Summary
Zebrafish maksiller Bärbel ektodermal, mezodermal ve nöral krest türevleri içeren bir kabukla duyu organ. Önemlisi, yetişkin Bärbel proksimal amputasyon sonra yeniden oluşturabilirsiniz. Bu video maksiller Bärbel gelişimi tanıtır ve Bärbel örneklerin toplanması, gömme ve alt görüntüleme ile takip rejenerasyon ikna etmek için bir cerrahi protokolü göstermektedir.
Abstract
Barbels cilt duyusal uzantıları, balıklar, sürüngenler ve amfibiler bulundu. Zebra balığı Danio rerio barbels-kısa bir burun çifti ve uzun maksiller çiftinin iki çift geliştirir. Bärbel doku, deri hücreleri, salgı bezleri, tat tomurcukları, melanositler, dolaşım damarları ve duyusal sinirler dahil olmak üzere ektodermal, mezodermal ve nöral krest kökenli hücreler içerir. Çoğu yetişkin doku aksine, maksiller Bärbel, bize yaşam döngüsü boyunca bu doku tiplerinin geliştirme ve bakım görselleştirmek için izin, optik açıktır.
Bu video maksiller Bärbel (yaklaşık bir ay sonrası döllenme başlamadan) erken gelişim gösterir ve yenilenme yetişkin apendiks (> 3 ay sonrası fertilizasyon) ikna etmek için bir cerrahi protokol göstermektedir. Kısaca, bir anestezi balık sol maksiller karakeçi maksilla kaudal kenarı hemen distalinde steril forseps ile yükselir. Ince, steril bir yaylı makas amputasyon düzlemde anatomik için bir dönüm noktası oluşturan bu seviyede Bärbel mili kesmek için forseps karşı konumlandırılmış. Rejeneratif büyüme ve kontralateral Bärbel karşılaştırıldığında bu uçağa göre ölçülebilir. Bärbel doku yaralanma 2 hafta içinde maksimum regrowth ulaşan hızla yeniler.
Rejenere Bärbel analiz teknikleri, standart bir DNA elektroforez jel kuyulardan barbels eşli çiftler (yeniden ve kontrol) diseksiyon ve gömme içerir. Gömülü örneklerin uygun bir brüt morfolojisi ve morfometri stereomikroskop altında fotoğraflandı ve parafin histoloji gibi downstream uygulamaları öncesinde hafta boyunca saklanan cryosectioning ve / veya tüm montaj immünohistokimya olabilir. Bu yöntemler, in vivo doku sistemi, birden fazla hücre tiplerinin yenileyici kapasitesi zebrafish genetik kapsamında eğitim için bir roman olarak maksiller karakeçi kurmak .
Protocol
Zebra balığı yetiştiriciliği
Zebra balığı, 1 standart yöntemler göre ev sahipliği ve yetiştirilir . Geçmiş geç larva döneminde, bir zebrafish gelişimsel aşaması, kuyruk yüzgeci (posteriormost hypural plaka) tabanı standart uzunluğu üst dudak anteriormost noktası (SL) veya milimetre olarak düz bir çizgi mesafe ölçülebilir 2. Yaklaşık bir ay sonrası fertilizasyon (10-12 mm SL), burun ve maksiller barbels sırasıyla, koku çukurların yanında ve arka köşelerinde radyografları epitelyal tomurcuklar gibi şeffaf görünür. Zebra balığı olgunlaştıkça, barbels dar, bıyık gibi uzantıları içine uzanır. Maksiller Bärbel büyük (2-3 mm) ve işlemek için kolay olduğundan, protokolü sadece bu özel apendiks için geçerlidir; benzer teknikler, ancak, küçük burun Bärbel adapte olabilir.
Bärbel Kırpma
- Sistem suyun pH 7.0 tamponlu (etil 3 aminobenzoate methanesulfonate) batırılarak istenilen aşamada (örneğin, 1.5-2.5 cm SL, ~ 3-6 ay sonrası fertilizasyon)% 0.015 MS-222 yetişkin Zebra balığı uyuşturan. Durdurana kadar yüzmeye hareketleri gözlemleyin ve solungaç havalandırma yavaş ve düzenli bir hale gelir. Balık büyüklüğüne bağlı olarak, tam bir anestezi yaklaşık 2-5 dakika sürer.
- Bir akvaryum balık ağı kullanarak, bir defada 1-3 balık transferi bir Petri kabındaki ıslak kağıt havlu katlanmış bir parçası. Künt bir spatula kullanarak, şark onlar kadar birbirlerine ve sol lateral yan paralel şekilde balık. Katlama, işlem sırasında cilt ve solungaçları nemli tutmak için operculum'un kadar tüm vücudu kaplayan balık, (solungaç kapakları) kaudal parçası üzerinde ıslak bir kağıt havlu parçasıdır.
- Kafası bölgeyi aydınlatmak için düşük açılı ışık kullanarak, stereomicroscope altında Petri plaka. Maksillanın arka ventral köşesi (Şekil 1) çıkıntı sol maksiller Bärbel kaide üzerinde odaklanın.
Şekil 1.
- Sıkıca Bärbel maksillanın kenarına hafifçe distal şaft kavramak. Bärbel mili Elevate ve forseps sadece proksimal ince uçlu bir yaylı makas çeneleri eklemek. Makas istikrar için forseps dokundu olabilir. Kesme kenarı maksilla kenarına yaklaşana kadar Bärbel mil boyunca makas çeneleri kaydırın. Bärbel mili kesmek için makas kapatın. Kesilmiş karakeçi, hala forseps kavradı sabitleme ya da daha fazla gözlem için çıkarılabilir.
- Hemen bir damla metilen mavisi yüzeysel mantar enfeksiyonu kontrol etmek için içeren temiz su (~ 500 ml) küçük bir tank için balık transferi. Balık bir gecede kurtarmak için izin ver. Ertesi sabah, balık yetiştirme sistemi dönün. Bärbel rejenerasyon 2 hafta sonra gözlenir.
Uyumlu Bärbel Çiftlerin Agar gömülmesi
- Uygun ötenazi tekniği ile balık toplayın ve ajitasyon ile 4 ° C gecede tamponlu salin (PBS)% 4, 50 ml tüp paraformaldehid-fosfat düzeltmek. Fiksatif hacmi en az on kez doku hacmi olmalıdır. Fiksasyon sonra, onaylanmış bir kapta paraformaldehid atık imha ve doku PBS çeşitli değişiklikler iyice durulayın.
- % 2 250 ml cam şişesi 150 ml hazırlayın agaroz (T m ~ 37 ° C) distile su. Tamamen eriyene kadar bir mikrodalga veya sıcak plaka ile Isı, periyodik olarak ajitasyon. 50-60 ° C su banyosu içinde olan erimiş çözüm dengelenmesi.
- Standart bir jel elektroforezi teçhizat sıkıca tampon odasının yanında karşı küçük bir contalı jel kalıp (~ 100 ml jel hacmi 10 x 10 cm) koyarak birleştirin. 2-4 küçük dişli örnek tarak (4 x 1.5 mm).
- Bir yüzey üzerinde, çok sığ kuyular oluşturan, tarak tabanı kapsayacak sadece kalıp içine erimiş agaroz dökün. Hemen geri kalan agaroz sıcak su banyosu içine koymak, bu doku (9-12 Adımlar) gömmek için daha sonra kullanılabilir olacak. Pipet agaroz aynı sıcaklığı tutmak için uzun bir cam Pasteur pipeti balonun içine koyun.
- 20-30 dakika sertleşmesi için jel izin verin. Tarak çıkarın, sonra tampon odasından sertleştirilmiş jel içeren jel kalıp çıkarmak. Jel dışarı slayt değildir laboratuvar bant ile jel kalıbın açık tarafı sıkıca bantlayın. Bu bant ek agaroz (Adım 13) daha sonra eklenebilir böylece agaroz yüzey üzerinde birkaç milimetre uzatmak gerekir.
- Bir stereomikroskopta aşamasında jel kalıp yerleştirin. Boş bir iyi büyütmenize ve kenarları odak noktası haline getirmek.
- Iyi komşu agaroz yüzeyine bir damla su veya sabit Bärbel örnekleri (örneğin, yeniden ve kontrol) içeren tampon pipetle. USIng nemli örneklerdir kuyunun içine sürükleyin ve onları aşağıya doğru itin, böcek iğne eğildi. Orient Bärbel milleri birbirine paralel ve iyi zıt uzun kenarlarına dizilen. Yüzey gerilimi, doku pozisyonda tutun yardımcı olacaktır.
- Gömmek için hazır olduğunuzda, ince bir pipet veya aşırı sıvı kaldırmak için iyi bir laboratuvar doku köşe kullanın. Doku kurumasına izin vermeyin hızla çalışın.
- Isıtılmış cam Pasteur pipeti kullanarak, yavaşça yerine mühür Bärbel doku örneklerinde ve çevresinde taze erimiş agaroz pipetle. Doldurmayın. Agaroz sertleşir önce, böcek iğneli son dakika ayarlamaları yapmak.
- Iyi yanında numaralı bir kağıt numune etiket yerleştirin ve agaroz küçük bir damla ile sabitleyin.
- Numunelerin her bir kuyu için 6 - 10 arasındaki adımları tekrarlayın.
- Görüntü kalibrasyonu için İsterseniz, baskılı mikrometre ölçeğinde (örneğin, bir parça kağıt yerleştirin http://incompetech.com/graphpaper/multiwidth/ de boş bir dibine). Kuyunun dibine kağıt düzleştirin ve sıcak agaroz ile örtün.
- Tüm örneklerin gömülü sonra, agaroz jel yüzey sertleştirilmiş damla, düzensiz olacaktır. Düz bir yüzey üzerinde jel yerleştirin ve üst yüzeyi tekdüze ek erimiş agaroz kadar yavaşça dökün. Düzgün bir yüzey elde etmek için gerekli agaroz en az miktarda kullanın; çok agaroz iletilen ışık fotoğrafçılığı belirsiz. Bu üst tabaka sertleşmesine izin verin.
- Jel şimdi her Bärbel çifti için brüt morfolojisi kaydetmek için bir stereomikroskopta aşamasında fotoğrafı olabilir. Resim kalibrasyonu gömülü mikrometre ölçeğinde fotoğrafını elde edilir.
- Tüm jel, ıslak kağıt havlu sarılır ve birkaç hafta boyunca 4 ° plastik bir torba içinde mühürlü saklanabilir.
- Ayrıntılı analiz için jel agar blokları barbels eşlemeli çifti içeren bir neşter veya jiletle kesip olabilir ve parafin histoloji işlenen veya standart yöntemler ile 3,4 cryosectioning. Alternatif olarak, bireysel barbels suda durulanır ince iğneler, agaroz disseke ve diğer downstream uygulamalar (örneğin, tüm montaj immünohistokimya veya konfokal mikroskopi) işlenmiş olabilir.
Discussion
Zebrafish maksiller Bärbel zebrafish çeşitli hücre tiplerinin büyüme, bakım ve yenilenme eğitim için atıl doku sistemi. Bärbel apendiks hiçbir insan analog olmasına rağmen, içerdiği hücre tipleri çok mümkün optik açık ve anatomik basit bir silindirik yapıdaki cilt bezleri, melanosit, dolaşım damarları ve sinirleri çalışmak için korunmuş bulunmaktadır. Iyi çalışılmış bir kuyruk yüzgeci, Bärbel doku amputasyon tarafından yeniden başlatılabilir. Maksilla sınır anatomik bir dönüm noktası olarak kullanarak, amputasyon düzlemde Bärbel büyütme ölçümü kolaylaştırmak, hassas şekilde yerleştirilmiş olabilir. Deneyimli bir operatör için, her ameliyat, sadece birkaç saniye sürer. Kurtarma hızlı ve balık davranışları üzerinde herhangi bir kısa ya da uzun vadeli etkileri şu ana kadar tespit ettik. Zebra balığı, bir maksiller Bärbel yüzerek cerrahi sonrası 6 aya kadar, yemek ve cerrahi olmayan kontroller olarak etkin bir şekilde doğurmak ve doku toplama süresi ile karşılaştırılabilir bir yaşam süresine sahiptir. Bu ameliyatı fizyolojik etkileri, 1) Bärbel yürütülen ekstraoral tat tomurcukları da balık epitel dudaklar, yanaklar ve yüksekliği 5 de dahil olmak üzere diğer birçok parça bulunur, çünkü çok az olacağı tahmin, ve 2) ayırt tat tomurcuklarının görünür 72 saat içinde yenileyici Bärbel (Leclair ve ark. yayınlanmamış veriler). maksiller Bärbel yara iyileşmesi, revaskülarizasyon ve reinnervation bir yetişkin omurgalı kapsamında eğitim için minimal invaziv bir sistem yapar.
Rejenerasyon cerrahi indüksiyonundan sonra, sabit doku morfometrik ölçüm ve / veya mikroskopik analiz için barbels aralıklarla toplanmalıdır. Elverişli, maksiller Bärbel cryosectioning, tüm montaj immünhistokimya ve in situ, parafin histoloji dahil olmak üzere birçok standart protokoller, uygulanmasını kolaylaştırmak için, yaklaşık uzunluğu (2-3 mm) ve bir zebrafish embriyonun çapı (100-200 mm ). melezleşme. Birlikte ele alındığında, bu özellikleri maksiller Bärbel in vivo model, doku onarımı ve yenilenmesi eğitim için son derece gerçekçi olun .
Acknowledgments
Bu yöntemler, JT, laboratuar Destek DePaul Üniversitesi Araştırma Konseyi ve JT (DE016678) NIH / NIDCR R01 hibe tarafından sağlanan bir araştırma izni sırasında EEL tarafından geliştirilmiştir. Biz minnetle Caroline Hunter, CMRC zebrafish çekirdek tesiste hayvan bakım teknisyeni lisans laboratuvar asistanı ve Paulina Pawluczuk çabaları kabul etmiş sayılırsınız.
Materials
|Name||Company||Catalog Number||Comments|
|A stereo dissecting microscope with transmitted and incident fiber-optic illumination is required for barbel clipping and agar embedding|
|Fish system water|
|2 zebrafish crossing tanks|
|MS-222 (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate; Sigma Chemical #E10521-10G)|
|sterile 120-mm Petri plate|
|wet paper towels|
|blunt metal spatula|
|Dumont #55 Bio Inox Forceps (Fine Science Tools #11255-20)|
|Mini-Vannas spring scissors (Fine Science Tools #15000-00)|
|methylene blue antifungal agent (Drs. Foster & Smith #CD-905781)|
|small aquarium fishnet|
|4% paraformaldehyde in 1x phosphate-buffered saline (PF-PBS), aliquoted into 50 mL conical tubes and stored frozen at -20°C until use|
|1x phosphate-buffered saline (pH 7.27-6)|
|250 mL glass flask|
|2% agarose in distilled water|
|standard small agarose gel electrophoresis rig (gel size = ~10 cm square)|
|small-toothed electrophoresis sample comb (comb size 4 x 1.5 mm)|
|warm water bath (50-60°C)|
|laboratory tape|
|black enameled insect pins, size 000 (Fine Science Tools #26000-25)|
|1-2 pin holders (Fine Science tools #26016-12)|
|9-inch glass Pasteur pipette|
|pipette bulb or pump|
|laboratory tissue|
|small paper labels|
|(optional) printed calibration scale|
|wet paper towels|
|zip-closure plastic bag|
|scalpel/razor blade (to cut out agar blocks)|
References
- Westerfield, M. Chapter 1 General Methods for Zebrafish Care. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th ed., Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Howe, J. C. Standard length: Not quite so standard. Fisheries Research (Amsterdam). 56, 1-7 (2002).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin Embedding Tissue Samples for Sectioning. Cold Spring Harbor Protocols. 6, (2008).
- Westerfield, M. Ch 8.3 Agar Embedding for Cryostat Sectioning of Embryos or Larvae. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th ed., Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Hansen, A., Reutter, K., Zeiske, E. Taste bud development in the zebrafish, Danio rerio. Dev Dyn. 223, 483-496 (2002).