Ackles 1978'de Dallas'ta doğdu. Donna Joan ve Alan Ackles çiftinin ortanca çocuğudur. Joshua adlı bir ağabeyi ve Mackenzie adlı bir kız kardeşi bulunmaktadır. Babası Alan da kendisi gibi aktördür. 4 yaşından başlayarak tüm gençliği boyunca modellik yaptı. 1997 yılında Llyod V. Berkener High School'dan mezun oldu. O yıllarda spor hekimliği bölümünü okumak istese de oyuncu olmaktan yana karar kıldı ve Los Angeles'a taşındı.