PREPARAT BOYAMA TEKNİKLERİ VE BOYALAR
Belki de alınmamaktadır. Negatif boyamada yapıların şekilleri boyanın penetre olrnasından değil boya ile çevrelendiğinden gösterilmektedir. Bazen boyalar yenir. Daha kusursuz olarak, boya reaktifleri organizmanın fizyolojik aktivitelerine bağlı olan değişik yollarla canlı hücre içine alınabilir. Bu ise vital boyama ve supra-vital boyama olarak adlandırılır.Daha da genellersek, boya alınımı, boya-doku veya reaktif-doku affiniteleri nedeniyledir. Bazı doku kompenentlerinin bazı boyalar için yüksek bir affiniteye sahip olduğu söylendiğinde, spesifik kullanım şartlarında-kompenent yoğun olarak boyanacaktır. Öte yandan dokuya boyayı bağladığı düşünülen Coulomb, hidrojen bağı ve diğer bağlar gibi çekici kuvvetleri de açıklamak için de kullanılmaktadır. Bu yüzden affinite, bir boya maddesini boya banyosundan bir kesite transfer olma eğiliminin bir ölçümü olarak düşünülebilir ve affinitenin önemi (büyüklüğü), bu prosese eklenen veya engellenen her faktöre bağlıdır.
1-VİTAL BOYAMA
Canlı hücreler, boyama sıvılarındaki ayrışma ile (supra-vital boyama) veya canlı organizma içine boyanın enjeksiyonu ile (intra-vital boyama) boyanabilirler. Bu yöntemler, tespit edilmiş dokudan alınan kesitlere uygulanmaz. Fakat boyanmış kesitlerin karşılaştırılmasında değerli bir kontrol olarak kullanılabilirler. Canlı hücrelerin boyanması için ilk uygulama, önce metilen blue'yu (l887), daha sonra nötral red'i (l894) kullanan Paul Ehrlich' ten gelmiştir. Vital boyamada önce sitoplazmik yapılar ortaya konur. Canlı hücrelerin çekirdek zarı boyalara geçirgen değildir ve canlı çekirdeği boyamak mümkün değildir. Trypan mavisi ile makrofaj sistem hücrelerinin vital boya ile gösterimi, sitoplazmik fagositoza bir örnek oluşturur. Bu boya kolloidaldir. Çini mürekkebi gibi ince süspansiyonlar, Makrofaj Sistemi hücreleri ve diğer hücrelerce fagositik kapasiteleri ile alınmaktadır. Hücresel bileşenlerin gerçek vital boyanması, mitokondrilerin Janus green ile gösterilmesidir.
2-SEÇİLEN ÇÖZÜNURLUKLE BOYAMA
Su, hücrenin her tarafında geniş olarak dağıldığı için sulu boyalar uygun değildir ve boyama çok gevşek olacaktır. Dokularda çözünen maddeler ''Lysochrom'' lar olarak bilinmektedir. Hemen hemen tüm lysokromlar lipidde çözünür ve doku kesitlerinde lipidlerin gösterimi için histolojide kullanılırlar. Yağ damlacıkları, eğer boya yağda alkolden daha çözünürse, alkolik solusyonlardaki (sıklıkla % 70' lik) boyalarla seçici olarak renklenirler. Solusyonla başarılı histolojik boyama esas olarak yağ boyaları ile sınırlandırılmıştır ve lysokromlar, parlak renkli, lipidlerde yüksek çözünür olmalı ve seçilen tercihli çözünürlükler hariç diğer hücresel yapıların hiçbirine affinitesi olmamalıdır.
3-DOKULARDAKİ RENKLİ MADDELERİN KİMYASAL URUNLERİ İLE BOYAMA
Bazı boyama yöntemlerinde, doku kompenentleri ile reaksiyona girip renkli maddeler üretecek soluk veya renksiz solusyonlar kullanılır. Bu reaksiyonların sonunda oluşan renkli ürünler ya gerçek boyalar veya boya olmayan renkli kimyasal ürünlerdir.
Birinci gruba örnek olarak PAS reaksiyonunda kullanılan Schiff reaktifi ve Feulgen reaksiyonu verilebilir. Saman renkli veya renksiz solusyon, dokulardaki aldehitlerin varlığı ile mor renge dönüşür. Histokimyasal reaksiyonların ikinci grubu renkli olan fakat bir boya olmayan final ürününe sahiptir. Reaksiyona örnek olarak demirin gösteriminde kullanılan Perls' reaksiyonu verilebilir. Potasyum ferrosiyanid, potasyum ferric ferrosiyanid (prusya mavisi) oluşturmak için demir iyonları ile birleşir (+3 değerlikli Fe). Bu basit bir kimyasal reaksiyondur. Ürün olan Prusya mavisi bir boya değildir ve boya olarak kullanılmaz. Fakat görülebilen, koyu boyanmış çözünmeyen bir birikimdir. Dokuların böylesi renklendirilmesinin bir diğer değişik tipi enzim histokimyasında görülmektedir. Enzimler, renkli son ürünler oluşturmak üzere kimyasal substratlarla birleşmezler ya enzim aktivitesi olan alanlarda substratları renkli maddelere dönüştürerek ya da iki basamaklı bir reaksiyonda renkli bir bileşikle yer değiştirebilecek renksiz bir ürün oluşturarak substratları üzerine etki yaparlar. Renkli bir final reaksiyon bileşiği üretimi ile ilgili tüm bu yöntemlerin sonuçları benzerdir. Reaksiyonun yoğunluğu, dokulardaki aktif reaktifin miktarı ile orantılıdır. Histolojik kesitlerdeki bu kimyasal reaksiyonların başarısı, aktif hücresel yapıların hücre içindeki orijinal yerlerinde ve orijinal konsantrasyonlarında korunmasına bağlıdır; glikojen veya enzimler gibi stabil olmayan maddelerin kaybından kaçınmak için özel önlemler alınmalıdır. Ayrıca son ürünler opak veya koyu boyanmış olmalıdır.
4-METALİK ÇÖKTÜRME
Bazı metalik bileşikler dokular tarafından opak, genellikle siyah birikinti oluşturarak metalik duruma indirgenebilirler. Kolayca indirgendiğinden ve depo edilmiş gümüş stabil olduğundan Ag(NH3)20H çözeltileri histoloji için çok uygundur. Melanin gibi tyrosin türevleri ve intestinal bezlerin Kultschitzky hücre granüllerinde bulunan fenolik bileşikler, görülebilen birikinti oluşturmak üzere Ag(NH3)2)OH’ı indirgeme kapasitesine sahiptir. Bu tip hücreler arjentaffin hücreler bilinirler. (Ag(NH3)2)OH’ ı direkt olarak indirgeyemeyen fakat bunu dışarıdan ilave edilen bir indirgeyicinin eklenmesi ile gerçekleştiren hücreler argirofil hücreler olarak bilinir.
Metalik çöktürme aynı zamanda fibrillerin gösterilmesinde kullanılan standart bir yöntemdir. Sinir fibrilleri ve retiküler fibriller gibi diğer fibril1er Ag(NH3)2OH ile birleşirler ve bu transparan indirgenmemiş gumüş, bir fotografik developer tarafından veya tekniğin ikinci basamağındaki diğer bazı indirgeyici ajanlar tarafından opak metalik gümüş olarak fibril1er üzerinde birikebilir. Metalik çöktürme ile boyama, dokulardaki indirgeyici ajanlar yeterli güçte ise tek basamaklı bir teknik olabilir. Fakat fibrillerin impregrasyonla gösteriminde, argirofil hücrelere benzer olarak genellikle iki basamaklı indirgenmeye gereksinim olacaktır. Hassaslaştırıcı ajanların ve gümüş yöntemlerinin varyasyonlarını kullanarak, birçok hücresel yapı, pigmentler, spiroketler ve funguslar metalik impregnasyonla gösterilebilir.
5-DOĞAL VE YAPAY BOYALARLA BOYAMA
Boyama tekniklerinin büyük bölümü bu gruba girmektedir. Ticari boyalara ait bilgilerin histolojiye aktarımı, dokularla boya kombinasyonları ile ilgili birçok faktörü anlamamıza yardım etmiştir.
Histolojide Kullanılan Boyalar
Histolojide iki tip boya kullanılmaktadır. Bunlar:
a-Doğal boyalar b-Yapay (sentetik) boyalar dır.
Doğal Boyalar: Örnek/ Carmin ve Hematoksilendir. Carmin boyası, Orta Amerika sulak ormanlarında yaşayan Dactylopius cacti türü dişi böceğin (kırmız böceği) kurutulmuş gövdelerinden elde edilir. Carminik asit, kırmız böceğinin suda kaynatılması ile ve kimyasal saflaştırmayı takiben ekstre edilmesi ile elde edilmektedir. Kaba form olan Carmin, kırmızın potasyum alimunyum sulfatla çöktürülmesi ile hazırlanır.
Hematoksilen ise Meksika'dan orijin almış ve Jamaika'da ıslah edilmiş Haematoxylen campechianum türü küçük bir ağacın tahtalarından ekstrakte edilmektedir. Hematoksilen histolojide en çok kul1anılan boyalardandır. Hematoksilenin doğal formunun boyama yeteneği çok azdır veya yoktur. Bu nedenle ya hava ile temas ederek doğal yoldan ya da sodyum iodat veya mercuric oksit gibi oksitleyici ajan kullanarak kimyasal yoldan hemateine okside olması gerekmektedir.
Yapay Boyalar: Kömür-gaz endüstrisinde kömürden elde edilen organik bileşiklerdir. Son yıllarda petrol yağları önemli bir alternatif kaynak haline gelmiştir. Benzen, toluen ve naftalin gibi hidrokarbonlar; fenol ve cresol' ler gibi fenoller primer ürünlerdir. Yapay boyaların büyük bir bölümü üç olası alternatif yapısal formülü bir türevli moleküldür (Şekil )
a-Benzen b-Quinone c-Anilin
Resonans, ışığın absorbsiyonu ve renk oluşumu ile ilgilidir. Benzen renksiz bir bileşik olmasına rağmen, ultraviyole bandında bir absorbsiyon bandına sahiptir ve eğer gözlerimiz ultraviyole ışığa duyarlı olsaydı benzen renkli görünecekti. Benzenden renkli bir bileşik yapmak için, bazı kimyasal değişiklikler yapmaya gereksinim vardır ve renk oluşturan kimyasal konfügirasyonlar "kromofor ‘ lar olarak bilinmektedir. Üç esas tip chromofor vardır (Şekil ). Bunlar:
l-Quinonoid halka (genellikle paraquinonoid, bazen orto-quinonoid)
2-Azo-eşlenme
3-Nitro-gruplanma, NO2
d-Nitro-gruplanma(nitrobenzen)
QİNONE, sarı renkte, önemli bir kromofor içeren bileşiktir. Daha kompleks organik bileşiklerde bir quinonoid halkanın bulunuşu, parlak daha koyu renkler oluşturur. Kromoforları içeren bileşikler ' Kromojen' ler olarak bilinirler. Dokuları ve kumaşları renklendirirler. Oluşan renkler sabit değildir ve basit solusyonlarda yıkama ile kolaylıkla uzaklaşabilirler. Kromojenler solusyonlarda moleküller oluşturarak çözünürler. Halbuki tatmin edici boyalar iyonlar şeklinde çözünürler. Bir kromojeni gerçek bir boyaya çevirmek için iyonize edici bir grubun ortama verilmesine gereksinim vardır.Bu iyonlaştırıcı gruplar ''auxokrom'' lar olarak bilinirler ve rengin yoğunluğunu artırırlar. Auxokromlar ya asidik veya baziktirler ve tüm molekülün boyanma hareketini belirleyen boya parçalarıdır.En önemli bazik auxokrom, amino-qrubu (-NH2) dur. Boya endüstrisinin temelini oluşturan anilin halkayı içeren boyalar (Şekil-c), histolojide birçok boyama tekniğinde hala kullanılmaktadır.
Asidik auxochromlar ise şunlardır:
sülfür grubu (-SO3) karboksil grubu (-COOH) hidroksil grubu (-OH)
Bir boya bileşiği içeren asidik veya bazik auxokromların büyük bir bölümü, bazik (katyonik) veya asidik (anyonik) boya karakterlerinin gücünü belirler. Bir bazik ve bir asidik gruba sahip boyalar baziktir ve bazik grup predominanttır fakat asidik grubun varlığı ile boyama özelliği zayıflamıştır. Boyalar modifier ' ler olarak adlandırılan ve boyanın rengini değiştirme etkisine sahip ek kimyasal gruplar içerirler. Bunlar metil (-CH3) veya etil (-C2H5 grupları olabilir ve boyanın rengini daha belirginleştirirler. Rosanilin, pararosanilin' den rengi biraz daha mavi yapan bir metil grubuna sahip olması ile ayrılır. Eğer bazik amino-auxochromların hidrojenleri metil veya aril grupları ile yer değiştirirse, boya daha mavi olur. Kristal viyole birden fazla modifiere sahip boyalara örnek olarak verilebilir. Şöyleki, bir koromofor ile renklenmiş ve bir auxokrom ile iyonize edilmiş organik bileşikten oluşmuş bir boyanın final rengi, bir modifier ile değiştirilir veya kuvvetlendirilir. Örnekler aşağıda verilmiştir.
QUİNONOİD BOYALAR:
Asit ve bazik fuksin
Krista1 viyole
Anilin blue
Eozin
Thionin
Metilen blue
Nötral red
Doğal boyalardan hematein ve karminik asit
AZO BOYALAR : Küçük bir boya grubudur .
Orange G
Congo Red
Trypan blue
NİTRQ BOYALAR :En küçük boya grubudur.
Pikrik asit (trinitrofenol)
Aurantia
a-Quinoid boya (hematein) b-Azo boya (Orange G) c-Nitro-boya (Pikrik Asit)