Son yıllarda, kök hücre araştırmalarında, yerel organda bulunan birçok hücre tipini içeren organoidlerin (veya daha yaygın olarak “mini organlar” olarak adlandırılan) üretilmesine yol açan bir patlama olmuştur. bazı fonksiyonlarını sergilerler. Bu organoidler tipik olarak, bir kuyu plakasında asılı duran veya bir hücre dışı matris (ECM) hidrojeli içinde kapsüllenmiş küresel bir hücre kümesinden oluşur ve hücrelerin belirli hücre tiplerine farklılaşmasını ve kendi kendine organize olmasını sağlayan bir büyüme faktörleri kokteyli ile sağlanır. organa benzer. Bununla birlikte, bu geleneksel kültür yöntemi, tüm hücrelerin askıya alındıkları aynı büyüme ortamından aynı farklılaşma ipuçlarını alması anlamında organoidlerde daha fazla gelişimsel ilerleme potansiyelini sınırlarken, gelişmekte olan embriyodaki hücreler komşu hücrelerden farklı sinyaller alabilir. embriyo içindeki uzamsal konumlarına bağlı olarak. Örneğin, sinyal salgılayan kaynağa daha yakın olan hücreler, muhtemelen farklı bir sinyal salgılayan kaynağa daha yakın olan konsantrasyon gradyanı boyunca ilerleyen hücrelerden farklı bir derecede uyarılacaktır. Bu nedenle, hücre kümesi boyunca farklılaşma faktörlerinin karşıt gradyanlarını oluşturmak için iki farklı ortamla organoidleri kültürlemek için bir platform geliştirmeye başladık (Şekil 1).
Karşıt gradyanlara sahip hücrelerin kültürlenmesi, hücreler ve farklı ortamlar için ayrı bölmelere sahip bir cihaz tasarlanarak elde edilmesi nispeten kolaydır. Bununla birlikte, organoidler herkesin bildiği gibi kırılgandır ve kültür kabına aktarılırken ve kültür kabından aktarılırken kolayca zarar görebilir. Ayrıca, farklılaşma sonrası analizler için gradyan kültür cihazından çıkarıldıktan sonra organoidin gradyan yönünü korumak veya belirlemek neredeyse imkansızdır. Yazımızda bir KÜP ile bu iki kuşu öldürdük. CUBE, içinde bir hidrojel yapı iskelesinde asılı duran hücreler veya organoidler ile dışta sert bir malzeme çerçevesi ve şeffaf duvarlar içeren bir kültür kabıdır. KÜP’ün boyutu ve şekli sabit olduğundan, KÜP’te bir tohumlama cebi oluşturarak organoidi KÜP’te kesin ve tutarlı bir şekilde konumlandırabiliriz. CUBE içinde bulunan organoid sayesinde, örneğe zarar vermeden CUBE’ü bir gradyan kültür cihazına aktarmak için artık bir cımbızla güvenli bir şekilde tutulabilir. Farklılaşmanın sonunda organoid, gradyan cihazından alınabilir ve CUBE çerçevesi numunenin oryantasyonu için bir referans olarak kullanılarak CUBE ile birlikte kesilebilir (Şekil 2).
Bu platformun organoid kültüre uygulanmasının bir gösterimi olarak, gradyan kültür cihazını kullanarak farklılaşma ortamının Neuroectoderm-Mesoderm (NE-M) ve Neuroectoderm-Endoderm (NE-E) kombinasyonları ile CUBE’lerde iPSC sferoitlerini kültürledik, sonra bölümlere ayırdık. (NE-M) için Sox2-Brachyury ve (NE-E) için Nestin-FoxA2 farklılaşma belirteçleri için sferoidler ve immüno-lekeli. Farklılaşma belirteçlerinin ilgili farklılaşma ortamının eklendiği kürenin yan tarafındaki yerelleştirilmiş ifadeleri, tek bir kürenin farklılaşmasını iki ayrı bölgeye yönlendirebildiğimizi doğruladı (Şekil 3).
Bu gradyan kültür platformunun dorsal-ventral ve ön-arka vücut eksenleri modeline sahip olanlar gibi giderek daha karmaşık organoidleri kültürlemek için kullanılmasını dört gözle bekliyoruz, bu da bizi insan çalışmasına izin vermek için yerel organların yapısını ve işlevlerini daha iyi çoğaltmaya yaklaştırıyor. geliştirme, hastalık mekanizmaları ve ilaç tedavisi laboratuvar ortamında.
Perde arkası: Akışkan cihazlarla mücadeleler
Çoğu mühendisin bildiği ve çoğu biyoloğun mutlulukla farkında olmadığı gibi, sıvı sızıntısını önlemek veya en aza indirmek, özellikle de yalnızca hücrelere zarar vermeyen biyouyumlu malzemeler ve yöntemler kullanılabiliyorsa zorlu bir mücadeledir. Farklı malzeme türleri kullanıldığında (yani, CUBE’ün sert malzemesi ve PDMS’den yapılmış gradyan cihazının nispeten daha yumuşak malzemesi), yüzey pürüzlülüğündeki farklılıklar, sıvının sızmasına izin veren iki malzeme türü arasında küçük boşluklara yol açar. CUBE’de bir gradyan oluşturmaya çalışıyorsak bu kötü bir haber çünkü CUBE’ün dışı ile kültür cihazı arasında ortam sızmasını istemiyoruz – bu, ortamın CUBE dışında ayrı bölmelerde birbirine karışmasına yol açacaktır. . Bu sorunun üstesinden gelmek için, günlük yaşamda yaygın olarak bulunan dahiyane bir buluş kullandık: su geçirmez şişelerinizi, hava geçirmez kaplarınızı, çamaşır makinesi borularınızı kapatan mütevazi O-ring. O-ringler tipik olarak, basınç uygulandığında yüzey arasındaki küçük boşlukları kalıplayarak kapatmasını sağlayan çok yumuşak ve esnek malzemelerden yapılır. CUBE, gradyan cihazı, O-ring ve sızdırmazlık yönteminin malzeme seçimi ve tasarımı ile ilgili birçok optimizasyondan sonra, kullanımının kolay olduğuna ve çok fazla ek malzeme, ekipman gerektirmediğine inandığımız bir protokolü sonuçlandırmayı başardık. veya mühendis olmayan birinin rahatlık alanı dışındaki uzmanlık becerileri.