Lökotrienlerin Tespiti – Biyokimya ve Moleküler Biyolojide Laboratuvar Teknikleri – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri
Seyrek olarak kullanılmasına rağmen, HETE’lerin iyi kromatografik ayrımları normal faz kromatografisi kullanılarak elde edilebilir. % 100 heksan-asetik asitten% 100 kloro-form-asetik aside doğrusal bir mobil faz gradyanı ile bir pPorasil silika jel kolonunda ayrılmanın lZHETE, 11-HETE, 9-HETE ve SHETE’yi çözdüğü bildirilmiştir, maalesef 15 -HETE, 12-HETE ve 8-HETE ile 9-HETE ile kaynaştırıldı.
İkinci bir kromatografik ayırma, araşidonik asit mevcudiyetinde insan nötrofilleri tarafından üretilen 5- HETE, g-HETE, 9-HETE, 11-HETE ve 1ZHETE’nin rezolüsyonunu tarif eder; ayırmada,% 100 heksan-asetik asitten kloroform-metanol-asetik aside doğrusal bir mobil faz gradyanına sahip normal bir faz kolonu kullanılmıştır.
Prostaglandinlerden monoHETE’lerin iyi çözünürlüğü, daha önce açıklanan gümüş iyonu yüklü katyon değişim kolonlarında elde edilebilir. Bu kolonların mobil bir metanol-asetik asit fazı ile kullanılması, 5-HETE, 11-HETE, 12-HETE ve 15-HETE tamamen çözülmüş, ancak 8-HETE ve 9-HETE tamamen ayrılmamıştır.
Lökotrienlerin HPLC ile Ayrılması
Lökotrienler için açıklanan ayırmaların büyük çoğunluğu, bir ODS durağan fazı olan izokratik ters faz koşullarını kullanmıştır, ancak gradyan koşulları ile iyon çifti ters faz kromatografisini kullanan tek bir rapor mevcuttur.
Bu ayrılmaların örnekleri, lökotrienlerin HPLC’si ile ilişkili bazı problemlerle birlikte tartışılmayacaktır. Lökotrienlerin ayrılması için en popüler mobil fazların tümü metanol içerir; örneğin, bir ODS kolonu ile kombinasyon halinde metanol-su-asetik asit-amonyum hidroksitin hareketli bir fazı, verilen elüsyon sırasına göre lökotrien B ,, Cı, ll-trans-C ve D4’ün ayrıştırılması için kullanıldı.
Bu koşullar altında, ana lökotrienler, genellikle in vitro test sistemlerinde birlikte sentezlenen diHETE’lerden iyi çözüldü. Mobil faza asetik asit ve amonyum hidroksit ilavesinin, ayrışan tepe noktalarının keskinliğini maksimize ettiği ve k ‘ve a değerlerinin yeniden üretilebilirliğini artırdığı bildirilmiştir.
Amonyum ve asetat iyonlarının kromatografiyi iyileştirme mekanizmalarının, lökotrienler C ve D üzerindeki serbest karboksil ve amino fonksiyonlarının iyon eşleşmesi yoluyla olduğu varsayılmıştır.
Lökotrienler Ne ise yarar
Lökotrien B4 nedir
Lökotrien inhibitörleri
Lökotrien görevleri
Lökotrien sentezi
Lökotrien etkileri
Lökotrien Ne ise yarar
Lökotrien reseptör antagonisti ilaçlar
Aynı yazarlar, kolonun% 3 disodyum EDTA ile gece boyunca yıkanmasının, durağan fazdan lökotrien C’nin geri kazanımını arttırdığını ve bu iyileşmenin, enjektör koruma kolonundan ve öncesinde sabit fazdan günlük EDTA enjeksiyonu ile sürdürülebileceğini bildirmişlerdir.
EDTA etkisinin açıklamasının, durağan fazda tutulan ve aksi takdirde lökotrienler üzerindeki negatif yüklü kısımlarla etkileşime girecek olan katyonların çıkarılması yoluyla olduğu ve bunun kromoforlarının tahrip olmasına veya bir iyon-eşleşmemiş kolon üzerindeki lökotrien moleküllerinin oranına bakılır.
Lökotrienlerin kromatografisinde bir bozulma olduğu yerde benzer kolon şartlandırma teknikleri önerilmiştir. Bu yazarlar, kolonun su-metanol içinde% 0.5 disodyum EDTA çözeltisi ile yıkanmasını savunmuş ve bazı durumlarda dimetilformamid ile ikinci bir yıkama önermiştir.
Herhangi bir kromatografik prosedür uygulanmadan önce sistemi HPLC dereceli damıtılmış suyla yıkayarak EDTA veya dimetilformamidin uzaklaştırılmasının gerekli olduğu vurgulanmalıdır.
Lökotrienlerin diHETE’lerden yeterli bir şekilde ayrılmasını sağlamaya ek olarak, metanol bazlı mobil faz sistemlerinin kullanımının da monoHETE’lerden lökotrien C ve D4’ün iyi çözünürlüğünü sağladığı gözlemlenmiştir.
Bu yazarlar, amonyum hidroksit ilavesiyle pH 5.3’e ayarlanmış bir mobil faz veya metanol-su-asetik asit kullandılar. Kullanılan sabit faz, bir ODS kolonuydu.
Aynı kromatogramda hem prostaglandinlerin hem de lökotrienlerin ayrılması gerektiğinde ve saptama sistemlerinin UV olduğu durumlarda, 192 nm’de metanolün nispi opaklığına bağlı olarak mobil fazda asetonitril kullanılması yararlıdır; prostaglandinler için maksimum absorpsiyon vb.
Makrofajlar tarafından sentezlenen majör prostaglandinlerin, monoHETE’lerin ve lökotrienlerin çözünürlüğü için böyle bir sistem bildirilmiştir. Sabit faz bir ODS kolonuydu ve mobil fazlar% 0.1 (h / h) sulu asetik asit, pH 3.7 (solvent A) ve asetonitril (solvent B) idi.
Bir gradyan sistemi kullanılarak, ana prostaglandinler% 36 asetonitrilde ve lökotrienler% 50 asetonitrilde ayrıştırıldı, elüsyon sırası lökotrien C ,, E ,, B ve D idi.
MonoHETE’ler,% 56’lık bir asetonitril konsantrasyonunda yıkandı ve araşidonik asit, gradyanın sonunda ayrıştırıldı. Lökotrienler Cı, D4 ve E, için tekrarlanabilir tutma sürelerini korumak için hareketli faz pH’sının katı bir kontrolünün gerekli olduğu kaydedildi. Lökotrienlerin bir iyon çifti ayrımının, lökotrien B-6-gövde-lökotrien B-6-gövde-lökotrien B ,, lökotrien C ve D4’ün çözülmesini kolaylaştırdığı bildirilmiştir.
İlk mobil faz, karşı iyon olarak 2.5 mM 1-pentansülfonik asit (nihai pH 3.9) ile% 70 metanol -% 30 su -% 0.1 asetik asit (h / h) idi. Nihai mobil faz,% 100 metanol -% 0.1 asetik asit (h / h) ve 2.5 mM 1-pentansülfonik asit, pH 3.9 idi.
Sabit faz, bir ODS kolonuydu. Karşı iyon ilavesinin, kromatografik çözünürlük için optimal pH olan pH 5.7’de lökotrien C ve lökotrien D4’ün uzun tutma sürelerini azalttığı bildirildi.
Lökotrien A’nın kromatografisi, nötr veya asidik pH’ta neredeyse anında parçalanan alilik bir 5,6-epoksit içerdiğinden bazı problemler ortaya çıkarır.
Bu kimyasal kararsızlığın üstesinden gelmek için, bir oktil veya ODS kolonu ile kombinasyon halinde asetonitril-0.01 M borat tamponunun mobil fazını, pH 10 (30:70) kullanan alkalin kromatografik koşullar gereklidir.
Silika bazlı kolonlar alkali pH’ta bir şekilde kararsız olduğundan, kromatografik performansı korumak için nispeten sık kolon değişimi ile birlikte dikkatli kolon bakımı gereklidir. Alkalin pH’ta stabil olan PRP-1 kolonlarının kullanılması, bu kolon bozulması sorunlarına çözüm sağlayabilir.
Lökotrienlerin Tespiti
Lökotrienler, lökotriene bağlı olarak 270 nm ile 280 nm arasında maksimum aborbanlık sağlayan güçlü bir kromofor olan bir konjuge trien grubu dahil olmak üzere dört çift bağa sahiptir.
Bu nedenle, lökotrien A, 279 nm’de maksimum soğurma, 280 nm’de lökotrien C ve 270 nm’de lökotrien D’ye sahiptir. 280 nm filtreli sabit dalga boyu detektörleri nispeten yaygın olduğundan, lökotrienler genellikle bu dalga boyunda izlenir.
Hücresel sistemlerin veya enzimatik akışların araştırıldığı tespit için alternatif bir strateji, ön imleç molekülleri olarak işlev görebilen ve sentezlenmiş radyo etiketli lökotrienlerin tespitini kolaylaştıran radyoaktif olarak etiketlenmiş araşidonik asit veya glutatyonun kullanılmasıdır.
Etiketli moleküller ya doğrudan bir radyoaktif akış monitörü ile ya da dolaylı olarak fraksiyon toplama ve sintilasyon sayımı ile tespit edilebilir.