DNA’nın Keşfi
Hücre çekirdeğinde bulunan bileşenlerin tiplerini açığa çıkarmak için yapılan ilk girişimler moleküler biyolojide bir devrim yapmıştır. 1868 de Isviçreli bilimadamı Freedrich Miescher proteinleri parçalamak için pepsin ile bir hücreyi muamele ettiğinde çekirdeğin küçüldüğünü (büzüldüğünü); ama esas itibari ile bozulmadan kaldığını gösterdi. Miescher peptit parçalanmaya karşı dayanıklı olan bu çekirdek materyalinin başka pek çok ajanlarla muamele […]
Hücre çekirdeğinde bulunan bileşenlerin tiplerini açığa çıkarmak için yapılan ilk girişimler moleküler biyolojide bir devrim yapmıştır. 1868 de Isviçreli bilimadamı Freedrich Miescher proteinleri parçalamak için pepsin ile bir hücreyi muamele ettiğinde çekirdeğin küçüldüğünü (büzüldüğünü); ama esas itibari ile bozulmadan kaldığını gösterdi. Miescher peptit parçalanmaya karşı dayanıklı olan bu çekirdek materyalinin başka pek çok ajanlarla muamele edildiğinde proteinden tamamen farklı davrandığını ve bir proteinde bulunması beklenen karbon, oksijen, hidrojen ve azotun yanı sıra fosfor elementini de içerdiğini gösterdi. Bütün bunlar çekirdeğin çok fazla miktarda protein ve bazı tanımlanamayan proteinden farklı bileşikler içerdiği sonucunu verdi. Miescher’in nüklein diye adlandırdığı proteinden farklı yapılar o zamandan beri nükleik asit olarak adlandırılmıştır. On yıl sonra Feulgen kendi nükleini parlak kırmızıya boyayan yöntemini tüm hücreye uyguladığında çekirdek DNA’sının kromozomlarda sınırlı olduğunu gördü. Feulgen’in yöntemi hâlâ kullanılmaktadır. Araştırmacılar belirli bir organizmanın bütün somatik hücrelerinin (gamet oluşturan germ hücrelerinin dışındaki tüm hücreler hatta diğer bileşenlerinin miktarının oldukça farklı olduğu karaciğer, böbrek, sinir ve kas gibi farklı dokulara ait hücrelerin) aynı miktarda DNA içerdiğini ve dahası, yumurta ve sperm hücrelerinin somatik hücrelerdekinin sadece yarısı kadar DNA içerdiğini kesin olarak göstermişlerdir. Moleküler biyologlar, hücrelerin asıl rolüne bakmaksızın hücre bölünmesi ile genlerin tam bir setinin her bir somatik hücreye dağıldığı, gamet oluşturan sperm ve yumurta hücrelerinin ise somatik hücrelerdekinin tam yarısı kadar genetik materyal içerdiği sonucuna varmışlardı. Bu durum DNA miktarının tüm somatik hücrelerde sabit olduğunun bulunması; fakat gametlerde yarısı kadar olması, genlerin esas materyalinin proteinler değil DNA olduğu fikrini vermekteydi. Fakat pek çok araştırmacı bu fikri ciddiye almadı. Çoğu organizmaların kromozomları hem protein hem de DNA içerdiğinden ve pek çok biyolog proteinin genetik materyal olduğunu; çünkü sadece proteinin bu kadar bilgiyi verebilecek kimyasal karmaşıklığa sahip olduğunu savunmaktaydı.
DNA Proteine Karşı
1928 Fred Griffith, İngiliz tıbbi bakteriyoloğu, zatürreye (pnomoni) neden olan bir bakteri türü olan pnömokoklar üzerine yaptığı ve şimdi klasik kabul edilen deneylerini anlatan bir yazı yayınladı. Griffith bir virulan (hastalığa neden olan) pnömokok suşu (S, “düzgün koloniler oluşturabilen”) ile bir nonvirulan (hastalık oluşturamayan) pnömokok suşunun (R, “pürüzlü koloniler oluşturabilen”) fareler üzerindeki etkisini çalıştı. Canlı R-bakteri suşu enjekte edilen farelerin yaşadığını, canlı S-bakteri suşu enjekte edilen farelerin hemen öldüğünü; ama ısıyla öldürülmüş S-bakteri suşu enjekte edilen farelerin ise yaşadığını gösterdi. Griffith’in bu sonuçları çok kolay anlaşılmaktadır; fakat diğer bir deneyin sonucu ise tamamen şaşırtıcıydı. Hem canlı R bakteri suşu ve hemde ısıyla öldürülmüş S bakteri suşu içeren karışım enjekte edilen fareler de öldüler. Nasıl oluyordu da nonvirulan ve ölü virulan bakteri karışımı fareyi öldürebiliyordu? Griffith ölü farenin vücudunu incelediğinde canlı S bakteri suşu ile dolu olduğunu gördü. Bunlar nereden gelmişti? Pek çok dikkatli deneyden sonra her nasılsa canlı R bakteri suşunun ölü S bakteri suşundan gelen bir materyal tarafından canlı S bakteri suşuna dönüştüğü sonucuna vardı. Transforme bakteri, kültür edildiğinde yeni S bakteri suşları üretmektedir. Büyük bir olasılıkla ölü bakteriden kalıtsal materyal canlı R suşu hücrelerine girmekte ve onları S suşu hücrelerine dönüştürmektedir.
1931 de diğer araştırmacılar bakteriyal transformasyon için aracı bir memeli canlı konakçıya gerek olmadığını gösterdiler; aynı şey test tüpü kültüründe de olmaktadır. İki yıl sonra, Rockefeller Enstitüsünden, (şimdi Rockefeller Üniversitesi), James L. Alloway transformasyon için S suşu hücrelerinin bütün halinde olmasının bile gerekmediğini, bir test tüpünde S bakterilerinin hücre içi kalıntılarının da yaşayan R bakterilerini S suşlarına transforme ettiğini göstermiştir. Görülüyor ki virulan suşun kalıtımsal karakteri, kendisinin orijinal hücresinin öldürülmesi (parçalanması) sırasında sağlam kalabilen bir madde tarafından nonvirulan hücreye aktarılmaktadır.
1920’lerin sonunda ve 1930’ların başında Griffith, Alloway ve diğerlerinin yaptığı çalışmalar diğer biyologlar için çok ilginçti; ama önemleri o dönemlerde tam anlaşılamadı. Ta ki 1944 te Rockofeller Enstitüsünden O.T. Avery, Colin MacLeod ve Maclyn Mc Carty’nin saflaştırma teknikleri yardımıyla transforme edici ajanın DNA olduğunu başka hiçbir şeyin gerekli olmadığını göstermesine kadar.
Bizim şimdiki bakış açımıza göre, bu sonuçlar, asıl genetik materyalin protein ya da bir nükleo protein kompleksinden ziyade DNA olduğunu gösteren kuvvetli kanıtlardır; ancak o dönemlerde pek çok bilim adamı ikna olmamıştır. Anlayan herkes için virulan suştan gelen DNA nonvirulan suştaki proteinbağımlı genleri aktive etmektedir.
Sonraki 10 yıl boyunca DNA ile ilgili bilgiler sürekli olarak arttı ve Griffith’in kanısını ve bulgularını destekleyecek yönde kuvvet kazandı. Saflaştırılmış DNA ile en az 30 farklı bakteriyel transformasyon gerçekleştirildi ve çok daha kuvvetli bir delil (bilgi) Carnegie Genetik Laboratuvarından Alfred D. Hershey ve Martha Chase tarafından gerçekleştirilen ve insan sindirim sisteminde bol olarak bulunan Escherichia coli’ye saldıran özel bir virüs tipi ile yapılan çalışmalardan geldi. Bu şekilde bakteri parçalayan virüsa bakteriyofaj, kısaca “faj” denir.
Virüsler protein bir kılıf ve nükleik asitten oluşan ve konakçı organizmanın hücresel mekanizmalarını kendi genlerini çoğaltmak için kullanan küçük parazitlerdir. Elektron mikroskopu belirli faj virüslerinin pek çok diğer tiplerden yapısal olarak daha karmaşık olduğunu ortaya çıkarmıştır.
Protein kılıfları iki bölüme ayrılır; bir baş bölümü (genetik materyali içerir) ve bir kınla kaplı ve 6 tane fiberi (kılları) olan içi boş uzun bir kuyruk bölümü. Elektron mikroskop görüntüleri böyle bir fajın bir bakteriye saldırdığı zaman kuyruk fiberleri ile tutunduğunu ve taban plağının bakteri hücre duvarına bağlandığını göstermektedir. Faja ait taban plağı ve fiber uçlar bakteriye ait hücre duvarındaki özgül bileşenlerle bağlanan özel proteinler içermektedir. Fajın protein kı lıfı hiçbir zaman bakteri hücresine gir mez. Fakat faj, hücre duvarına tutunduktan sonra bir saat içinde bakterinin içinde yeni fajlar belirir. Uygun bir zamanda, faj, sindirici bir enzim olan lizozimi ve diğer enzimleri kodlayan genlerini aktive eder, bunların aktiviteleri sonucunda bakteri hücresi çözünmüş olur ya da parçalanır ve düzinelerce hatta yüzlerce yeni faj etrafa yayılır.
Bakterinin parçalanması ile yayılan yeni fajlar genetik olarak bakteri enfeksiyonunu başlatan fajla tamamen aynıdır. Bu sonuç şu varsayımın yapılabilmesine olanak tanır; kalıtsal materyal bakteri duvarına tutunan faj tarafından bakteriye enjekte edilmiş olmalı ve bu kalıtsal materyal bakterinin metabolik makinesini gasp ederek ve konakçının kendi protein sentezini kapatan pek çok enzimler ve karmaşık protein kılıf yapısı için gerekli pek çok proteinler ile birlikte yeni faj genlerini imal edecek şekilde çalıştırmış olmalı ve belirli bir zamanda da hücreyi parçalamış olmalıdır.
Hershey ve Chase enfekte eden fajın bakteriye sadece DNA’sınımı, yoksa sadece proteinini mi ya da her ikisinden de bir miktar mı enjekte ettiğini anlamak için bir deney düzenlediler. Bu iki araştırıcı DNA molekülünün fosfor içerip, kükürt içermediği; fakat buna karşılık proteinin kükürt içerip ; fosfor içermediği prensibinden yararlanarak fosfor ve kükürdün radyoaktif izotoplarını kullanıp DNA’yı proteinden ayırmayı başardılar. Radyoaktif fosfor (32P) ve radyoaktif kükürt (35S) içeren bir ortamda büyüyen bakteri ortamında fajı ürettiler. Faj 35S’i proteinlerine, 32P’u ise DNA’sına kattı (Şekil 8.6 B). Hershey ve Chase daha sonra radyoaktif fajla nonradyoaktif bakteriyi enfekte ettiler. Fajın bakteri hücre duvarına bağlanması ve kalıtsal materyalini enjekte edebilmesi için belirli bir süre beklediler. Sonra bakteriyi bir karıştırıcıda hızlı bir şekilde çalkaladılar ve bakteri duvarında kalan fajları uzaklaştırmak ve enfekte olmuş bakteriyi faj kılıfların dan ayırmak için karışımı santrifüj ettiler. Analiz sonuçları santrifüj edildikten sonra tüpün dibine çöken bakterilerin üzerinde kalan sıvı kısmın (süpernatan) önemli miktarda 35S; fakat önemsiz ölçüde çok az miktarda 32P içermekte olduğunu gösterdi. Bu sonuç bakteri hücresinin dışı nda sadece boş protein kılıfının kaldığını göstermektedir. Bakteri fraksiyonları analiz edildiğinde daha çok 32P ve daha az 35S içerdiğinin saptanması faj tarafından sadece DNA nın bakteriye enjekte edildiğini göstermektedir.
Bakteri içinde yeni fajlar sentezlendiğine göre, DNA tek başına faj üretimi için gerekli bilgiyi bakteriye aktarmaya yetmektedir. Bu deney 1952 de rapor edildi ve proteinlerin değil nükleik asitlerin genetik materyali oluşturduğuna dair daha önce yapılan transformasyon deneyleri ile elde edilen sonuçları kuvvetle destekledi.