Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Lipit damlacıklarını görselleştirirken, nötr lipitler için hücre içi depolama organelleri, örneğe Triton X-100 içeren bir deterjan çözeltisi ekleyerek başlar. Bu, solucanın hücrelerinin dengesini sağlayacaktır.
Daha sonra, boya ışığa duyarlı olduğu için numuneye Nil Kırmızısı ekleyin ve ışıktan koruyun. Fiksasyon, boyanın hayvan boyunca lipit damlacıklarına erişmesini sağlar. Nil Kırmızısı, floresan emisyon spektrumu lokal lipit ortamının polaritesine bağlı olan lipofilik bir boyadır.
Fosfolipidler gibi polar lipitlere maruz kaldığında, Nil Kırmızısı'nın emisyon spektrumu daha yüksek, kırmızı dalga boylarındadır. Lipid damlacıklarının nötr çekirdeğinde triacylglycerols ve sterol esterleri gibi nötr lipitlere maruz kaldığında, Nil Kırmızısı'nın emisyon spektrumu alt, sarı-altın dalga boylarına kayar.
Bu nedenle, hayvan genelinde lipit damlacıklarının Nil Kırmızısı lekelenmesini görselleştirmek için sarı-altın dalga boyu emisyonlarını toplayacak bir floresan mikroskobun yeşil kanalını kullanın.. Örnek protokolde, sabit örneklerde Nil Kırmızısı boyama prosedürü ve lipit damlacıklarının görüntülenmesini göreceğiz.
- Nil Kırmızısı lipid boyama, nematod büyüme ortamında plaka solucanları veya ngm, geç kütük OP50 E. coli ile tohumlanmış ve solucanları 20 santigrat derecede erken L4 aşamasına yetiştirmek için. Solucanları 1 mililitre PBST çözeltisi ile yıkayın ve solucan süspansiyonunu 1,5 mililitre mikrofuge tüpüne aktarın.
Solucanları bir dakika boyunca 560 kat yerçekiminde santrifüjleyin, sonra süpernatantı çıkarın ve E. coli süspansiyondan temizlenene kadar PBST yıkamayı tekrarlayın. Sonra, solucan peletine, % 40 izopropanol 100 mikrolitre veya ORO boyama için% 60 ekleyin ve numuneyi oda sıcaklığında üç dakika boyunca kuluçkaya bırakın.
- İzopropanol ilavesi, lekelenmeden önce solucanların uygun permeabilizasyonu için çok önemlidir.
- Solucanları bir dakika boyunca 560 kat yerçekiminde santrifüj edin ve solucan peletini bozmadan süpernatantı çıkarın.
- Santrifüjleme adımları sırasında ışığa maruz kalmayı en aza indirmek önemlidir.
- Şimdi, karanlıktayken, her numuneye daha önce hazırlanmış 600 mikrolitre NR çalışma çözeltisi ekleyin. Tüpleri üç kez ters çevirin ve solucanları ve çözeltiyi tamamen karıştırın. Ardından numuneyi oda sıcaklığında iki saat boyunca karanlıkta kuluçkaya yatırın.
Kuluçkadan sonra, solucanları santrifüjleyin ve süpernatantı çıkarın. Daha sonra 600 mikrolitre PBST ekleyin ve fazla NR lekesini çıkarmak için örnekleri 30 dakika boyunca karanlıkta kuluçkaya bırakın. Örnekleri daha önce olduğu gibi tekrar döndürdükten sonra, yaklaşık 50 mikrolitre süpernatant hariç hepsini çıkarın.