This translation into Turkish was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages
1DOE Plant Research Laboratory, Michigan State University, 2DOE Great Lakes Bioenergy Research Center, Michigan State University
Walton, J., Banerjee, G., Car, S. GENPLAT: an Automated Platform for Biomass Enzyme Discovery and Cocktail Optimization. J. Vis. Exp. (56), e3314, doi:10.3791/3314 (2011).
1. Enzim Üretimi
2. Deney Tasarımı
3. Enzimatik Hidroliz
4. GLC ve Xyl Belirlenmesi
5. Veri Analizi
6. GENPLAT Temsilcisi Sonuçlar:
(1) bireysel saf proteinlerin optimize edilmiş bir karışım oluşturulması. Sonuçları enzimler önemli olduğu ve hangi oranlarda, hangi enzimlerin önemli değildir . T. bol Bazı proteinler Cip1 ve Cip2 reesei secretome (Nagendran ve ark, 2009), amonyak fiber genişleme (AFEX) ya da alkalin HYD tarafından tedavi öncesi mısır koçanı GLC sürümde hiçbir rol oynadığı görülmektedir oksidatif stresin (AHP) (Banerjee ve ark, 2010b). Öte yandan, bazı proteinler beklenmedik önemlidir. Örneğin, 10 ve 11 glikozil hidrolaz aileleri endo-xylanases GLC serbest bırakılması için iki önemli olan bir xylanase diğer (. Banerjee ve ark, 2010b, c) yerini alamaz. T., küçük bir protein Cel61A reesei secretome GLC için çok önemli ama serbest Xyl değil. Bazı enzimler ise diğerleri sadece birini ya da diğerini (Banerjee ve ark. 2010C) için gerekli, hem de GLC ve Xyl serbest bırakılması için önemlidir.
16 bileşenler, her bir konsantrasyon 0.94 mg / ml (yani, olmayan bir optimize karışımı) içeren bir sentetik karışım, AFEX önceden tedavi DDG kullanılabilir GLC% 38'i piyasaya sürdü. , Aynı hidroliz koşullar altında, optimum bir karışım, 16 bileşenlerin konsantrasyonları,% 0 ile%% 32 arasında değişmektedir (Şekil 2)% 52 GLC yayınladı. Bu deney tanımlanan karışımları inşa yararını göstermektedir._content "farklı tedavi öncesi / substrat kombinasyonları için en uygun kokteyller> (2) Yaratılış Mevcut ticari selülaz hazırlıkları" tek tip uyan tüm "Gerçekte, en iyi kokteyl substrat ve tedavi öncesi hem de bağlıdır. tek bir ürün Accellerase 1000, farklı yüzeyler, aynı şekilde ön işlem ve farklı ön işlemleri (Şekil 1) maruz aynı substrat farklı verim verir gibi birden fazla ön işlemleri ve mutiple hammadde (Banerjee ve saf enzimlerin karışımlar optimize etmek için GENPLAT kullanmış ve arkadaşları, 2010C). Şekil 2 16 saf enzimlerin optimal enzim oranlarda ön tedavi-AFEX mısır koçanı, AHP-tedavi öncesi mısır koçanı ve AFEX ön tedavi DDG için nasıl farklı olduğunu gösterir. Sadece 11 enzimler Şekil 2 çünkü optimal diğer beş (Cel61B AbfB, Cip1, Cip2 ve Cel12A) oranları% 0 olarak bulundu (Banerjee ve ark. 2010C).
(3) Roman enzim keşif T. daha özleri yaptık reesei ve A. Nijer farklı yüzeyler üzerinde büyüdü. Temel eklendiğinde belirli bir özü GLC verimi artırdı. Sorumlu proteinin saflaştırılmış ve bir roman glikozil hidrolaz (Banerjee ve Walton, yayınlanmamış sonuçlar), herhangi bir ticari enzim hazırlık mevcut değil olduğu gösterilmiştir.
Daha iyi enzimler (4) Discovery. Bir bozulma enzimlerin en önemli GENPLAT ile gösterilir.Özellikle biyokütle, enzimler iyileştirilmesi için odak noktası olması gereken daha iyi bir anlayış var. Kritik enzimler daha iyi örnekler doğada arayarak ya da protein mühendisliği tarafından yapılmış olabilir. (Bir enzim istenilen özelliğine bağlı olarak çeşitli şekillerde T. reesei homolog, daha "iyi" olabilir, örneğin, yüksek spesifik aktivite, daha fazla sinerji, proteolitik hassasiyet, veya gelişmiş termal stabilite azalma). Saf selüloz veya diğer yapay substratlar sonuçlar doğal lignocellulosic ile ilgili olmayabilir, çünkü gerçekçi karmaşık bir kokteyl (biyokütle enzim izolasyon çalıştığı için önemli) ve önemli gerçekçi bir substrat (kullanır, çünkü GENPLAT, potansiyel olarak daha iyi enzimler assaying için anlamlı bir platform sağlar malzemeler).
(5) Ticari enzim optimizasyonu. Yeterince büyük miktarlarda saf enzimlerin henüz gerçek dünyada yok. Yapıncaya kadar, etanol producers gibi Accellerase 1000 ve MultifectXylanase gibi ticari ürünler güvenmek gerekir. Ancak, ticari enzimler karışımları genellikle herhangi bir birey daha iyi performans ve GENPLAT birden fazla ticari enzimlerin optimize kokteyller tasarım için kullanılabilir. Şekil 3, dört ticari enzim preparatları bir karışımı optimize etmek için GENPLAT kullanımı gösterir. AFEX ön tedavi DDG GLC serbest bırakılması için en uygun oranlarda,% 47 Accellerase1000,% 27,% 22 Multifect Pektinaz Novozyme 188 ve% 4 Multifect xylanase (Banerjee ve ark. 2010C) olarak bulunmuştur. Şekil 3B dört enzim preparatları ile AFEX-DDG GLC verim arasındaki farklılıklar gösterir; optimize edilmiş ticari karışımı yüksek GLC verim verir, tek başına Accellerase1000 daha SpezymeCP tek başına veya bir 16-bileşenli sentetik karışım. Bu deney aynı zamanda 16-bileşenli sentetik karışımı için gerekli ticari enzimlerin bir veya daha fazla mevcut en iyi GLC açıklaması, bir veya daha fazla enzimler eksik olduğunu gösterir. GENPLAT bize.ed gibi bileşenler tespit etmek.
Şekil 1: Tek başına hiç bir ticari enzim hazırlık tüm yüzeyleri ve tüm ön işlemleri için en uygunudur. Beş yüzeyleri ve taşlama (0.5 mm parçacık boyutu) benzer koşullar altında üç ön işlemleri karşılaştırıldığında, enzim yükleme (15 mg / g glukan) ve hidroliz koşulları (48 saat, 50 ° C) farklı AFEX ön işlem substratlar A. Sindirim Accellerase 1000 ile mısır koçanı B. Sindirim Accellerase 1000 ile üç farklı yöntem (Banerjee ve ark. 2010C) ile ön işlem.
Şekil 2 AFEX-tedavi öncesi mısır koçanı (AFEX CS), alkalin hidrojen peroksit tedavi öncesi mısır koçanı (AHS-CS), ya da kurutulmuş AFEX ön tedavi GLC serbest bırakılması için 11 enzimlerin optimal oranlarda damıtmakers 'tahıl (AFEX DDG). Veriler Banerjee ve ark.. (2010C). Çubukların üstündeki sayıları, toplam GLC biyokütle örnek bir yüzdesi olarak GLC verim.
Şekil 3. A. AFEX-ön tedavi DDG GLC serbest bırakılması için dört ticari enzim preparatları optimize edilmiş bir karışımı üretmek için GENPLAT kullanın. Multifect xylanase en küçük katkısı (% 4) ve bu nedenle bu üçlü diyagram atlandı. Özdeş hidroliz (15 mg / g glukan enzim, 48 saat, 50 ° C) koşulları altında farklı enzim tedaviler ile B. AFEX-DDG GLC verimleri . "Dört bileşenli ticari" Şekil deney belirlenen oranlara sahiptir. 3A.
Bu yaygın enzimlerin maliyetini azaltarak ekonomik bir lignocellulosic etanol endüstrisinin gelişimi için önemli olduğu kabul edilmektedir. Şu anda mevcut ticari enzim kokteyller birçok proteinleri (Nagendran ve ark, 2009) karmaşık ve kötü tanımlanmış karışımları ve özellikle asit-tedavi öncesi mısır koçanı kullanmak için uyarlanmıştır. Daha iyi enzim kokteyller gelişimini hızlandırmak için, bazı laboratuvarlar enzim keşif ve karakterizasyonu için yüksek verimli platformlar geliştirdik. Decker et robot, enzimler ve biyokütle çamurlar dağıtım, istatistiksel deney tasarımı ve / veya otomatik olarak belirlenmesi GLC ve Xyl (Berlin ve ark, 2007: Bu alandaki çabalar da GENPLAT bulunan aşağıdaki özelliklerden bir veya daha fazla dahil diğerleri, 2009; Kim ve ark, 1998; King ve ark, 2009). GENPLAT en az 6 bileşenleri analiz edilebilir enzim karışımlarının karmaşıklığı en önemlisi, bu daha önceki çabaları uzanıren son çalışma fazla 16 daha önceki çalışmalarda (Banerjee ve ark. 2010C). Üzerinde uç uç dönme sindirim sırasında nazik karıştırma; ve Glu ve Xyl otomatik kolorimetrik tespiti GENPLAT Ek temel özellikleri, dağıtım sırasında askıya koçanı çamurlar tutabilir boncuk karıştırma haznesinin kullanımı (kürek rezervuar).
Çıkar çatışması ilan etti.
Bu çalışma, ABD Enerji Departmanı, Temel Enerji Bilimler, Bölüm Dairesi, ABD Enerji Great Lakes Biyoenerji Araştırma Merkezi Departmanı (DOE Bilim BER Office DE-FC02-07ER64494) ve hibe DE-FG02-91ER200021 tarafından finanse edildi Kimyasal Bilimler, Yer Bilimleri ve Biosciences. John Scott-Craig ve Melissa Borrusch Biz onların maddi ve kavramsal katkıları için teşekkür ederim.