Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), DNA’nın küçük parçalarını “amplifiye etmek” için kullanılan bir tekniktir.
Bazen “moleküler fotokopi” olarak adlandırılan polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), DNA’nın küçük parçalarını “büyütmek” – kopyalamak – için kullanılan hızlı ve ucuz bir tekniktir. Moleküler ve genetik analizler için önemli miktarda DNA numunesi gerekli olduğundan, PCR amplifikasyonu olmadan izole DNA parçalarının incelenmesi neredeyse imkansızdır.
1980’lerde Kary Mullis tarafından geliştirilen devrim niteliğinde bir yöntemdir. PCR, DNA polimerazın , sunulan şablon sarmalı tamamlayıcı yeni DNA sarmalını sentezleme yeteneğinin kullanılmasına dayanır . DNA polimeraz, yalnızca önceden var olan bir 3′-OH grubuna bir nükleotid ekleyebildiğinden, ilk nükleotidi ekleyebileceği bir primere ihtiyaç duyar. Bu gereklilik, araştırmacının büyütmek istediği belirli bir şablon dizisi bölgesini betimlemeyi mümkün kılar. PCR reaksiyonunun sonunda, spesifik dizi milyarlarca kopyada ( amplikonlar ) birikecektir .
Genellikle moleküler biyolojideki en önemli bilimsel ilerlemelerden biri olarak müjdelenen PCR, DNA çalışmasında o kadar devrim yarattı ki, yaratıcısı Kary B. Mullis 1993 yılında Nobel Kimya Ödülü’ne layık görüldü.
PCR ne için kullanılır?
Amplifiye edildikten sonra, PCR ile üretilen DNA birçok farklı laboratuvar prosedüründe kullanılabilir. Örneğin, İnsan Genom Projesi’ndeki (HGP) çoğu haritalama tekniği PCR’ye dayanıyordu.
PCR, DNA parmak izi, bakteri veya virüslerin (özellikle AIDS) tespiti ve genetik bozuklukların teşhisi dahil olmak üzere bir dizi laboratuvar ve klinik teknikte de değerlidir.
PCR nasıl çalışır?
PCR kullanarak bir DNA segmentini çoğaltmak için, numune önce ısıtılır, böylece DNA denatüre olur veya iki parça tek sarmallı DNA’ya ayrılır. Ardından, “Taq polimeraz” adı verilen bir enzim, orijinal zincirleri şablon olarak kullanarak iki yeni DNA zincirini sentezler – oluşturur. Bu süreç, orijinal DNA’nın kopyalanmasıyla sonuçlanır, yeni moleküllerin her biri bir eski ve bir yeni DNA zinciri içerir. Daha sonra bu şeritlerin her biri iki yeni kopya oluşturmak için kullanılabilir ve bu böyle devam eder. Yeni DNA’yı denatüre etme ve sentezleme döngüsü, orijinal DNA segmentinin bir milyardan fazla tam kopyasına yol açan 30 veya 40 kez tekrarlanır.
PCR’nin tüm döngü süreci otomatiktir ve sadece birkaç saat içinde tamamlanabilir. DNA denatüre edilmesine ve sentezine izin vermek için reaksiyonun sıcaklığını birkaç dakikada bir değiştirmek üzere programlanmış bir termocycler adı verilen bir makine tarafından yönlendirilir.
PCR, DNA’nın belirli bir bölümünün milyonlarca kopyasını yapmak için laboratuvarda kullanılan bir tekniktir. İlk olarak 1980’lerde geliştirildi.
PCR kullanarak, çok az miktarda DNA’dan belirli bir DNA bölümünün binlerce ila milyonlarca kopyasını üretmek mümkündür.
PCR, tıbbi ve biyolojik araştırma laboratuvarlarında kullanılan yaygın bir araçtır. Dizileme için DNA’nın işlenmesinin erken aşamalarında kullanılır ? , patojenleri tanımlamaya yardımcı olacak bir genin varlığını veya yokluğunu tespit etmek için enfeksiyon sırasında ve küçük DNA örneklerinden adli DNA profilleri oluştururken.
PCR nasıl çalışır?
- DNA örneği ne olursa olsun, her PCR’nin arkasındaki prensipler aynıdır.
- Bir PCR kurmak için beş temel ‘içerik’ gereklidir. İlerledikçe bunların her birinin tam olarak ne yaptığını açıklayacağız. Bunlar:
- kopyalanacak DNA şablonu
- primerler, PCR reaksiyonunu başlatan, kopyalamak istediğiniz DNA bölümünün her iki tarafına bağlanmak üzere tasarlanmış kısa DNA uzantıları
- DNA nükleotid bazları ? (dNTP’ler olarak da bilinir). DNA bazları (A, C, G ve T) DNA’nın yapı taşlarıdır ve yeni DNA zincirini oluşturmak için gereklidir.
- Taq polimeraz enzimi ? yeni DNA bazlarını eklemek için
- Reaksiyon için doğru koşulları sağlamak için tampon.
- PCR, makine tarafından gerçekleştirilen termal döngü adı verilen bir ısıtma ve soğutma sürecini içerir.
- Üç ana aşama vardır:
- Denatüre etme – çift sarmallı şablon DNA, onu iki tek sarmal halinde ayırmak için ısıtıldığında.
- Tavlama – DNA primerlerinin şablon DNA’ya bağlanmasını sağlamak için sıcaklık düşürüldüğünde.
- Uzatma – sıcaklık yükseldiğinde ve yeni DNA zinciri Taq polimeraz enzimi tarafından yapıldığında.
- Bu üç aşama 20-40 kez tekrarlanarak her seferinde DNA kopyalarının sayısı iki katına çıkar.
- Tam bir PCR reaksiyonu birkaç saatte, hatta bazı yüksek hızlı makinelerde bir saatten daha kısa sürede gerçekleştirilebilir.
- PCR tamamlandıktan sonra, üretilen DNA parçalarının miktarını ve boyutunu kontrol etmek için elektroforez adı verilen bir yöntem kullanılabilir.
PCR’nin her aşamasında ne olur?
denatüre aşaması
- Bu aşamada şablon DNA ve diğer tüm çekirdek bileşenleri içeren kokteyl 94-95⁰C’ye ısıtılır.
- Yüksek sıcaklık hidrojen bağlarına neden olur ? İki şablon DNA dizisindeki bazlar arasında kırılacak ve iki dizi ayrılacak.
- Bu, yeni DNA dizilerinin üretimi için şablon görevi görecek olan iki tek DNA dizisiyle sonuçlanır.
- DNA zincirlerinin tamamen ayrılmasını sağlamak için sıcaklığın bu aşamada yeterince uzun süre korunması önemlidir.
- Bu genellikle 15-30 saniye sürer.
Tavlama aşaması
- Bu aşamada reaksiyon 50-65⁰C’ye soğutulur. Bu, primerlerin hidrojen bağı yoluyla tek iplikli şablon DNA üzerinde belirli bir konuma bağlanmasını sağlar (tam sıcaklık, kullandığınız primerlerin erime sıcaklığına bağlıdır).
- Primerler, tek DNA veya RNA dizisidir ? 20 ila 30 baz uzunluğunda olan dizi.
- Primerler tamamlayıcı olacak şekilde mi tasarlandı ? kopyalanacak dizinin her iki ucundaki DNA’nın kısa bölümlerine sırayla.
- Primerler, DNA sentezi için başlangıç noktası görevi görür. Polimeraz enzimi, DNA’nın çift sarmalına yalnızca DNA bazları ekleyebilir. Primer bağlandığında, polimeraz enzimi eklenebilir ve gevşek DNA bazlarından yeni tamamlayıcı DNA zincirini oluşturmaya başlayabilir.
- Ayrılmış iki DNA dizisi tamamlayıcıdır ve zıt yönlerde ilerler (bir uçtan – 5′ uçtan – diğer uçtan – 3′ uca); sonuç olarak, iki primer vardır – bir ileri primer ve bir ters primer.
- Bu adım genellikle yaklaşık 10-30 saniye sürer.
Genişleyen aşama
- Bu son adımda, DNA bazları ekleyen özel bir Taq DNA polimeraz enzimi tarafından yeni DNA’nın yapılabilmesi için ısı 72⁰C’ye yükseltilir.
- Taq DNA polimeraz sıcağı seven bakterilerden alınan bir enzimdir . Termos aquaticus .
- Bu bakteri normalde kaplıcalarda yaşar, bu nedenle 80⁰C’nin üzerindeki sıcaklıkları tolere edebilir.
- Bakterinin DNA polimerazı yüksek sıcaklıklarda çok kararlıdır, bu da PCR’nin denatüre etme aşamasında DNA zincirlerini parçalamak için gereken sıcaklıklara dayanabileceği anlamına gelir.
- Diğer organizmaların çoğundan elde edilen DNA polimeraz bu yüksek sıcaklıklara dayanamaz, örneğin insan polimerazı ideal olarak 37°C’de (vücut sıcaklığı) çalışır.
- 72⁰C, Taq polimerazın tamamlayıcı ipliği oluşturması için optimum sıcaklıktır. Primere bağlanır ve ardından 5′ ila 3′ yönünde tek tek DNA bazlarını tek iplikçiklere ekler.
- Sonuç, yepyeni bir DNA dizisi ve çift sarmallı bir DNA molekülüdür.
- Bu adımın süresi, amplifiye edilen DNA dizisinin uzunluğuna bağlıdır, ancak genellikle 1.000 DNA bazının (1Kb) kopyalanması yaklaşık bir dakika sürer.
- Bu üç termal döngü süreci, ilgilenilen DNA dizisinin çok sayıda kopyasını üretmek için 20-40 kez tekrarlanır.
- PCR sırasında yapılan yeni DNA fragmanları, DNA polimeraz enziminin bağlanabileceği ve DNA yapmaya başlayabileceği şablonlar olarak da hizmet eder.
- Sonuç, nispeten kısa bir süre içinde üretilen spesifik DNA segmentinin çok sayıda kopyasıdır.