2X kapsama sıraladığınızı varsayalım. Bir yerde örnek S'nin bir referans tabanı ve bir alternatif tabanı olduğunu varsayalım. Bunun bir dizileme hatası mı yoksa bir heterozigot mu olduğunu söylemek zor. Şimdi, tümü 2X okuma derinliğinde 1000 başka örneğiniz olduğunu varsayalım. Birinin iki ALT tabanı vardır; 10 tanesinde bir REF ve bir ALT var. Bu örneklerin hepsinin aynı sıralama hatasına sahip olması genellikle olası değildir. O zaman örnek S'nin het'i olduğunu iddia edebilirsiniz. Çoklu örnek arama, çok nadir olmayan SNP'lerin hassasiyetini artırmaya yardımcı olur. Burada önemli olan şeyin hatadan bağımsızlık varsayımı olduğunu unutmayın. Ataların yalnızca çok küçük bir dolaylı etkisi vardır.
Çoklu örnek arama çok nadir SNP'leri, özellikle de tekilleri cezalandırır. Yalnızca çeşitleri önemsediğinizde, bu iyidir. Tek örnekli çağrıları saf bir şekilde birleştirmek, daha yüksek bir hata oranı sağlar. Çoklu örnek arama, daha sonraki bir aşamada varyant filtrelemeye de yardımcı olur. Örneğin, 30X kapsama sekanslı bir örnek için, 45X derinliğindeki bir sitenin potansiyel bir CNV / yanlış eşlemeden mi yoksa istatistiksel dalgalanmadan mı kaynaklandığını bilemezsiniz. 45X derinlikte 1000 30X örnek gördüğünüzde, bir CNV / sistematik eşleştirmeye baktığınızı kolayca anlayabilirsiniz. Birden çok örnek, çoğu istatistiksel sinyali geliştirir.
Daha eski yöntemler, varyantları çağırırken tüm BAM'leri bir havuzda toplar. Bu gereklidir, çünkü tek bir düşük kapsamlı örnek gizli INDEL'leri kurtarmak için yeterli veriye sahip değildir. Bununla birlikte, bu stratejinin kitlesel olarak paralelleştirilmesi o kadar kolay değildir; yeni bir örnek eklemek yeniden aramayı tetikler ve bu da çok pahalıdır. Bugünlerde çoğunlukla yüksek kapsama alanı sıralaması yaptığımız için, INDEL aramasıyla ilgili eski sorunun şu anda önemi yok. GATK, daha sonraki bir aşamada örnek başına gVCF'leri birleştirdiğiniz bu yeni tek örnekli çağrı ardışık düzenine sahiptir. Bu tür bir örnek birleştirme stratejisi, 100 bin örnekle uğraşırken belki de tek mantıklı çözümdür.
Sözde haplotip tabanlı varyant çağrısı ayrı bir sorudur. Bu tür bir yaklaşım INDEL'leri aramaya yardımcı olur, ancak çoklu örnek arama ile pek alakalı değildir. Ayrıca, sorunuzdaki üç arama çeşidinden yalnızca GATK (ve bahsetmediğiniz Scalpel) genel olarak assembly kullanır. Ücretsiz ödemeler yapmaz. Platypus bunu sadece sınırlı bir ölçüde yapıyor ve pratikte pek işe yaramıyor.
Sanırım gerçekten bahsetmek istediğiniz şey isnat temelli çağrı. Bu yaklaşım, LD ile hassasiyeti daha da artırır. Yeterli örnekle, iki konum arasında LD'yi ölçebilirsiniz. 1000 konumunda bir REF okuması gördüğünüzü ve ALT okumadığını varsayalım; 1500 konumunda, bir REF okuması ve iki ALT okuması görürsünüz. Birden fazla örnek verilse bile 1000 konumundaki herhangi bir SNP'yi çağırmazsınız. Bununla birlikte, iki pozisyonun güçlü bir şekilde bağlantılı olduğunu ve baskın haplotiplerin REF-REF ve ALT-ALT olduğunu bildiğinizde, araştırılan örneğin eksik bir ALT aleline sahip olduğunu bilirsiniz. LD, sinyalleri siteler arasında aktarır ve doğru genotipleme çağrıları yapma gücünü artırır. Bununla birlikte, günümüzde çoğunlukla yüksek kapsamlı sıralama yaptığımız için, isnat temelli yöntemlerin yalnızca küçük bir etkisi var ve nadiren uygulanıyor.
Ek örneklemlerin faydası, 1. noktanızda görülmektedir. Varyant çağrısı yapma olasılığı, (1) belirli bir varyantı destekleyen kapsam derinliğinin (eşleme / temel kalite hususlarını göz ardı ederek) ve (2) arka plan bilgisi verilen varyantın mevcut olma olasılığı Derinliği düşük ve arka plan bilgisi olmayan, yetersiz şekilde kapsanan varyantların sıralama hataları olduğu varsayılacaktır. Daha fazla örnek eklemek o zaman bir pozisyonla ilgili arka plan bilgisini artırmaya hizmet edebilir.