Mark Ruffalo, 22 Kasım 1967’de Kenosha, Wisconsin’da doğdu. Annesi Marie Rose Hebert bir stilist ve kuaför, babası Frank Lawrence Ruffalo ise bir inşaat boyacısıydı. Babasının kökeni İtalyan, annesininki ise Fransız-Kanadalı’dır. Mark gençlik yıllarının çoğunu ailesiyle beraber Virginia Beach, Virginia’da geçirdi. Liseden sonra Mark, ailesiyle beraber San Diego’ya taşındı ve kısa süre sonra kuzeye göç ettiler. Sonuç olarak Los Angeles’de karar kıldılar. Stella Adler Konservatuvarında dersler alırken aynı zamanda Orpheus Tiyatro topluluğunun kurucularındandı. Bu topluluk bir Equity Waiver girişimiydi ve Mark burada her alanda çalıştı. Oyunculuk, yazarlık, yönetmenlik, yapımcılık ve ışıkçılık yapıp dekor yapımında çalışarak özgeçmişini geliştirdi. Dokuz yıl boyunca geçimini sağlamak için barmenlik yaptı. Tam ümidi kesip her şeyin bittiğini düşünürken senryo ve oyun yazarı Kenneth Lonergan ile tanışma ve beraber çalışma fırsatının doğması her şeyi değiştirdi.
Ruffalo, Lonergan’ın “This is Our Youth” adlı oyunuyla New York’da ünlendi ve bunu yine Lonergan’ın You Can Count on Me (2000) adlı filminde erkek başrol oyunculuğu takip etti. Bu filmdeki performansı muhteşem eleştiriler aldı ve Mark, Marlon Brando’nun gençliğiyle kıyaslanmaya başlandı. The Last Castle (2001), XX/XY (2002) ve Windtalkers (2002) gibi filmlerde önemli roller aldı. Ruffalo’ya 2002’de bir çeşit beyin tümörü olan akustik nöroma teşhisi kondu. Tümör iyi huyluydu fakat alınması için yapılan ameliyat sonucunda Ruffalo’nun yüzünde felç oluştu. Fakat Ruffalo hiçbir iz kalmaksızın tamamen iyileşti. 2003’te Ruffalo In the Cut (2003) filminde Meg Ryan’ın karşısında bir polis dedektifini ve View from the Top (2003) filminde de Gwyneth Paltrow’un karşısında sevgilisi olmak isteyen adamı canlandırdı. Bu iki popüler kadınla rol aldığı iki film de maalesef gişede başarı gösteremedi. Ruffalo 2004’te dört önemli filmde oynadı: We Don’t Live Here Anymore (2004), Eternal Sunshine of the Spotless Mind (2004), 13 Going on 30 (2004) ve Collateral (2004). Bu filmler Ruffalo’nun hem popüler bir baş rol oyuncusu hem de alkışlanan bir topluluk oyuncusu olduğunu ve hem dram filmlerinde hem de komedi filmlerinde başarı gösterebileceğini kanıtladı.
2004’ten sonra Ruffalo sürekli çalışmaya devam etti ve hem popüler Hollywood filmlerinde hem de bağımsız filmlerde oynayarak bir filmde oynayabilecek en güçlü oyunculardan biri olduğunu kanıtlayarak sinemadaki yerini sağlamlaştırdı. Bu filmlerden bazıları: Just Like Heaven (2005), All the King’s Men (2006), Zodiac (2007), Reservation Road (2007), and The Brothers Bloom (2008). 2010’da Ruffalo yeni bir alanda büyük bir çıkış yakaladı. Yönettiği Sympathy for Delicious (2010) adlı bağımsız film Sundance Film Festivalinde Jüri Özel Ödülünü kazandı. Annette Bening ve Julianne Moore ile beraber oynadığı The Kidd are All Right (2010) filminde lezbiyen bir çifte sperm bağışlayarak çocuklarının babası olan bir adamı canlandırdı. Bu kendine has domestik komedi/dram filmi ona en iyi yardımcı oyuncu dalında Akademi Ödülü, Independent Spirit Award, Screen Actors Guild ve BAFTA adaylıkları getirdi.
Martin Scorsese’nin Shutter Island’ı (2010) ve Kenneth Longeran’ın Margeret’ından (2011) sonra Ruffalo, Joss Whedon’un gişe rekortmeni Yenilmezler 1 (2012) filminde ‘Hulk’ olarak bilinen Dr. Bruce Banner’ı canlandırdı. Eric Bana ve Edward Norton’un aynı karakterin önceki yapımlarında istenen başarıyı elde edememelerine rağmen Ruffalo hem bir gişe yıldızı oldu hem de oldukça muhteşem eleştiriler aldı. Bu rolü devam filmi olan The Avangers: Age of Ultron’da (2015) tekrar canlandırdı. Gywneth Paltrow ile tekrar bir araya gelerek bir seks bağımlılığı komedi – dram filmi olan Thanks for Sharing’de (2012) oynadı. Sonrasında da Ryan Murphy’nin, Larry Kramer’in uyarlaması olan AIDS dram oyunu The Normal Heart’da (2014) başrol oynadı. Ruffalo 200 yılından beri oyuncu Sunrise Coigney ile evli. Çiftin bir oğulları ve iki kızları var.