Dergide yayınlanan yakın tarihli bir çalışmada PNASFinlandiya ve Amerika Birleşik Devletleri’nden araştırmacılar, herhangi bir kimyasal değişiklik olmadan şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2’yi (SARS-CoV-2) inhibe eden yeni bir heptad tekrar 2 (HR2) peptidi bildirdiler.
Çalışma: Spike proteinin saç tokası öncesi ara ürününü hedef alan modifiye edilmemiş bir peptit tarafından SARS-CoV-2 enfeksiyonunun nanomolar inhibisyonu. İmaj Kredisi: Kateryna Kon / Shutterstock
Arka fon
SARS-CoV-2, tüm koronavirüs hastalığı 2019 (COVID-19) aşılarını ve monoklonal antikorunu oluşturan spike (S) glikoproteininin reseptör bağlama alanında (RBD) mutasyonları barındıran tüm endişe türleri (VOC’ler) ile sürekli olarak gelişmektedir ( mAb) tedaviler etkisizdir.
SARS-CoV-2’ye karşı daha etkili antivirallere, özellikle de mutasyona karşı daha az savunmasız olan yapıları hedefleyenlere (örneğin, heptad tekrar 1 ve 2 (HR1-HR2) SARS-CoV-2 altı sarmal demeti) acil bir ihtiyaç vardır. S).
Daha önce araştırmacılar, SARS-CoV-2 S kalıntıları 1168–1203’ün 36 amino asit segmentine dayalı daha etkili HR2 bazlı inhibitörler yapmak için çeşitli yapısal mühendislik yaklaşımları kullandılar.
Çalışma hakkında
Bu çalışmada, araştırmacılar, longHR2_42 olarak adlandırılan 1162–1203 S kalıntılarını kapsayan değiştirilmemiş bir SARS-CoV-2 HR2 peptidinin, önceki tüm girişimlere göre çok daha iyi SARS-CoV-2 inhibe edici özelliklere sahip olduğunu bulmuşlardır. HR1’e bağlı longHR2_45’in yüksek çözünürlüklü kriyo-elektron mikroskobu (kriyo-EM) yapısını belirlemek için moleküler bir iskele yöntemi kullanarak HR1-HR2 demetini karakterize ettiler.
Daha sonra, nanomolar (nM) aralığında SARS-CoV-2 inhibisyonuna ulaşan Coot kullanarak 1159-1179 amino asit kalıntılarını kapsayan daha uzun bir N-terminal bölgesi olan genişletilmiş bir HR2 peptidi tasarladılar. Otomatikleştirilmiş yapı iyileştirme protokolünü kullanarak Rosetta’daki yapıyı iyileştirdiler. Benzer şekilde, berrak doğal poliakrilamid jel elektroforezi (CN-PAGE) üzerinde intrinsik floresan kullanarak HR1-HR2 kompleks oluşumunu değerlendirdiler.
Araştırmacılar, HR2 varyantları ve HR1 arasındaki karmaşık oluşumu tespit etmek için iki tahlil ve HR2’nin N-terminal uzantısının SARS-CoV-2 S’nin membran füzyon fonksiyonunu inhibe etme üzerindeki etkilerini test etmek için bir hücre-hücre füzyon tahlili geliştirdiler.
İlk tahlil, hücre yüzeyini kullandı. Escherichia koli HR2 peptitlerini, geliştirilmiş dairesel olarak izin verilen bir OmpX proteini (eCPX)-protein iskelesi üzerinde görüntülemek için. Daha sonra, araştırmacılar bu hücreleri yeşil floresan protein (GFP) etiketli HR1 ve HR1’i bağlayan HR2 peptitlerini eksprese eden GFP pozitif hücrelerle kuluçkaya yatırdı ve floresanla aktive olan hücre (FAC) sınıflandırmasını kullanarak seçtiler. İkinci tahlil, HR2-HR1 kompleks oluşumunu saptamak için haberci ribonükleik asit (mRNA) gösterimini kullandı.
Çalışma bulguları
Mevcut çalışmada geliştirilen yeni N-terminal uzatılmış HR2 peptidi, yarı maksimum inhibitör konsantrasyonla (IC50) tüm ana SARS-CoV-2 varyantlarının ~100 kat daha güçlü inhibisyonunu göstermiştir.50) hücre bazlı bir füzyon tahlili ile değerlendirildiği üzere ∼1 nM değeri. Özellikle, Omicron varyantına karşı ∼10 kat daha düşük inhibitör aktiviteye sahipti. Omicron’un HR1 bölgesindeki – Q954H, N969K ve L981F – tümü HR1 ile HR2’nin N-terminal uzantısı arasındaki bölgede yuvalanmış üç mutasyon, longHR2_42’nin daha zayıf inhibisyon aktivitesini açıkladı.
SARS-CoV-2 enfeksiyonunun şeması ve HR2 peptitleri tarafından inhibisyon. (I) SARS-CoV-2, S proteininin S1 alanı ile etkileşim yoluyla konak hücre reseptörü ACE2’ye bağlanır. (II) Konak hücre proteazları tarafından bölünmeden sonra, S1 alanı serbest bırakılır ve S proteininin S2 alanı, konakçı hücre zarına uzanır. (III) Hafif asidik pH ile tetiklenen S2 alanı, viral ve konakçı hücre zarını yakın bir yere çekerek geri katlanır ve (IV) HR1 ve HR2 alanlarının katlanması, viral zarın konakçı hücre zarı ile füzyonunu katalize eder. (V) longHR2_42 inhibitörünün mevcudiyetinde, S proteini konak hücre reseptörüne, (VI) bölünmeden sonra longHR2_42 inhibitörünün HR1 domainini bağladığı ve (VII) HR1 ve HR2 domainlerinin birlikte katlanmasını önlediği benzer şekilde bağlanır. ve membran füzyonunu bloke eder. Bu modelde, füzyonu engellemek için inhibitör için potansiyel bağlanma bölgelerinin yalnızca bir alt kümesinin işgal edilmesi gerekir.
Delta VOC, IC’ye karşı50 değerler, VSV-SARS-CoV-2 enfeksiyon tahlili ile otantik SARS-CoV-2 enfeksiyon tahlilleri arasında yaklaşık beş kat değişmiştir.
Ayrıca araştırmacılar, longHR2_42’nin, çalışmada açıklanan üç bağlanma tahlilinin hepsinde HR1 için görünür afinitede karşılık gelen bir artış göstermediğini kaydetti. Aynı şey için iki olası açıklama var. İlk olarak, bu testler afinitedeki küçük değişiklikleri tespit edecek kadar hassas değildi. Bununla birlikte, diğer faktörlerin HR2 türevli peptitlerin anti-SARS-CoV-2 etkinliğini etkilemesi daha olasıdır.
Tek virüs görüntüleme, SARS-CoV-2 füzyonunun hücre reseptörlerini barındırması için dokuz ila 12 S proteininin gerekli olduğunu ortaya çıkardı; bu nedenle, tek bir inhibitör protein füzyonu önleyebilir. Ayrıca, S protein bölünmesi, transmembran proteaz serin 2 (TMPRSS2) veya katepsin gerektirir. Araştırmacılar, yıkama deneylerinde katepsini inhibe etmek için dinamin inhibitörü dynasore-OH eklediğinden, peptit bağlanması için SARS-CoV-2 S’nin saç tokası ön ara maddesini oluşturdu. Bu nedenle, TMPRSS2’nin yokluğunda virüs ve peptit zayıf bir ilişkiye sahipti, bu nedenle inhibisyon ömrünü sadece 15 ila 20 dakika ile sınırlandırdı. Bununla birlikte, longHR2_42’nin gözlemlenen arttırılmış afinitesi, S bölünmesi için gerekli olan konakçı hücre proteazlarından bağımsızdı.
Sonuçlar
SARS-CoV-2 S’nin HR2 sarmal bölgesi, VOC’lerine ve daha uzaktan ilişkili virüslere karşı çalışacak güçlü bir peptit türevi anti-SARS-CoV-2 terapötik kaynağı olma potansiyeli gösterdi. Ayrıca, longHR2_42 peptidi, virüs enfeksiyonu tahlillerinde yıkanmasına rağmen uzun bir inhibisyon ömrüne (üç saatten fazla) sahipti ve bu, SARS-CoV-2 S proteininin saç tokası öncesi bir ara ürününü hedef aldığını düşündürdü. Gerçekten de çalışma verileri, SARS-CoV-2 S glikoproteininin saç tokası öncesi ara maddesi için daha fazla destek sağladı.
Yazarlara göre, longHR2_42 peptit dizisinin uzatılması, gücünü artırabilir. Ek olarak, dizi optimizasyonu, aktivitesini daha da iyileştirebilir ve diğer yeni SARS-CoV-2 varyantına özgü peptitleri geliştirmek için bir platform sağlayabilir.
Dergi referansı:
- Spike proteinin saç tokası öncesi ara ürününü hedef alan modifiye edilmemiş bir peptit tarafından SARS-CoV-2 enfeksiyonunun nanomolar inhibisyonu. Kailu Yang, Chuchu Wang, Alex JB Kreutzberger, Ravi Ojha, Suvi Kuivanen, Sergio Couoh-Cardel, Serena Muratcioglu, Timothy J. Eisen, K. Ian White, Richard G. Held, Subu Subramanian, Kendra Marcus, Richard A. Pfuetzner, Luis Esquivies, Catherine A. Doyle, John Kuriyan, Olli Vapalahti, Giuseppe Balistreri, Tom Kirchhausen ve Axel T. Brunger, PNAS 2022, DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.2210990119, https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2210990119
.