Spesifiklikleri nedeniyle antikorlar, flow sitometri, ELISA, western blot, immünohistokimya ve lateral flow gibi sayısız uygulamada antijenleri saptamak ve ölçmek için yaygın olarak kullanılır. Antijene bağlanan antikor, primer antikor olarak bilinir.
Doğrudan ve dolaylı deteksiyon
Ölçülebilirliği sağlamak için, çoğu immünoassayin, ayrıca doğrudan veya dolaylı olarak bir etiket de içermesi gerekir. Etiketler; enzim, florokrom veya biyotin içerebilir (Tablo 1).
|İmmünoassay Tekniği
|Etiket
|ELISA
|Enzimler (yaban turpu peroksidazı (HRP) ya da alkalin fosfataz (AP), Biyotin
|Flow Sitometri
|Fikoeritrin (PE), Allofikosiyanin (APC), tandem boyalar ve Alexa Fluor®
|İmmünohistokimya ve
İmmünofloresan
|Florofor
|İmmünohistokimya
|Enzimler (HRP ya da AP), Biyotin
|Western Blot
|Enzimler (HRP ya da AP), floresan boyalar
Deneyler, etiket eğer bir kovalent bağ aracılığıyla primer antikora konjuge edilirse, doğrudan olarak sınıflandırılır. Primer antikor konjuge edilmezse ve etiket bir sekonder antikor gibi başka bir moleküle bağlanırsa, o zaman deney, dolaylı olarak sınıflandırılır. Dolaylı deteksiyon, sekonder reaktif tarafından sağlanan sinyal amplifikasyonu nedeniyle yetersiz bir şekilde açığa çıkarılmış antijenleri incelemek için daha uygundur. Bununla birlikte, sekonder bir antikor kullanımı, ek bloklama aşamaları ve kontroller gerektirecektir.
Doğrudan deteksiyon, sekonder bir reaktiften gelen herhangi bir sinyal amplifikasyonu olmadığı için, yüksek oranda açığa çıkarılmış antijenleri saptamak için daha uygundur. Bununla birlikte, sekonder bir reaktif ile ek bir inkübasyon aşaması gerektirmez ve çok sayıda fluorokrom bulunduğu için, doğrudan deteksiyon, çok renkli deneyleri tasarlarken artırılmış esneklik sağlar.
NHS ester yöntemi
NHS ester yönteminde, bir N-Hidroksisüksinimid (NHS) reaktif grubuyla birlikte floresan boyalar kullanır. Antikorla reaksiyona girdikten sonra artan reaktif boya, gravity kolon kromatografisi gibi çeşitli ayırma işlemleriyle çıkarılır. Bu ayırma aşamaları genellikle konjugat kayıplarıyla sonuçlanırken, ilgili veri görüntülerinde yüksek arka planları önlemek için gerekli bir aşamadır.
Bu konjugasyon yaklaşımı nispeten basit olmasına rağmen, genellikle savurgandır çünkü doğru bir şekilde tartılabilen en küçük boya miktarı, antikoru etiketlemek için gereken asıl miktarı çoğu zaman büyük ölçüde aşar. NHS esterleri de çok dayanıksızdır ve neme karşı hassastır, çözündükten hemen sonra kullanılmaları gerekir.
İki etiketli (Two-tag) yöntem (Hetero bifonksiyonel yöntem)
İki etiketli yöntem, genellikle HRP gibi protein molekülü olan etiketleri konjuge etmek için kullanılır. Bunun sebebi, hem antikorun (Ab) hem de etiketin (L), çoklu lizin gruplarına sahip olması ve Ab-Ab veya L-L homodimerleri ya da yüksek molekül ağırlıklı agregatlar oluşturma riskinin olmasıdır.
Bu nedenle, bir uzatma kolunun her iki ucunda, iki farklı reaktif grubu olan reaktiflerin, yani hetero bifonksiyonel reaktiflerin uygulanması, işlem süresince bir dereceye kadar kontrol sağlar. İki etiketli konjugasyon yönteminde, bu hetero bifonksiyonel reaktifler, bir uçta bir NHS ester grubuna ve diğer uçta birkaç olası fonksiyonel gruptan (örn. ‘X’ veya ‘Y’) birine sahip olan doğrusal moleküllerdir.
X ve Y grupları, “etiketler”, “bağlayıcılar” veya “aktivatörler” olarak adlandırılmaktadır ve birbirleriyle temasa geçtiklerinde bir X-Y bağlantısı oluşturmak üzere reaksiyona girerler. Bu nedenle, iki etiketli konjugasyon yönteminde, antikor üzerindeki bazı lizinler, X etiketini (yukarıda açıklanan NHS ester yöntemine benzer şekilde) uygulamak için X-NHS ester ile reaksiyona girer, ardından HRP gibi diğer molekül üzerindeki lizinler, Y grubunu uygulamak için Y-ester ile reaksiyona girer.
Antikor ve etiket daha sonra, artan hetero bifonksiyonel reaktifi çıkarmak için boyut seperasyonuyla arıtılır. Bu noktada, protein molekülleri üzerindeki X ve Y etiketleri, heterodimerik konjugatlar oluşturmak üzere reaksiyona girerler.
İki etiketli yöntem
Bu yöntem, konjuge antikorlar oluşturmak için kontrollü bir reaksiyon sağlarken, konjugasyon öncesi seperasyon aşamaları, işe yarayan antikor reaktifinin kaybına, ortaya çıkarılan antikor miktarı üzerinde belirsizliğe, gruptan gruba değişime ve ölçeklenebilirliğin eksikliğine yol açar.
Konjugasyon kitleri
Geleneksel konjugasyon yöntemleri, belli bir derecede uzmanlık ve laboratuvarda uygulamalı zaman geçirmeyi gerektirir. Bununla birlikte, konjugasyon kitlerinin geliştirilmesi, deney tasarımı sırasında esnekliğe olanak sağlarken süreci basitleştirmiştir.
Konjugasyon kitine bir örnek, Lightning-Link® konjugasyon kitidir. Bu basit, kullanımı kolay kitlerle, etiketlenecek antikor, ilgili etiketi içeren bir liyofilize karışım şişesine eklenir. Konjuge antikor, kullanılan kite göre 20 dakikada veya 3,5 saatte kullanıma hazır hale gelir. Konjugasyon sonrası saflaştırma aşamaları olmayan bu işlem, antikor kaybı riskini ortadan kaldırır.
Bu yöntemin avantajları arasında, 10 ug kadar az antikor kullanan bazı kitlerle tekrarlanabilirlik ve ölçeklenebilirlik ve sadece üç aşamada, nötr bir pH’ta antikor etiketli konjugatlar oluşturma yeteneği yer alır. Bu işlemin basitliği uygulamalı laboratuvar süresini azaltır. Geniş yelpazeli etiketler ve kit boyutları, esneklik ve ölçeklenebilirlik sağlar.
Özet
Tüm konjugasyon yöntemleri, araştırmanız için faydalı olabilse de NHS ester yöntemi ve iki etiketli yöntem gibi geleneksel antikor konjugasyonu teknikleri, belli bir derecede beceri ve bilgi gerektirir. Bununla birlikte, üç pipetleme aşamalı kitlerin geliştirilmesi, deney tasarımı sırasında esneklik sağlayarak süreci basitleştirmiştir.
Ancak, seçtiğiniz konjugasyon tekniği ne olursa olsun, başarılı bir konjugasyon için göz önünde bulundurmanız gereken kilit unsurlar vardır:
-
- Saflaştırma: Yalnızca saflaştırılmış antikorlar konjugasyon için uygundur (yani ham serum veya doku kültürü süpernatantı gibi numuneler uygun değildir)
-
- Tampon: Bazı tampon bileşenleri, etiketleme reaksiyonu ile uyumsuzdur (detaylar için konjugasyon kiti prospektüsüne bakınız)
-
- Konsantrasyon: Antikor, en az 1mg/mL konsantrasyonda olmalıdır.
Aşağıdaki tablo, hangi tekniğin deneyinizi tamamlamanızı sağlayacağına karar vermeniz konusunda size yardımcı olmak için, bu kılavuzda açıklanan üç yöntemi özetlemektedir.
KAYNAK: Bilgiler buradan alınmıştır.