Summary
Bu protokol, lenf nodu dilimler halinde sunulan görüntü floresan T hücreleri için bir yöntem açıklanır. Bu teknik, geleneksel widefield floresan veya konfokal mikroskoplar ile T hücre göç gerçek zamanlı analiz izin verir.
Abstract
Nadir ifade antijenleri tespit etmek için periferik lenf düğümleri de dahil olmak üzere ikincil lenfoid organlara, naif T hücrelerinin sürekli trafik. T hücrelerinin lenf düğümleri içine göç kemokinler de dahil olmak üzere hem hücresel ve kimyasal faktörleri içeren karmaşık bir süreç. Son zamanlarda, iki foton mikroskopi sağlam lenf düğümleri T hücreleri izlemek için kendi davranış ve etkileşimleri ve diğer hücreleri ile bazı sayısal bilgiler elde etmek için izin verdi. In vivo sistemde bir açık avantajları olmakla birlikte, bu yaklaşım, karmaşık ve pahalı aletlerle gerektirir ve doku sınırlı erişim sağlar. Fare lenf düğümleri içinde T hücrelerinin davranışını analiz etmek, bir dilim testi 1, başlangıçta neurobiologists tarafından kurulan ve son zamanlarda fare timus 2 aktarılmamıştır geliştirdik. Bu teknikte, floresan etiketli T hücreleri, akut hazırlanan bir lenf nodu dilim üst kaplamadır. Bu video-makale, T hücrelerinin doku içine yerelleştirme ve göç widefield ve konfokal mikroskop ile gerçek zamanlı olarak analiz edilmektedir. In vivo olarak iki foton mikroskopi doğal ortamda görüntü T hücreleri etkili bir yaklaşım sunuyor ve T hücre göçün altında yatan mekanizmaları aydınlatmak için tamamlar tekniği.
Protocol
1. Lenf düğümleri hazırlanması dilimleri
- Gömmek için% 4, düşük erime noktası agaroz çözüm hazırlayın. PBS ve mikrodalga bu çözüm agaroz sulandırınız. Agaroz tamamen çözülür, çözüm ° C hazır olana kadar kullanılmak üzere 37 korur.
- 6-iyi doku kültürü tabak hazırlayın. 1.1 ml RPMI tam bir kültür ortamı iyi ortalama ekleyin ve her iyi bir Organotipik filtre takın. 6-plaka, 4 ° C dilim aktarmak için hazır olana kadar yerleştirin.
- RPMI tam orta ile dolu plastik bir tabak içine iç çapı 4 mm, paslanmaz çelik pullar yerleştirin. Yıkayıcılar vibratome kesilmiş dilim hücreler daha fazla konsantre olacaktır.
- Kurban, yerel hayvan refahı kurallarına uygun fare. Periferik lenf düğümleri çevreleyen doku dikkatlice çıkarın ve buz gibi soğuk PBS içeren bir plastik tabak koyun. Bu organların çok yumuşak Bakımı, lenf nodu yapısı zarar vermemek için alınmalıdır.
- % 4-agaroz jel 35 mm plastik tabak içine dökün ve ince jel düğümleri aktarmak. Agaroz jel, 5 dakika sertleşmesine buz üzerinde bırakın.
- Blok çanak çıkarın ve her bir lenf nodu etrafında 3-5 mm jel bırakmak için agar düzeltin.
- Toksik olmayan doku yapıştırıcısı ile vibratome numune disk üzerinde gömülü düğümleri takın. Buz gibi soğuk PBS ile dolu tepsi numune diski takın.
- Bölümde agar-gömülü yavaş bir dizi orta menzilli (1,5 mm) ayarlanmış vibratome hızı (0.3 mm / s) ve titreşim frekansı ile 320 mikron kalınlığında doku.
- Dikkatlice lenf nodu dilimleri, ince forseps kullanarak Organotipik kültür ekler üzerine kesilmiş olarak aktarın. Her ekleme 3 dilimleri yerleştirin. Dilim kolayca zarar görebilir gibi büyük bir özen kullanın. 320 mikron kesildiğinde tipik bir periferik lenf nodu 5 bölümden verecektir. Onlar sadece yüzeysel doku içeren, ilk ve son dilim atın.
- Her bir dilim paslanmaz çelik pullar yerleştirin. Pullar doku çevresindeki agaroz konumlandırılmış emin olun.
- Inkübe kültür plaka 37 ° C,% 5 CO 2 nemlendirilmiş inkübatör plaka T hücreleri için hazır olana kadar .
2. T hücreleri fare lenf düğümleri Yalıtımlı
- Daha önce yayınlanmış vallahi Madde 3 göre T hücreleri izole edin.
- T hücreleri hemen kullanın ve bir sonraki bölüme geçin. Aksi takdirde, lenfositler, 10 ng / ml, IL-7 ile desteklenmiş tam RPMI orta gecede kültüre olabilir.
3. Izole T hücreleri Etiketleme
- HBSS hücrelerin yıkayın. Ml'de 10 x 10 6 aynı tampon onları tekrar
- 0.5 mcM bir final konsantrasyon veren 1 mcM Hücre Tracker yeşil CMFDA içeren HBSS aynı hacimde ekleyin.
- 5 dakika boyunca 37 ° C hücre süspansiyonu inkübe edin. RPMI-orta hücreler iki kez yıkayın.
- RPMI-orta ml başına 10 x 10 6 son bir konsantrasyonda süspanse edin hücreleri. Bu etiketli hücreleri dilimleri üzerine kaplama olacak.
CMFDA dışında floresan boyalar da kullanılır, ancak bu moleküllerin belirli konsantrasyonların üzerinde potansiyel olarak toksik olduğunu akılda tutmak olabilir.
4. Lenf nodu dilimleri üzerine Kaplama etiketli T hücreleri
- Bir pipet yardımıyla yıkama iç kısmında bulunan fazla orta çıkarın. Doku kuru hale izin vermeyin, bu adımı sırasında hızlı bir şekilde çalışma.
- Yıkayıcı iç kısmında 1 2 x 10 5 hücre karşılık 10 20 ul etiketli T hücreleri hafifçe dağıtmak. Bakım pipet ucu ile doku dokunmamaya dikkat edilmelidir. Hücre süspansiyonu açılan yerde kalır emin olun.
- 37 inkübatörde hücreleri ile dilimleri yerleştirin ° C ve% 5 CO 2 lenfositlerin dokuya göç etmelerine izin verilmesi için en az 30 dk.
5. T hücrelerinin lenf nodu dilimleri içinde Görüntüleme
Bu video-makale, görüntü floresan T hücreleri widefield ters bir mikroskop ve konfokal dik bir mikroskop ile lenf nodu dilim.
- 37 ° sıcaklığı ayarlayın ° C Bizim mikroskoplar ısı kontrollü odaları ile donatılmıştır.
- Oksijenli (% 5 CO 2,% 95 O 2) fenol red-free RPMI medyum ile lenf nodu dilim sürekli perfüzyon sağlayan bir perfüzyon sistemi kurun. Bizim sistemde, perfüze medya yerçekimi ile bir taraftan görüntüleme odasına girer. Orta bir atık toplama balonuna bağlı bir pompa ile aspire edilir. Medya akış hızı 1 ml / dk olarak ayarlayın.
- Ince forseps ile 6-plaka, incelikle dilim almak ve doku içine sızmış floresan hücrelerinin kurtulmak için birkaç saniye boyunca ısınmış oksijenli RPMI orta hazırlık daldırma.
ImaT hücreleri geniş bir alan inverted mikroskop ile ging
- Dilim bir bardak çanak alt iç kısmına yapıştırılmış naylon konuları oluşan bir ölçüye göre görüntüleme odasının baş aşağı yerleştirin. Bu odada, cam, naylon konuları dilim yükseltmek ve doku içine diffüz oksijenli çözüm sağlar. Lenf düğümleri T hücre göçü oksijen kuvvetle bağlı olarak bu gereklidir. Bunun üzerine bir paslanmaz çelik yıkayıcı ekleyerek dilim sabitleyin. Bu koşullarda, dilim perfüzyon çözüm yenileme kolaylaştırır çanak alt yukarıdaki birkaç mikron yatıyor.
- Geniş bir görüş alanı (800 x 800 mm, düğümün dilim yüzeyinin yaklaşık üçte biri) yakalamak için, 10x kuru objektif lens kullanarak görüntü toplamak. Biz 10x Nikon S Florlu 0.5 NA analizler için en uygun olduğu bulundu.
Tipik bir zaman atlamalı görüntüleme deney toplam derinliği 50 mm aksiyel (z) boyutta kapsayan 5 optik uçakları yakalar. Floresan T hücreleri genellikle 10 ila 20 dakika boyunca 10 ila 30 saniye arasında değişen aralıklarla görüntülenmiş.
Görüntüleme konfokal dik bir mikroskop ile T hücreleri
Bu protokolde kullanılan konfokal mikroskop 20x suya daldırma amacı (Olympus, 20x/0.95 NA) ile donatılmış bir Leica SP5.
- Mikroskop görüntüleme aşamasında dilim sabitleyin. Not: Biz genellikle hareketsiz hazırlık bir pul.
- Z ekseni boyunca bir dizi görüntüleri toplayarak bir görüntüleme oturumu ayarlayın. Görüntü T hücreleri sağlam bir doku yapısı için, başlama pozisyonu genellikle ilk etiketli T hücre altında 5 ila 10 mikron olarak belirlenmiştir.
6. Temsilcisi sonuçları
Bu video protokol takip ederek, çok sayıda floresan T hücrelerinin düğümün T bölgesi, normalde in vivo (Şekil 1) bu özel ortamda meydana gelen bir fenomen biriken görselleştirmek için beklemeliyiz . Özellikle, T hücreleri sadece kapsül altında genellikle B hücre bölgeleri, ekarte edilmelidir. Başarılı bir deney de sağlam lenf düğümleri 4 elde yayınlanan sonuçlar ile tutarlı bir (Şekil 3) son derece hareketli bir davranış gösteren, T hücrelerinin doku (Şekil 2) işe neden olacaktır. Dilimleri içinde bireysel T hücrelerinin ortalama hız, ortalama olarak, yaklaşık 10 mm / dak (Şekil 4) olmalıdır.
Şekil 1. T hücrelerinin lenf nodu dilim birikir. Floresan etiketli T hücreleri (CMFDA yeşil) görüntü elde etme önce bir lenf düğümü dilim 30 dakika (üst resim) ilave edildi. Z yönünde 50 mikron kapsayan 5 görüntülerin maksimum projeksiyon görüntü. Parlak bir alan görüntü, alt gösterilmiştir. Görüntüler bir widefield mikroskop ile ele geçirildi.
Şekil 2. T hücrelerinin lenf nodu dilim içine alınırlar. Floresan etiketli T hücreleri (CMFDA yeşil) konfokal mikroskop kullanarak görüntü elde etme önce bir lenf düğümü dilim 30 dakika ilave edildi. Görüntüler Kesilen yüzey (üst resim) ve 40 mm (alt resim) ele geçirildi.
Şekil 3. T hücrelerinin lenf nodu dilim içinde son derece hareketli. Floresan etiketli T hücreleri 12 dakika içinde bir widefield mikroskop kullanılarak görüntülenmiştir. Bireysel T hücrelerinin Yörüngeler mavi (düşük hareketli hücreler), kırmızı (yüksek hareketli hücreler) artan deplasmanları temsil etmek için renk kodlu parça olarak görüntülenir. Parçalar Imaris yazılımı kullanılarak hesaplandı. Kesik oval varsayılan B hücresi bölgesi sınırlar ise, beyaz bir çizgi, düğümün kenarına izler.
Şekil 4 lenf nodu dilim içinde, T hücre hızı 10 mm / dak yakındır. Hızları Şekil 3'te temsil parça Imaris yazılımı kullanılarak hesaplandı.
Discussion
Biz tanıtıldı T hücrelerinin davranışı araştırmak için kullanılır lenf nodu dilimleri, üretmek için basit, hızlı ve sağlam bir teknik tanımlanmıştır. Son yıllarda, bu yöntem başarılı bir şekilde kontrol eden T hücre konumlandırma ve motilite 1,5 ekstrasellüler faktörleri belirlemek için timus ve lenf nodu dilimleri kullanarak tatbik edilmiştir. Aynı zamanda pozitif seçim sırasında ve sonra T hücrelerinin antijen tanıma 2,6 timositleri Ca 2 + tepkileri ölçmek için kullanılır olmuştur. Bindirme dilim tahlil avantajları ve sınırlamalar ele alınacak hak sunar. Notu, bu sistemin moleküler hücre göç kontrolü ile müdahale edebilmek için bir ihtiyacı farmakolojik dilimleri işlemek için faydalı, doku erişim izni verir. Görüntülemeye sonra dilimleri görüntülü edilmiş yapılar hakkında daha fazla bilgi toplamak için immünohistokimya için işlenmiş olabilir. Ayrıca, gözlem, geleneksel bir widefield floresan mikroskobu ile yapılabilir. Çözünürlük konfokal veya iki foton bir mikroskop gibi iyi değil ve bu fototoksisite prensip olarak iki foton mikroskobu ile daha tek foton ile daha şiddetli olmasına rağmen, bu basitlik avantajlarını, daha düşük bir maliyetle ve daha büyük bir seçim var eksitasyon dalga boylarında.
T hücreleri sağlam bir lenf nodu görüntüleme etiketli lenfositlerin intravenöz enjeksiyon gerektirir lenfoid organlara daha sonra ev. Biz daha önce 1 gösterdiği gibi, dilim tahlil, evlat edinen transferi deney ile mükemmel uyumlu . Ancak, T hücreleri lenf düğümleri içine ev için gerekli sürenin uzunluğu zamanla hücrelerin dışarı akması için bir eğilim var floresan boyaların kullanımı karmaşık hale getirebilir. Bu durumda Ca 2 + boya Fura-2. T hücrelerinin doku içine hızlı işe (<30 dk), dilim testi bu tür boyalar kullanmak için bir fırsat sağlar. Son olarak, bu yöntem, birçok insan dokularında T hücre fonksiyonlarını analiz için büyük bir avantaj yaşatılıyor.
Bu deneysel sistemi de göz önünde bulundurulması gereken kısıtlamalar sunar. Dilimleme ile ilişkili hasarlar, özellikle kesme yüzeyine yakın doku yüzeysel bir bölgede, T hücre işleyişini etkileyebilir. Dilim içinde hücre ölümünü değerlendirmek amacıyla, floresan boya SYTOX yeşil tehlikeye plazma zarı ile hücre nüfuz kullanmıştır. Deneyler, çoğunlukla yüzeysel doku bölgede lokalize toplam düğüm hücreleri, yaklaşık% 20 bu nükleer boya ile floresan etiketli olduğunu ortaya koymaktadır. Testi ile diğer potansiyel endişe kemokinler de dahil olmak üzere önemli çözünür faktörler korumak için dilim yeteneğidir. T hücreleri dilim içinde iyi bir motilite ekran yılından beri bu tür sorunlar etkilendiğini herhangi bir gösterge olsa da, biz görüntüleme T hücrelerinin sağlıklı bölgelerde kesim yüzeyi mikron onlarca bulunan önemini vurgulamak istiyorum. Bu protokolde gibi geleneksel mikroskoplar (widefield veya konfokal) ile yapılabilir Oysa, bu iki foton görüntüleme derinlemesine uzaysal çözünürlüğü artırmak ve fototoksisite azaltacaktır ile birlikte lenf nodu dilim hazırlık muhtemeldir.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Yazarlar, bize lenf nodu dilim gerçekleştirmek için teşvik Dr. Alain Trautmann'ın teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Ligue Nationale Contre le Kanser, Fondation pour la Recherche medicale en France ve Ortaklık pour la recherche sur le Kanser hibe kısmen desteklenmiştir.
Materials
|Name||Company||Catalog Number||Comments|
|Confocal microscope||Leica Microsystems||SP5|
|Vibratome||Leica Microsystems||VT1200S|
|Fine Forceps||World Precision Instruments, Inc.||14142|
|30 mm Culture inserts||EMD Millipore||PICM0RG50|
|RPMI||Invitrogen||61870010||Complete RPMI-medium is made by adding 10 % heat-inactivated fetal calf serum and Penicillin/streptomycin|
|Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS)||Invitrogen||14170088|
|Low gelling temperature Agarose, type VII-A||Sigma-Aldrich||A0701|
|Butyl Cyanoacrylate Glue, Vetbond||3M||1469|
|Stainless steel washers, 4 mm of inner diameter||Any Supplier|
|Cell Tracker green CMFDA||Invitrogen||C7025|
References
- Asperti-Boursin, F. CCR7 ligands control basal T cell motility within lymph node slices in a phosphoinositide 3-kinase-independent manner. J Exp Med. 204, 1167-1167 (2007).
- Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment. Nat Immunol. 6, 143-143 (2005).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification. J Vis Exp. (2007).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1869 (2002).
- Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes. Immunity. 31, 986-986 (2009).
- Gollmer, K. CCL21 mediates CD4+ T-cell costimulation via a DOCK2/Rac-dependent pathway. Blood. 114, 580-580 (2009).