İntronların Keşfi
Moleküler klonlamadan önce, ökaryot hücrelerdeki m-RNA sentezi hakkında çok az bilgi vardı. Ancak, bu olayın ökaryotlarda bakteride olduğundan daha karmaşık olduğu açıktı. Ökaryot m-RNA’larının sentezi, hem transkripsiyona hem de primer transkriptlerin yapısını değiştiren işleme reaksiyonlarına gerek duymaktaydı. Daha da önemlisi ökaryot m-RNA’ları öncelikle çekirdekte bulunan uzun primer transkriptler olarak sentezleniyor ve daha sonra da sitoplazmaya ihraç edilen, çok daha kısa m-RNA moleküllerine kesiliyor gibiydi.
Bu işleme basamaklarının genel olarak primer transkriptlerin 5’ ve 3’ uçlarından dizilerin çıkarılmasıyla ilişkili olduğu düşünülüyordu. Bu modelde, uzun primer transkriptlerde bulunan m-RNA’lar bölünmemiş DNA dizileri tarafından kodlanıyorlardı. Bu ökaryot m-RNA görüşü birbirinden ayrı olarak Berget, Moore ve Sharp, Louise Chow, Richard Gelinas, Tom Broker ve Richard Roberts tarafından kesilip eklenmesinin tanımlanmasıyla önemli derecede değişti. Kesip ekleme mekanizmasını bulan iki araştırma grubu, insan hücrelerinde m-RNA sentezini araştırmak için temel avantajı, konak hücreden çok daha basit bir model oluşturması olan adenovirus 2’yi kullandı. Viral DNA virus partiküllerinden direkt olarak izole edilebilir ve viral yapısal proteinleri kodlayan m-RNA’lar o kadar yüksek miktarlarda bulunur ki, enfekte hücrelerden direk olarak saflaştırılabilir. Berget, Moore ve Sharp deneylerini, hekson adıyla bilinen bir viral yapısal polipeptiti kodlayan ve çok miktarda bulunan bir m-RNA üzerine odakladılar. Viral genomda hekson m-RNA’sını haritalamak için saflaştırılmış m-RNA adenovirus DNA’sına hibridize edildi ve hibrid molekülleri elektron mikroskobuyla incelendi. Beklendiği şekilde hekson m-RNA’sının ana kısmı adenovirus DNA’sının daha önce hekson geni kapsadığı gösterilmiş kesim fragmanlarıyla hibridler oluşturdu. Ancak şaşırtıcı şekilde, hekson m-RNA’sının 5’ ucundaki diziler, mesajın ana kısmını kodlayan DNA dizilerine komşu dizilerle hibridize olmadı ve bu da m-RNA’nın 5’ ucunun viral genomda başka yerlerde bulunan dizilerden kaynaklandığını düşündürdü. Bu olasılık hekson m-RNA’sının hekson geninin yukarısında uzanan bir kesim fragmanına hibridizasyonu ile test edildi. Bu deneyde oluşan m-RNA-DNA hibridleri karmaşık bir ilmik yapısı oluşturdular. m-RNA’nın ana kısmı daha önceden tanımlanmış hekson DNA dizileriyle uzun bir hibrid bölgesi oluşturdu. Çarpıcı olan, hekson m-RNA’sının 5’ ucunun, DNA’nın, birbirinden ve mesajın temel kısmından, büyük tek iplikçikli DNA ilmiklerle ayrılan, üç kısa yukarı bölgesine hibridize olmasıydı. Hekson m-RNA’sının 5’ ucundaki diziler böylece, viral genomun üç ayrı bölgesinden transkribe oluyordu ve bunlar da, uzun primer transkriptin işlem görmesi esnasında m-RNA’nın ana bölümüne ekleniyordu.
Adenovirüs m-RNA’sında kesip-ekleme işleminin bulunmasını, hemen hücresel m-RNA deneyleri takip etti ve ökaryotik genlerin önceden beklenmeyen bir yapıda olduğu gösterildi. Kodlanan diziler sürekli değildi, aralarında intronlar mevcuttu ve bunlar kırpılma ile primer transkriptlerden çıkarılıyordu. Artık intronların, ökaryot genomdaki DNA’nın büyük kısmını oluşturduğu bilinmektedir ve intronların evrim ve gen ifadesinin düzenlenmesindeki rolleri, aktif araştırma konularıdır. Kesilip-eklenme işleminin bulunması; bu beklenmeyen RNA işleme reaksiyonunun mekanizması konusunda da büyük ilgi uyandırdı. Bu çalışmalar hem gen ifadesinin düzenlenmesi için yeni mekanizmaları ortaya çıkarttı, hem de RNA’nın yeni katalitik faaliyetlerini gösterdi ve evrimin erken dönemlerinin kendi kendini çoğaltan RNA molekülleriyle olduğu hipotezini destekleyen çok önemli deliller sundu. Adenovirus m-RNA’larının beklenmeyen yapısı böylece hücresel ve moleküler biyolojinin farklı alanlarında büyük bir etki yaptı.
Kaynak: Cooper, G., M., Hausman, R., E., (çev. Meral Sakızlı, Neşe Atabey). (2006). Hücre, İzmir Tıp Kitabevi, İzmir.