital PCR adı verilen yeni nesil nükleik asit kantifikasyon yöntemi kullanılarak aşılır. Dijital PCR’nin iş akışı benzerdir, qPCR aynı reaktifleri ve benzer ısıl döngüleyici koşullarını kullanır. Kimya, saptama için floresan moleküllerin kullanımına dayanır (qPCR ile aynı). PCR reaksiyonunun hazırlanmasında dNTP’ler, primer seti, PCR reaksiyon tamponu, şablon DNA, Taq DNA polimeraz ve diğer PCR güçlendiriciler kullanılır.
Dijital PCR Prensibi
Kantitatif PCR’de, ilk PCR döngüleri üstel değildir, bu nedenle nükleik asit doğru bir şekilde nicelendirilemez. DPCR’de, PCR reaksiyon karışımı hazırlandıktan sonra, PCR reaksiyon karışımı (şablon DNA ile birlikte), ayrı ayrı damlacıklar halinde ayrı PCR reaksiyonunun meydana geldiği binlerce daha küçük damlacıklara bölünmüştür.
İşleme modu, floresan (Damla PCR için PCR reaksiyonu: dNTP’ler, sıcak başlangıç DNA polimeraz, MgCl2, optimum reaksiyon tamponu, primerler, floresan prob ve söndürücü probları).etiketli prob DNA’ya bağlandığında makine tarafından ölçülen ışığı yaydığı için gerçek zamanlı PCR’ye benzemektedir. Her mikro hacimli reaksiyonda (damlacık), amplifikasyon miktarı ve nükleik asit moleküllerinin sayıları Poisson dağılım yöntemi kullanılarak ölçülür. Şablonsuz damlacık tarafından yayılan floresan “0” olarak adlandırılır ve bir taban çizgisi veya hesaplama için sıfır olarak kullanılır (PCR-negatif reaksiyon). Damlacığın tek bir şablonla yaydığı floresan miktarı “1” olarak adlandırılır ve tek olarak kaydedilir (PCR-pozitif reaksiyon).
Hedef DNA’nın mutlak ölçümü, her damlacıkta yapılan pozitif ve negatif reaksiyon sayıları kullanılarak Poisson dağılımı yöntemi kullanılarak yapılır. PCR reaksiyonu bölümlendirme yapıldıktan sonra, polimerizasyon son noktasına kadar ilerler. Reaksiyon damlası üretme makinesi, bir numuneyi 20.000’den fazla nano çöp büyüklüğünde damlacıklara böler. Bu nedenle, DNA’nın miktarını belirlemek için referans, kalibrasyon eğrisi veya endojen kontrol gerekmez. DPCR’de, reaksiyon karışımı, mikro hacimli reaksiyon başına yalnızca bir veya sıfır hedef molekül bulunabilecek şekilde daha küçük mikro hacimli reaksiyonlara bölünür.
Son hesaplamada, toplam pozitif reaksiyon sayısı (1 şablona sahip), bir numunenin orijinal hacminde bulunan toplam hedef DNA sayısına eşittir. Toplam hacmin mutlak konsantrasyonu, bu denklem kullanılarak hesaplanır:
Mutlak konsantrasyon = sayılan toplam şablon DNA sayısı / her damlacıkta ölçülen toplam hacim (veya kuyucuk veya mikro hacimli reaksiyon).
DPCR yöntemi, floresan boya etiketli probun şablona tamamlayıcı olarak kullanıldığı TaqMan kimyasına dayanır. Dye FAM (floresan boya), HEX raportör boyayla birlikte kullanılır. Örnek bölme oluşturma yöntemleri; yağ emülsiyonu, mikro oyuklu plakalar, akışkan olmayan yonga ve kılcal damarlar.