Nitrat redüksiyonu:
Tanım: Bakterinin nitratdan oksijen koparabildiğinin araştırılmasıdır. Nitratları nitrite indirgeyen nitrate reductase enzimleri Pantoa agglomerans, bazı Serratia ve Yersinia türleri hariç bütün Enterobacteriaceae familyasında ve anaeroplarda nitrat redüktazlar genellikle bulunur. Bu test Haemophilus, Neisseria ve Branhamella genusuna ait üyelerin de birbirlerinden ayırımlarının yapılabilmesi için faydalı bir testtir.
Prensip: Reaksiyonun kimyasal profili şöyledir: NO3‑ + 2e‑ + 2H ──> NO2 + H20
Testin prensibi incelenen bakterinin üretildiği nitratlı ortamda nitrit aranmasıdır. Bakteri kolonisi üzerine veya buyyona ayıraçlar damlatıldığında ortamda nitrit varsa p‑sulfobenzene‑azo‑α‑naphthylamine oluşur. Bu madde kırmızı renkli bir diazonium boyasıdır.
İşlem: Bu test için bakteri örneği aşağıdaki besiyerinde türüne uygun süre inkübe edilir. Her iki ayıraç sırasıyla 0.5 ml damlatılır. Renk değişimi gözlenir.
Nitrate Broth or Nitrate Agar:
Beef extract 3 g
Pepton 5 g
Potassium nitrate (KNO3) 1 g
Agar (nitrit içermeyen) 12 g
Distile su 1 lt.
Ayıraç A:
Sulfanilic acid 8 g
Acetic acid 5N,30% 1 lt
Ayıraç B:
α‑Naphthylamine 5 g
Acetic acid (5 N),30% 1 lt
Değerlendirme: 30 saniye içerisinde kırmızı renk oluşması pozitif sonuç anlamına gelir. Besiyerinin renginde bir değişim olmaması şu sonuçlardan birisini ifade eder: 1) Bu bakteri nitratı nitrite redüklememiştir, bu halde testin sonucu gerçekten negatiftir. 2) Bu bakteri nitratı nitrite redüklemiş, ama nitrit süratle başka komponentlere bağlanarak ayıraçlardan gizlenmiştir. Testin sonucu pozitiftir ama negatif görünmektedir. (Örneğin nitrat iki defa redüklenirse sonuçta nitrit değil, NH3, N2, NO, N2O veya hydroxylamine şekline dönüşür. Ayıraçlar bunları tespit edemez). Bunu anlamak için, negatif sonuç veren besi yeri içerisine küçük bir metalik çinko parçası atılarak nitratlar manuel olarak nitrite indirgenmeli ve kırmızı renk oluşumu aranmalıdır. Bu doğrulama işleminin sonucunda kırmızı renk görülmesi, ortamda indirgenmemiş nitrat bulunduğunu ve bakterinin nitrat redüktazlarının bulunmadığını yani testin sonucun negatif olduğunu gösterir.
Kontrol amacı ile negatif testler tekrarlanabilir veya negatif kontrol olarak Acinetobacter baumannii, pozitif kontrol olarak ise Escherichia coli kullanılabilinir.
Bu test Mycobacterium’lar için yapılacaksa besiyeri modifiye edilmeli, laktik asit ilave edilmeli ve inkübasyon süresi türe uygun olarak uzatılmalıdır.
Oksidaz testi:
Tanım: Cytochrome C oxydase enziminin varlığını arayan bir testtir. Bu enzim demir içeren bir hemoproteindir, nonfermentatif (aerobik) solunuma katılır. Pseudomonas, Neisseria, Vibrio ve Pasteurella’larda bulunur zorunlu anaeroplarda genellikle bulunmaz.
Prensip: İncelenen bakteride bu enzim bulunuyorsa ayıraçı indofenol mavisi’ne oksitler ve mavi renk açığa çıkar.
İşlem: %1 lik Kovac‘s oksidaz ayıracı (Tetramethyl‑p‑phenylenediamine dihydrochloride) veya Gordon – McLeod‘s oksidaz ayıracı (Dimethyl‑p‑phenylenediamine dihydrochloride) veya ticari oksidaz disk ve ayıraçları kullanılabilir. Direkt Plak Teknik: 2‑3 damla ayıraç doğrudan bakteri kolonisi üzerine damlatılır. İndirekt Strip Teknik: Ayıraçlardan birisi bir süzgeç kağıdına emdirilir ve üzerine bakteri kolonisi tatbik edilir. Önerilen metot budur.
Değerlendirme: 10 saniye içerisinde bakteri kolonisinin temas ettiği süzgeç kağıdının veya üzerine ayıraç damlatılan koloninin koyu mavi renk alması pozitif sonuçtur. 60 saniye içerisinde oluşan renkleşme durumunda test tekrarlanmalıdır, daha geç oluşabilecek renkleşmeler değerlendirilmez. Nikel, krom ve paslanmaz çelikden yapılmış özeler yerine ağaçtan yapılmış kürdanlar kullanılmalıdır. Çünkü metal yüzeyinde oluşan oksitler testin sonucunu yanlış pozitif yapar. Negatif kontrol olarak E. coli , pozitif kontrol için ise P. aeruginosa kullanılabilinir.
ß‑D-galaktozidaz (ONPG) testi:
Tanım: Bakteri hücresi laktozu kullanabilmek için önce: 1) Laktozu bir permease enzimi ile hücre içerisine alır, daha sonra, 2) hücre içerisine aldığı laktozu intraselüler bir enzim olan ß-galactosidase ile hidrolize eder. Bu test, ß-galaktozidaz’ın varlığını yani laktoza potansiyel etkili bakterileri ortaya çıkartır. Bu test sonucu pozitif olan bir bakteri kaktozu fermente etmek zorunda değildir.
Prensip: Eğer bakteride ß-galaktozidaz enzimi varsa ortamda bulunan O-Nitrophenyl-ß-D Galactopyranoside (ONPG) parçalanacaktır.Sonuçta galaktoz ve O-Nitrophenyl açığa çıkacaktır. Bunlardan O-Nitrophenyl sarı renklidir.
İşlem: İncelenecek bakterinin saf kültüründen bir koloni ONPG buyyona ekilerek türüne uygun süre inkübe edilir. Sarı renk aranır.
ONPG Buyyon:
Peptonlu su 750 ml
ONPG stok solusyonu 250 ml
ONPG Stok Solusyonu:
ONPG 6 g
0.01M Na2HPO4 1 lt
Değerlendirme: İnkübasyonu takiben oluşan sarı renk pozitif test sonucunu verir. ONPG stok solusyonu buzdolabında ve karanlıkta saklanmalıdır.
Safraya tolerans:
Tanım: Bazı bakteriler barsağın doğal konakçısı olup bir karaciğer salgısı olan safranın %40 konsantrasyonlarına bile tolerans gösterirler. Bu test o bakterinin safrada yani barsakta yaşayıp yaşayamadığını tespit eder. B. fragilis‘in diğer Gram negatif anaeroplardan ayırımında ve bazı enterobakteriler ve D grubu streptokokların ayırımında anahtar testtir. Bu test, Pneumococcus genusuna uygulanan safrada lizis testinden bağımsızdır.
Prensip: İçerisinde %40 safra bulunan bir besiyerinde üreme olup olmadığına bakılmasından ibarettir.
İşlem: İncelenecek bakterinin saf kolonisi safralı agar içerisine ekilir, türüne uygun sıcaklıkta uygun süre inkübe edilir, üreme aranır.
Safralı Agar:
Kurutulmuş öküz safrası 40 g
At serumu 50 ml
Et infuzyon agar(veya türe uygun besiyeri) 1 lt
Değerlendirme: İnkübasyonu takiben sadece üreme aranır. Koloni morfolojisi, koloni rengi veya mikroskopi bakılmaz. Bakteri kolonisinin mevcudiyeti pozitif test sonucu için yeterlidir.
Ticaretten temin edilebilen safra diskleri de vardır, antibiyotik diskleri gibi ekim yapılmış agar yüzeyine bırakılıp zon ölçümü yapılabilir. Disk kullanımı anaeroplar için tercih edilir.
Safrada lizis :
Tanım: Pnömokokları diğer streptokoklardan ayırmak için yapılan bir testtir. Pnömokoklar enterik ekolojiye (safraya) fazla duyarlıdırlar. Ortamda safra mevcudiyetinde pnömokok otolizinleri (alanin-muramyl-amidase) aktive olur ve bakteri hücresi parçalanır. Bu test safraya tolerans testi değildir ve bu test için safrada erime ifadesi makul bir terim değildir.
Prensip: Bakteri kültürü üzerine safra eklenir, buyyonun optik geçirgenliğine bakılarak lizis aranır. Otolizise direnen pnömokokların yanlış negatif sonuçlarını engellemek için ve bakterinin otolizinlerini aktive etmek için buyyona sodium deoxylate eklenebilir.
İşlem: Pnömokok olduğundan şüphelenilen streptokok örneği iki ayrı buyyonda bolca üretilip pH sı 7.4-7.6 ya ayarlanır, %10 luk sodium deoxylate solüsyonu eklenir. Bir tanesinin üzerine %9-11 lik öküz safrası (veya onun yerine ona eşdeğer olarak safra asiti olan sodium taurocholate) eklenir. 15 dakika etüvde bırakılır. Her iki tüp, optik okuyucuda veya göz ile bakılarak mukayese edilir, kontrol tüpüne kıyasla kültür sıvısının renginin açılıp açılmadığı yoklanır.
Değerlendirme: Safra ilave edilen buyyonda, kontrol tüpüne kıyasla renk açılması pozitif test sonucudur. Negatif kontrol olarak enterokok kullanılabilir.
Sitrat kullanımı :
Tanım: Sodium citrate bir sitrik asit tuzudur ve trikarboksilik asit siklusu (Tricarboxylic Acid Cycle, TCA, Krebs‘ cycle) içerisinde bir metabolit olarak yer alır. Bazı bakteriler karbonhidratların dışında bu metaboliti de bir enerji ve karbon kaynağı olarak kullanabilirler.
Prensip: Bu test yapılırken bakteri örneği protein ve karbonhidratlardan yoksun bir ortama ekilerek sitratı kullanmaya zorlanır. Eğer bakteri sitratı kullanabilirse bazik ürünler açığa çıkarır. Çünkü, besiyeri içerisinde sitrata bağlı olarak bulunan katyonlar, sitrat ayrılınca amonyağa, amonyuma (NH4+) ve amonyum hidroksit’e (NH4OH) dönüşür. Oluşan alkali ortamda bulunan bromtimol mavisi pH indikatörü olarak baz oluşumunu gösterir.
İşlem: Denecek bakterinin saf kültüründen bir koloni Simmon’s Sitrat agar’a (veya Koser’s sitrat agarına) ekilir, optimal süreden biraz daha uzun bir süre inkübe edilir. Üreme ve mavi renk aranır.
Simmons Citrate agar:
Ammonium dihydrogen phosphate 1 g
Dipotassium phosphate 1 g
Sodium chloride 5 g
Sodium citrate 2 g
Magnesium sulfate 0.20 g
Agar 15 g
Bromthymol blue 0.08 g
Distile su 1 lt
Değerlendirme: 48 saatlık inkübasyonu takiben koloni gelişmesi pozitif test sonucu için yeterlidir. Çünkü bu besiyerinde bakterinin kullanabileceği sitrattan başka bir karbon kaynağı yoktur. Koloni gelişiyorsa sitratı kullanabiliyor demektir. Koloniler etrafında koyu mavi renk oluşumu pozitif sonucu destekler. Koloni gelişmiş ancak mavi renk almamış besiyerlerinin, daha uzun süre inkübasyonu yapılarak renk oluşumu aranmasına gerek yoktur. Ancak beklenirse mavi renk oluşacaktır.
Pozitif kontrol için Enterobacter aerogenes, negatif kontrol için Esherichia coli kullanılabilir.
Üreaz testi:
Tanım: Üre (NH2-CO-NH2), karbonik asitin bir diamide türevidir. Bütün diamitler kolayca amonyak ve CO2‘e hidrolize olurlar, daha sonra amonyum karbonata dönüşürler. Bazı bakteriler üreaz (urease) enzimleri ile şu reaksiyonu katalizlerler: (NH2-CO-NH2) + 2 H2O + urease ─> CO2 + H2O + 2NH3 <─> (NH4)2CO3
Prensip: Bakteri, içerisinde üre bulunan besiyerinde üretilerek üre’nin bazik yıkım ürünleri pH indikatörü ile izlenir.
İşlem: İncelenecek bakterinin saf kültüründen bir öze dolusu Stuart‘s üre buyyona veya Christensen‘s üre agar’a ekim yapılarak türüne uygun süre inkübe edilir. pH indikatöründeki renk değişimi gözlenir.
Stuart’s Urea Broth
Yeast extract 0.1 g
Monopotassium phosphate 9.1 g
Disodium phosphate 9.5 g
Urea 20 g
Phenol red 0.01 g pH = 6.8 ayarlanır
Christensen’s Urea Agar
Pepton 1 g
Glucose 1 g
Sodium chloride 5 g
Monopotassium phophate 2 g
Urea 20 g
Phenol red 0.012 g
Agar 15 g pH = 6.8 ayarlanır
Değerlendirme: Bazı mikroorganizmalar (Proteus ve Actinobacillus gibi) 1-2 saat içinde üreyi hidrolize edebilir, daha az aktif türler ise 2 veya 3 gün gereksinebilir. Her iki besiyeri de alkali pH’da kırmızı renk alır. Bu renk değişimi pozitif reaksiyon anlamına gelir. Besiyeri sarı rengini korumuş ise negatif reaksiyon olarak yorumlanır.
Pozitif kontrol için Proteus‘lar, negatif kontrol için Escherichia coli, zayıf pozitif kontrol için ise Klebsiella türleri kullanılabilir.
Diğer biyokimyasal testler :
Adanitol (ribitol): Riboz’un indirgenme ile yıkılmış ürünüdür. Bazı bakteriler bunu polihidrik bir alkole dönüştürebilir.
Dulsitol (galactitol) ve sorbitol (glucitol): Glukozun aldehit gurubunun indirgenmesi sırasında ortaya çıkan polihidrik alkollerdir. C grubu streptokoklar, E. coli, K. pneumonia ve birçok Salmonella için identiktir.
Mannitol’e etki: Mannoz veya fruktozun yıkım ürünlerinden olup polihidrik bir alkoldur. E. coli, bazı Salmonella, Mycobacterium ve Bacillus türleri tarafından metabolize edilir.
Eritritol: Eritroz (erythrose) isimli şekerin parçalanması ile ortaya çıkan bir alkoldur. Kimyasal yapısı; CH2OH(CHOH)2CH2OH dır. Bazı bakteriler eritritolu metabolize edebilirler.
İnositol’e etki: İnositol, hexahydroxycyclohexane genel ismi ile bilinir. Bakterilerin fosfolipitlerinde yeralır. Dokuz farklı stereokimyasal formu bulunur. Başlıcaları şunlardır : Myo-inositol, scyllitol (aminoglikozit antibiyotiklerin çekirdeğini oluşturur), d-inositol, ve l-inositol vs. Bazı bakterilerin beslenme gereksinimidir. Bilhassa K. pneumonia ayırımında faydalıdır.
Salisin’e etki: O-Hydroxymethil-Phenyl-ß-D-glucopyranoside. Bu maddenin bakteri tarafından metabolize edilip edilmediği bilhassa S.pyogenes, K.pneumonia ve S.marcences için identiktir.
Gliserol fermentasyonu: Gliserol bir alkoldür. Alkolik fermentasyonun bir minör ürünüdür. Fakat alkali ortamda veya ortamda bisülfit mevcudiyetinde çok miktarda dihydroxyacetone phosphate açığa çıkar ve NADH2 tarafından glycerol-3-phosphate’a dönüştürülür. Daha sonra bu madde defosforile edilerek enerji açığa çıkarılır ve gliserol meydana gelir. Bu yolu kullanarak enerji temin bazı bakteriler için bu test identiktir. (Bacillus gibi).
Nişasta hidrolizi: Bakterinin türüne uygun, proteinden zengin ama karbonhidrattan fakir bir besiyerine nişasta ilave edilir. İnokülasyonu takiben, uygun süre inkübe edilir, kolonilerinin üzerine Gram‘s iodine solusyonundan 1-2 damla bırakılır. Renksiz kalması nişastanın hidrolize olduğunu gösterir.
Kazein hidrolizi: Bakterinin türüne uygun, karbonhidrattan zengin ama proteinden fakir bir besiyerine inek sütü ilave edilir. Uygun süre inkübe edilir, kazein hidrolize olmuşsa koloni çevresi şeffaftır.