Deoksirübo Nükleik Asit Ekstraksiyon Yöntemleri
Mevcut birçok ekstraksiyon yöntemi vardır ve bunlar Deoksirübo Nükleik Asit’yı yararlı bir şekilde ekstrakte etme yetenekleri açısından farklılık gösterir. Dikkate alınacak faktörlerden kimileri, tahlil edilecek numunenin cinsi, işlenmesi için gereken müddet, cerrah müdahalesi, kontaminasyon riski ve kullanım güçlüğü veya kolaylığıdır. Bu, galibiyetli adli Deoksirübo Nükleik Asit profillemesinin temelidir. Seçim yönteminin misyonu yalnızca Deoksirübo Nükleik Asit’nın her bir örnekten yararlı bir şekilde […]
Mevcut birçok ekstraksiyon yöntemi vardır ve bunlar Deoksirübo Nükleik Asit’yı yararlı bir şekilde ekstrakte etme yetenekleri açısından farklılık gösterir. Dikkate alınacak faktörlerden kimileri, tahlil edilecek numunenin cinsi, işlenmesi için gereken müddet, cerrah müdahalesi, kontaminasyon riski ve kullanım güçlüğü veya kolaylığıdır. Bu, galibiyetli adli Deoksirübo Nükleik Asit profillemesinin temelidir. Seçim yönteminin misyonu yalnızca Deoksirübo Nükleik Asit’nın her bir örnekten yararlı bir şekilde ekstrakte edilmesini sağlamakla kalmaz, aynı zamanda amplifikasyon gibi öbür süreçlere müdahale edebilecek mümkün inhibitörleri de ortadan kaldırmalıdır.
Deoksirübo Nükleik Asit Ekstraksiyonu İçin Teknikler
Deoksirübo Nükleik Asit ekstraksiyonunda kullanılan en yaygın tekniklerden biri, Deoksirübo Nükleik Asit’yı bozulmadan koruyan geçiş metal iyonlarını bağlamak için iyon başkalaşımını kullanan bir kenetleme reçinesi olan Chelex’tir. Chelex yönteminin avantajı süratli olması, çoklu tüp transferleri gerektirmemesi ve toksik organik çözücüler kullanmamasıdır. Ana dezavantajı, amplifikasyon sürecine müdahale eden inhibitörleri çıkaramamasıdır. İnhibitörlü numuneleri işlerken, proteinleri denatüre etmek ve Deoksirübo Nükleik Asit’yı hücreden hür bırakmak için deterjanlar ve proteazlar kapsayan bir tuz solüsyonu kullanılır. Bu tuzlu suda gerçekleştirilen hücrelerin ufalanmasını gerektiren organik ekstraksiyon yönteminin kullanılması tavsiye edilir.
Bu kokteyl, Deoksirübo Nükleik Asit’yı sulu fazda bırakan bir fenol-kloroform-izoamil alkol karışımı kullanılarak ayrılabilir. Ekstrakte edilen Deoksirübo Nükleik Asit sulu fazdan etanol çökeltme yoluyla veya numunelerde Deoksirübo Nükleik Asit’nın ilave saflaştırılmasına ve konsantrasyonuna izin veren bir santrifüjlü filtre birimi ile konsantre edilebilir. Organik ekstraksiyon yönteminin avantajı, güç örneklerden bozulmuş ve / veya düşük miktarda Deoksirübo Nükleik Asit genetik materyal elde edebilmesidir. Ayrıca PCR için inhibitörlerin varlığını galibiyetli bir şekilde ortadan kaldırabilmesidir. Bu yöntem en emin ve yararlı yöntemlerden biri olmaya devam ederken, aynı zamanda çok zaman akdikenidir. Tehlikeli kimyasallar kullanır ve daha fazla uygulamalı mücadele ve dahil olan çoklu tüp transferleri nedeniyle kontaminasyon ve numunelerin hatalı kullanımı için artan riskler ortaya çıkarır.
Deoksirübo Nükleik Asit Karışımlarında Diferansiyel Liziz
Cinsel suçlarda bir araya gelen kabidelerin genetik tahlili genellikle iki veya daha fazla katılımcının genetik profillerini içerir. Bu cins karışımlarda, bireylerin genetik katkısı genellikle balanssızdır. Bazı durumlarda, biyolojik karışım minimum düzeyde bir katkıda bulunur, genellikle cinsel hücum vakalarında faildir. Bu donörün genetik oranı, duyarlılık hudutları veya daha fazla miktara sahip bileşen tarafından reaksiyon doygunluğu nedeniyle muhtemelen tespit edilmez. Çoğu gidişatta, oranlar 1: 20’yi aştığında, Deoksirübo Nükleik Asit karışımındaki minör katkı tespit edilemez.
Cinsel hücum vakalarında kabidelerin elde edilmesi, Deoksirübo Nükleik Asit adli tıp analistleri için büyük bir zorluktur. Çünkü Deoksirübo Nükleik Asit’nın epitel kurban ve sperm fail hücrelerinden ayrılmasını gerektirir. Diferansiyel ekstraksiyon şehirk olarak 1986 yılında Gill ve ekibi tarafından organik fenol-kloroform ekstraksiyonunun bir modifikasyonu olarak belirlenmiştir. Ve buna diferansiyel lizis ismi verilir çünkü sperm dışı hücreler deterjan ve proteazlarla seçici olarak ufalanır. Sperm ise sperm başındaki proteaz rehabilitasyonuna dayanan ağır disülfit çapraz bağlı proteinler nedeniyle hücreler ufalanmaz. Deoksirübo Nükleik Asit adli tıp laboratuvarlarında, diferansiyel lizis yöntemi, spermatozoayı epitel hücrelerinden ayırmak için uzun müddettir standart olmuştur. Bu teknik kuramk olarak daha evvel belirtildiği gibi kuramk olarak iki fraksiyon sağlayabilse de, ayrılma her zaman tamamlanmayarak karışık genotiplerle sonuçlanır.
Öbür Deoksirübo Nükleik Asit Ekstraksiyon Yöntemleri
Sperm ve epitel hücrelerini cinsel hücum örneklerinden ayırmanın başka yöntemleri de vardır. Differex ™ sistem yöntemi, epitel hücrelerinin proteinaz K-seçici sindirimini, ardından diferansiyel santrifüjlemeyi ve faz ayrılmasını içerir. Bu yöntemin Deoksirübo Nükleik Asit laboratuvarlarında kullanılması, karışık lekelerden sperm Deoksirübo Nükleik Asit’sının çıkarılması için iki safhalı yönteme denk faydalık sunduğunu göstermektedir.
İnsan Belirleme İçin Moleküler Yöntemler
Adli bir civarda Deoksirübo Nükleik Asit testinin şehirk kullanımı 1986’da olmuştur. İngiltere’de Leicestershire’da iki kız çocuğu cinsel hücumya uğramıştır, ardından 1983 ve 1986’da barbarca öldürülmüştür. Bu dava bir masumun yargılandığını ve 1 yıl sonra kabahatli kabahatlinin bulunup işlendiğini göstermiştir. Son 30 yılda, Deoksirübo Nükleik Asit moleküler tahlili adli araştırmalarda ehemmiyetli bir vasıta haline gelmiştir. Günümüzde, Deoksirübo Nükleik Asit profili, polimeraz zincir reaksiyonu PCR incelemelerine dayanmaktadır. Bu yöntem, otozomal STR’leri, Y ve X kromozomlarını içerir. PCR, bir bölgenin birçok kopyasını elde etmek için genom üzerindeki muhakkak bir bölgeyi kezlerce arttırma harekâtıdır.
PCR’den evvel Deoksirübo Nükleik Asit’nın ölçülmesi gerekir ve bu doğru amplifikasyonunu sağlamak için bu çok ehemmiyetlidir. İlk emeli, izolasyondan kaynaklanan Deoksirübo Nükleik Asit şablonunun miktarını belirlemektir. Farklı doğrulukta birçok yöntem vardır, ancak örneklerde bulunan Deoksirübo Nükleik Asit konsantrasyonunu öğrenmek, adli tıp bilimcisinin, kalan bir genetik profil elde etmeyi mümkün kılmak amplifikasyonu için gereken ideal Deoksirübo Nükleik Asit miktarını oluşturmasına izin verir. Cinsel suçlarda bir araya gelen kabidelerin genetik tahlili genellikle iki veya daha fazla katılımcının genetik profillerini içerir. Bu cins karışımlarda, bireylerin genetik katkısı genellikle balanssızdır. Bu, muhtemelen PCR’yi etkilediği öğrenilen seçimli amplifikasyon gibi bir dizi stokastik etki yoluyla belirleme sürecini daha çook bozar.
Kısa Tandem Tekrar STR Tahlili
Mikro uydular veya STR’ler, arkası arda tekrarlanan bir nükleotid çekirdeği içerir ve adli bilimlerde kullanımları insan belirlemesinde yeni bir yol açmıştır. STR’lerin, fazla değişken göstergeçleri nedeniyle yüksek derecede ayrımcılığa sahip oldukları iyi bilinmektedir. Bu, failin kabahat mahalline veya mağdura dahil edilmesi kastedildiğinde yararlıdır. Artefaktlar, adli vakalarda sık karşılaşılan bir meseledir. Biyolojik olanlar ve enstrümantal olanlar, eksiksiz ve doğru bir STR profili oluşturmak için genellikle sıralanmalıdır. Ufalanmış Deoksirübo Nükleik Asit’yı gösteren biyolojik kabideler genellikle cinsel hücum vakalarında bulunur. Ve PCR ürünleri daha küçük olduğunda daha etkili bir şekilde geri kazanılabilir. PCR primerlerini STR bölgesine yaklaştırarak, aynı bilgiler korunurken ürün boyutları eksiltilebilir. Uygulamada, tehlikeye atılmış Deoksirübo Nükleik Asit örneklerinden bilgilerin kurtarılmasındaki zafer oranları, geleneksel STR kitlerine kıyasla mini STR sistemleriyle çoğalır.
Cinsiyet kromozomal STR, bir kişinin biyolojik soyunu gösterir ve akrabalar arasında düşük bir dışlama eforu elde eder. Y-STR göstergeçleri, farklı ekstraksiyonun mümkün olmadığı durumlarda, azospermik bir erkekte veya yaşlı cinsel lekelerde karşı türden karışık profiller laf konusu olduğunda rol oynayabilir . X-STR markörleri çok muhtelif adli uygulamalara sahiptir, teyze, yeğen ve kuzenler gibi akrabalar arasındaki ilişkiyi kurmak için kullanılabilir. Ayrıca, kuramk ve şehirk ampirik kabide, 13 RM Y-STR setinin süratle değişen Y-STR’ler erkek izafi farklılaşmadan daha yüksek bir büyüklük sırasına erişebildiğini göstermek için sağlanmıştır. Bu neredeyse bitirilmiş erkek bireyselleşmesinin etkileri, adli tıp uygulamalarında büyük fayda sağlar. Misalin, adventif haplotip eşleşmeleri nedeniyle masum bireylerin cinsel araştırmalara dahil edilmesini eksiltmek için kullanılabilir.
Tek Nükleotid Polimorfizmleri SNP’ler Tahlili
SNP’ler, muhakkak bir noktada bireyler arasında tek bazlı bir dizi varyasyonudur ve insan genomundaki milyonlarca bölgede yer alır. Bu da bireyleri birbirinden ayırt edebilecekleri anlamına kazanç. SNP’ler, stokastik fenomen göstermeyen bozulmuş Deoksirübo Nükleik Asit örneklerinden bilgileri kurtarabilir. Örnek operasyona ve bilgi tahlili daha otomatik hale getirilebilir çünkü boyuta dayalı bir ayrıma gerek yoktur. Ayrıca etnik köken ve muhakkak fiziksel özellikleri hipotez etme yeteneğine sahiptir. Adli Deoksirübo Nükleik Asit tipleme uygulamalarında SNP’leri kullanmanın en büyük zorluklarından biri, küçük miktarlarda Deoksirübo Nükleik Asit’dan sağlam PCR multiplekslerinde yeterli sayıda SNP’yi aynı anda amplifiye edememektir.
Tek bir SNP, çok alelik bir STR işaretleyiciden daha az bilgi verdiğinden,makul bir ayrım eforu elde etmek için daha fazla sayıda SNP’yi tahlil edilmeis gerekir. Eskiden, yüksek yoğunluklu SNP dizileri, yüz binlerce hatta milyonlarca SNP’nin paralel olarak tahlil edilmesine izin vermiştir. SNP dizisinin temel şehirkeleri, Deoksirübo Nükleik Asit hibridizasyonunun yakınsaması, floresan mikroskobu ve katı yüzey Deoksirübo Nükleik Asit yakalamadır. SNP dizilerinin üç lüzumlu bileşeni, hareketsizleştirilmiş alele özgü oligonükleotid Ankara Sanayi Odası probları kapsayan bir dizidir. Floresan boyalarla etiketlenmiş, gayenin ufalanmış nükleik asit dizileri, hibridizasyon sinyalini kaydeden ve yorumlayan bir tespit sistemidir. Bununla birlikte, bu diziler tipik olarak yüzlerce nanogram Deoksirübo Nükleik Asit gerektirir. Bunlar genellikle küçük biyolojik lekelerden kaynaklanan adli vaka örneklerinden elde edilememektedir. Ayrıca bu sebeple ata çalışmalarında daha sık kullanılmaktadır.
Bir bialelik veya di-alelik polimorfizmin başka bir formu, nükleotidlerin veya bir Deoksirübo Nükleik Asit segmenti olabilen INDEL’in sokulması-silinmesidir. Çoğu INDEL, birkaç nükleotid uzunluk farklılığından oluşan alel sergiler. PCR amplikonları 160 bp’den daha az olacak şekilde planlanmıştır ve bununla yaklaşık 300 pg Deoksirübo Nükleik Asit şablonuna kadar bütün bir profil elde edilebilmiştir. Bununla birlikte, tüm INDEL’ler tüm popülasyonlarda oldukça bilgilendirici değildir ve insan genomundaki INDEL’lerin bütün sayısı bilinmemektedir.
Hem SNP’ler hem de INDEL’ler artık tüm rutin adli tıp laboratuvarlarında bulunan cihazlarda parça uzunluğu tahliline dayalı multipleksler kullanılarak tiplendirilebilir. Böylece markör aralığını kullanılan STR’lerin ötesine genişletmeyi mümkün kılar. Son yıllarda, çok sayıda SNP’ye dayalı haplotip sistemleri, tahlil için güçlü bir seçenek sağlayan STR’lerinkine yakın ayırt edici eforları nedeniyle adli alan için optimal göstergeçler olarak denenmektedir. Mikrohaplotipler MH’ler, 200 nükleotidden daha az bir aralıkta 2 veya daha fazla SNP’ye sahiptir. Son derece düşük rekombinasyon oranları, ufalanmış Deoksirübo Nükleik Asit ve karışım örnek tahlili olan durumlarda faydalı STR’lere eş ayırt etme eforu vardır.
Mitokondriyal Deoksirübo Nükleik Asit Tahlili
Mitokondriyal Deoksirübo Nükleik Asit mtDNA tahlili genellikle Sanger dizileme kimyası kullanılarak yapılır. Bu Deoksirübo Nükleik Asit sıralaması, hem ileri hem de ters yönde gerçekleştirilir. Böylece tamamlayıcı iplikler, kalite kontrol emeliyla birbirleriyle karşılaştırılabilir. Bugüne kadarki çoğu adli Deoksirübo Nükleik Asit çalışmasının odak noktası, kontrol bölgesinde genellikle HVI HV1 ve HVII HV2 olarak adlandırılan iki hiper değişken bölgeyi içermektedir. Zaman zaman kontrol bölgesinin HV3 olarak öğrenilen üçüncü bir kısmı, test edilen bir örnekle alakalı daha fazla bilgi sağlamak için araştırılır. İnsan mitokondriyal Deoksirübo Nükleik Asit’sının kesinlikle annelerden servet kaldığı düşünülür ve genellikle ebeveyn bağlarında kullanılır.
Ortadaki sperm hücresi parçası mtDNA içerir ve bu Deoksirübo Nükleik Asit otozomal Deoksirübo Nükleik Asit’dan daha mukavemetlidir. Çünkü küçük dairesel genomlarda, mitokondrinin çift çeperi ve dairesel yapı bozulma süreçlerine karşı koruyucu casuslar olarak işlev görür. MtDNA için adli tıp uygulamaları, bozulmuş veya düşük miktarda Deoksirübo Nükleik Asit kapsayan örneklerin analizini kapsar. Ve bu, Çar II. Nicholas ve kardeşi Georgij Romanov’un kimliğinin tanımlanması için kullanılmıştır . Fiziksel ayırmanın yanı gizeme, kisminin mtDNA’sının birlikte amplifiye edilmemesini sağlamak için erkek için sekansa özgü primerler SSP kullanılmıştır. Primer tasarımı, bukkal sürüntülerin mtDNA tahlilinden sonra tanımlanan katılımcılar arasındaki mtDNA haplotip farklılıklarına dayanmaktadır. Bu prosedür, bir vajinal çubukta bulunan tek bir sperm hücresinden erkek mitotipinin karakterizasyonuna olanak tanır ve belirlenmesinde kullanılmıştır. Yakın zamanda yapılan yaklaşımda mtDNA’nın mikromanipülasyon tekniği ile vajinal kanaldaki sperm hücrelerinin belirlenmesinde kullanılabileceği gösterilmiştir.