1 LABORATUAR ÖLÇÜM METODLARI VE ANALİZ YÖNTEMLERİ, SPEKTROFOTOMETRİ
2 Ölçüm, bir uzunluğun, bir alanın, bir kapasitenin veya herhangi bir olgunun belirli bir birimcinsinden hesaplanmasıdır. Bunun içinstandart ölçü birimleri kullanılır.Ölçü birimleri, iki farklı sistemde farklı olarakbelirtilmiştir:1- metrik sistem2- SI sistem (uluslararası sistem)
10 1- ışık şiddetinden faydalanılarak yapılan ölçümler Beyaz ışık farklı dalga boyu ve renklere sahiptir. Birbirini takip eden dalgaların aynı noktaları (örneğin tepe noktaları) arasındaki uzaklık dalga boyudur.Daha kısa aralıklı tepe noktaları daha kısa dalga boylarını ve ışığın daha fazla enerji içerdiğini gösterir.
11 1- ışık şiddetinden faydalanılarak yapılan ölçümler Dalga boyu nanometre (nm=10-9 m)olarak ifade edilir. Elektromanyetik ışınlar dalga boylarına göre farklı adlarla anılırlar:nm ……….ultraviyole (UV) (mor ötesi)nm ……….visible light (görünür)750-….. nm ……….infrared (IR) (kızıl ötesi)Bir maddenin rengi, o maddeden gözümüze ulaşan görünür bölgedeki elektromanyetik ışınlardır.
12 1- ışık şiddetinden faydalanılarak yapılan ölçümler İşte, madde tarafından tutulan ışınların rengi ile maddenin görünür rengini oluşturan ışınların rengi, tamamlayıcı renkler olarak adlandırılırlar.Yani maddelerin rengi, maddelerin tuttuğu ışının tamamlayıcısı olan ışının rengidir.
13 Mavi-yeşilkırmızıYeşil-maviTuruncuMaviSarıKırmızıYeşilSarı-yeşilEflatunTransmitte (yansıyan) edilen ışığın rengiAbsorbe edilen ışığın rengiDalgaboyuSolusyonun rengi,(görünen renk),Tamamlayıcı renkTamamlayıcı renkler tablosu
14 1- ışık şiddetinden faydalanılarak yapılan ölçümler 1.1 kolorimetri: çözelti içindeki madde miktarını ölçmek için, çözeltinin renginden faydalanılır, bu tip ölçüm yapan cihaza kolorimetre denir.Ölçülecek çözeltinin rengi, değişik konsantrasyonlardaki standartların rengiyle karşılaştırarak değerlendirilir.
15 1- ışık şiddetinden faydalanılarak yapılan ölçümler 1.2. fotometri: çözelti içindeki madde miktarını ölçmek için, çözeltiden geçen veya çözeltinin tuttuğu ışık miktarından faydalanılır, bu tip ölçüm yapan cihazlara fotometre denir.Yani fotometreler, fotoelektrik kolorimetrelerdir.Fotometrelerde;◊ hem ışığın tüm bölgelerinde (UV, görünür, IR) ölçüm yapılabilir,◊ hem de renk yerine ışık ölçüldüğü için renksiz çözeltiler de ölçülebilir.
16 spektrofotometreSpektrofotometreler, maddenin renk yoğunluğunun ölçülmesiyle, madde miktarının veya konsantrasyonunun bulunmasını sağlayan cihazlardır.
17 Güneş ışığı veya bir tungsten lambadan saçılan ışık, insan gözünün beyaz olarak tanımladığı, farklı dalga boylarındaki ışık enerjilerinin bir karışımıdır.
18 Bir madde, elektromagnetik dalga spektrumunda nm uzunluğundaki görünür ışınların hepsini geçiriyor veya yansıtıyorsa beyaz görünür; hepsini soğuruyorsa (arbsorbluyorsa) siyah görünür.Görünür spektrumda mavi rengi soğuran bir made sarı renkli, sarı rengi soğuran bir madde mavi renkli görünür.yeşil rengi soğuran birmadde kırmızı renkli,kırmızı rengi soğuranbir madde yeşil renkligörünür.
19 İçerisinde organik moleküller bulunan bir çözeltiden UV-görünür bölge ışınları geçerse, çözelti bu ışınların bir kısmını seçimli olarak soğurur (absorpsiyon), diğerlerini ise çok az soğurur veya olduğu gibi geçirir (transmisyon).Transmitte edilen renk o bileşiğin görünen rengini oluşturur.Transmitte ve absorbe edilen renkler birbirini tamamlar.
20 Bir küvet içine konmuş renkli bir çözeltiden çıkan ışık şiddeti (I), çözeltiye giren ışık şiddetinden (Io) daha küçüktür.
21 Transmittans, genellikle %Transmittans (%T) olarak ifade edilir. Çözeltiden çıkan ışık şiddetinin çözeltiye giren ışık şiddetine oranı (I/Io), transmittans (T) olarak tanımlanır.Transmittans, genellikle %Transmittans (%T) olarak ifade edilir.IT =Io% T = x 100
25 Spektrofotometrenin komponentleri; IşıkkaynağıGiriş yarıklı levhasımonokromatörÇıkış yarıklı levhasıküvetdetektörSpektrofotometrenin komponentleri;Tungsten lamba, civa ark,hidrojen ve döteryum lambalarıIşık kaynağından çıkan dağınıkışıkları monokromatöre yönlendirir.Işık kaynağından gelen beyaz ışıktan uygun dalga boyunu seçip, diğerlerini elimine eder. Mercek veya prizma sistemidirMonokromatörden çıkan ışınlardan istenilen dalga boyundaki kısım geçirilir, diğerleri tutulur.Cam veya plastik numune okutma kaplarıdır.Küvetten geçen ışığınşiddetini ölçer.
26 1- ışık şiddetinden faydalanılarak yapılan ölçümler 1.3. otoanalizör: otoanalizör kabaca, numune ve reaktifleri uygun ölçülerde alıp karıştıran, belirli süre ve ısıda inkübe eden, gerekli sürelerde optik okumaları yapıp sonunda ilgili analiz sonucunu hesaplanmış olarak kullanıcıya sunan cihazlardır. Kısaca otomatik bir spektrofotometredir.
27 Bir otoanalizörün birim zamanda ( 1 saat) yapmış olduğu test sayısı önemlidir. Saatte onlarca hatta binlerce test yapan cihazlar vardır.bir hastanın acil çalışılması gerekirse, cihaza hasta serumu yüklendikten sonra, ACİL komutu verilerek öncelik acil hastasına verilebilir.numune ve reaktifin karıştırılıp, reaksiyonun gerçekleştiği küvetler ya tek kullanımlıktır ya da cihaz tarafından otomatik olarakyıkanıp tekrar tekrar kullanılır.kullanıcı sadece analizör üreticisifirmanın kitini kullanmak zorundadır.
28 otoanalizörlerde kullanılabilir dalga boyu sabittir ve üretici firma tarafından belirlenir. Kullanılabilir dalga boyu ne kadar genişse, o kadar iyi olur.otoanalizörde serum ve reaktif pipetleyen problar bir veya daha fazla olabilirler. Serum veya reaktif bulaşmasını önlemek için her pipetlemeden sonra, cihaz otomatik yıkama yapar.herhangi bir test, tekrar edilmek isteniyorsa TEKRAR komutu vermek yeterlidir.cihazdaki reaktif bölmesinin sıcaklığı önemlidir, bu yüzden bu bölmeler soğutuculudur. Genelde +4 derecedir. Fakat oda ısısı sıcaklığına sahip bölmeler de olabilir.
29 numune ve reaktif problarında seviye dedektörleri bulunmalı ve gerektiğinde herhangi bir serumu otomatik olarak seyreltebilmelidir.çok sayıda hasta sonucunu hafızasında saklayabilmeli ve her çeşit bilgisayara kolaylıkla bağlanabilmelidir.
30 1- ışık şiddetinden faydalanılarak yapılan ölçümler 1.4. flame fotometre (alev fotometresi): bir atomun elektronları, ısı etkisiyle uyarılabilirler. Bu şekilde daha üst bir enerji seviyesine ulaşmış elektronlar daha sonra eski enerji düzeylerine dönerlerken aradaki enerji farkını ışık olarak dışarı salarlar. Bu ışınlar her bir element için spesifiktir. Uygun bir dalga boyunda bu ışınların fotometrik ölçümü yapılırsa ortamdaki madde miktarıyla orantılı ışıma nedeniyle madde konsantrasyonu belirlenmiş olur. (ör, Na, K ölçümü)
31 1- ışık şiddetinden faydalanılarak yapılan ölçümler 1.5. atomik absorbsiyon (AAS): temel prensibi alev fotometresinin tam tersidir. Burada element uyarılmaz, sadece kimyasal bağından ayrılır ve iyonlaşmamış nötral atom durumunda bulunur. Atomlar bu durumda 0,001-0,01 nm arası çok dar bantlı ışımayı absorbe edebilirler. Bu ışığın kaynağı katot lambasıdır.Flame fotometrede uyarılmış atomun saldığı ışın ölçülürken, AAS de atomun tuttuğu ışın ölçülür. (ör, bakır, çinko, demir ölçümü)
32 2- iyon selektif elektrotlar (ISE) Başta Na, K, Ca, Cl va Li olmak üzere pek çok elektrolitin (iyonun) tayininde geliştirilmiş bir yöntemdir. Bu cihazlara iyon selektif analizörler denir. Burada, özel elektrotlar yardımı ile numunelerde potansiyel farkı ölçülür. Böylece numunelerdekimadde konsantrasyonutayin edilir. Her bir elementiçin ayrı bir elektrot vardır.Prensibi, iyon farkının birmembranda (zar) meydanagetirdiği potansiyel farkınölçülmesidir.
33 3- türbidimetriDeney ortamının bulanık olması durumunda, ışık kaynağından çıkan ışınların tamamı fotosele (dedektör) ulaşamaz. Fotosele ulaşan miktar, ortamın bulanıklığı ile ters orantılıdır. Bundan faydalanılarak bulanıklığa sebep olan madde konsantrasyonu hesaplanır.Bu metod genelde, numunedeki proteinlerin ölçümünde kullanılır. Proteinler denatüre edilerek bulanıklık oluşturulur. Bulanıklık, ortamdaki protein konsantrasyonu ile doğru orantılıdır.
34 4- nefelometriTürbidimetri gibi bulanıklığın ölçümü esasına dayanır. Fakat burada, ortamdaki partiküllerce, geliş eksenine göre 90° açıyla yerleştirilmiş olan fotosele doğru saptırılan ışınların ölçülmesi söz konusudur.Türbidimetriden diğer farkı, partikül sayısı arttıkça türbidimetride % T azalırken, burada artar.%T: çözeltiye giren ışığın yüzde kaçının çözeltiden çıktığını gösterir (% transmittans).
36 5- florometriBir maddenin bir çözeltide çok küçük konsantrasyonlarda bile UV etkisi altında kuvvetli flüoresans verme özelliklerine dayanan miktar tayin yöntemidir.
37 6- düşük konsantrasyonlu maddelerin ölçümü Ortamdaki madde konsantrasyonu çok düşük olduğunda, yukarıda sayılan yöntemler kantitatif ölçüm için yetersiz kalır.Bu durumda,6.1. enzim immunoassay6.2. radyoimmunoassay (RIA)6.3. kemilüminessansyöntemleri kullanılır.
38 6.1. enzim immunoassay:ELISA (enzyme-linked immunosorbant assay)EIA (enzyme immunoassay)EMIT (enzyme-multiplied immunassay technique)gibi isimleri vardır.Prensip: antijen-antikor arasındaki reaksiyona dayanır.İşaretli antijen ile işaretsiz antijen, antikorla reaksiyona girmek için yarışırlar. Tayin etmek istediğimiz işaretsiz antijendir. İşaretleyici madde olarak enzim kullanılır. Alkalen fosfataz en çok kullanılan enzimdir. Reaksiyon tamamlandıktan sonra ortama bir substrat eklenerek spektrofotometrik olarak enzim aktivitesi ölçülür.
39 6.2. radyoimmunassay (RIA) RIA, bağışıklık reaksiyonlarının spesifikliğini radyokimyasal yöntemlerle birleştiren bir analiz yöntemidir. Bu metodda işaretleyici olarak radyoaktif bir element kullanılır. En çok kullanılan I125’ dir.prensip: antijen-antikor ilişkisidir.
40 Antijen-antikor ilişkisi Örnek ile kaplı yüzey(antijenler)Nonspesifik proteinledoldurulmamışbölgelerin bloklanmasıSpesifik antijene karşı 1.cil antikorla inkübasyonEnzim bağlı antijen ile antikor kompleksisubstratSpesifik antijenin varlığınıGösteren renkli ürününoluşumu
42 6.3. kemilüminessansPrensibi RIA’ya benzer. Ancak burada işaretleyici madde olarak radyoizotop yerine reaksiyona girdiğinde ışık yayan madde yani kemilüminesan madde kullanılır.
43 7- elektroforezElektroforez, proteinlerin ve diğer elektriksel olarak yüklü moleküllerin, bir elektrik alanında göç etmelerine dayanan bir işlemdir.
44 7- elektroforez Bir molekülün göç hızı; molekülün net yüküne, molekülün büyüklüğüne,uygulanan voltajın yüksekliğine bağlıdır.Net yük, pozitif ve negatif yüklü birimlerinsayısına ve elektroforez tankının pH’sına bağlıdır.Fizyolojik pH’da çoğu proteinler anyondur; yani negatif yüklerin sayısı pozitif yüklerden fazladır.Bazı anyonlar; HCO3-, Cl-, HPO42-, SO42-, organik asitler, proteinler.Bazı katyonlar; Na+, K+, Ca2+, Mg2+
45 Elektroforez çeşitleri kağıt elektroforezi destek ortamı olarak filtre kağıdı kullanılıragaroz jel elektroforeziDestek ortamı, karbohidrat polimeri olan agaroz veya agaropektinselüloz asetat elektroforezidestek ortamı, selüloz asetat kağıtlarıpoliakrilamid jel elektroforezidestek ortamı, poliakrilamid jelnişasta jel elektroforezidestek ortamı, nişastaimmunoelektroforezjel üzerinde ayrılmış proteinler, antikorlarla etkileştirilir ve antijenik durumları hakkında bilgi edinilirkapiller elektroforezkapiller ve dedektör kullanılır
46 Kan plazması, neredeyse 100 farklı protein içerir Kan plazması, neredeyse 100 farklı protein içerir. Elektroforez sırasındaki davranışlarına göre, bunlar yaygın olarak beş farklı gruba bölünmüşlerdir. Bunlar:albuminα1-globulinα2-globulinβ-globulinγ-globulinAlbumin, kanın ozmotik basıncının korunmasında önemlidir. Ayrıca yağ asitleri, bilirubin, bazı steroid hormonlar, vitaminler ve Ca iyonları gibi lipofilik (yağsever) maddeler için taşıyıcı proteinlerdir.
47 Globulinler, lipidlerin, hormonların, vitaminlerin ve metal iyonlarının taşınmasında görev alır ve kan pıhtılaşma sisteminin önemli bir kısmını oluştururlar. Ayrıca bağışıklık sisteminin esas kısmını oluşturan antikorları (γ-globulinler) da içerirler.
48 Protein Grup Albumin α1-globulin α2-globulin β-globulin γ-globulin IgG, IgA, IgM, IgD, IgEγ-globulinLipoprotein (LDL), transferrin, fibrinojen,transkobalamin, C-reaktif proteinβ-globulinSeruloplazmin, antitrombin III, haptoglobulin,kolinesteraz, plazminojen, vitamin D-bağlayıcı proteinα2-globulinAntitripsin,antikimotripsin,lipoprotein(HDL), protrombin, transkortin, asit glikoprotein, tiroksin bağlayıcı globulinα1-globulinAlbuminProteinGrupPlazma proteinleri
50 8- kromotografiBaşka yöntemlerle ayrılamayan aminoasitler, yağ asitleri, steroid hormonlar gibi maddeleri ayırmak için kullanılır. Ayrıca çeşitli ilaçların ve uyuşturucu maddelerin analizi amacıyla emniyet teşkilatında da kullanılır.Kromotografi ile ayrılan maddelerin çoğu renksizdir. Bu yüzden maddeleri birbirinden ayırdıktan sonra çeşitli boyalarla boyamak gerekir.Destek ortamı porlu yapıdadır. Ayrıca destek ortamı iki fazdan oluşur:Hareketli faz: maddelerin hareket etmesini (yürümesini) sağlayan akıcı fazSabit faz: destek ortamı ile birlikte bulunan hareketsiz faz
51 Kromotografi çeşitleri: kolon kr.ince tabaka kr.gaz kr.HPLC (high performance liquid chromatography= yüksek perrformanslı sıvı kr.