Summary
Bu video plazma bağı olmayan nöron mikroakışkan cihazın nasıl kullanılacağını göstermektedir.
Abstract
Bu video, plazma bağı olmayan nöron mikroakışkan cihazın nasıl kullanılacağını göstermektedir. Bazı durumlarda Corning No 1 kapak cam geri dönüşümlü bond cihazlar istenebilir. Bu plazma temizleyici kullanılabilir değil, belki de bağlı olabilir. Diğer durumlarda, bu nöronlar cihaz lekeli olabilir çünkü immün aygıtı kaldırmak için gerekli olmasa da, mikroskopi veya immün için belirli türleri için kültür nöronların sonra cam aygıtı kaldırmak için arzu olabilir. Bazı araştırmacılar, ancak hala aygıtı kaldırmak için tercih ediyor. Bu durumda, cihazın kapağı cam reversibl bağlanma mümkün kılar. Olmayan, bir mühür gibi sıkı değil oluşur cihazların plazma bağı bazı dezavantajları vardır. Bazı durumlarda aksonlar ziyade onların aracılığıyla oluk altında büyür. Ayrıca, cam ve PDMS hidrofobik olduğu için, sıvıların kolaylıkla medya ve diğer reaktiflerin cihazın içine zorlamak için zaman zaman gerekli cihaz girmek yok. Sıvılar cihaz kapiller eylem yoluyla girecek ama önemli ölçüde daha uzun plazma gümrüklü cihazlara kıyasla sürüyor. Plazma temizleyici, cam ve cihaz sonra cihaz üzerinden saniyeler içinde yapıştırma sıvıların akışını kolaylaştırmak geçici hidrofilik ücretleri oluşturur. Cihazları ile sıvı akış non-plazma bağlı cihazlar için, birkaç dakika sürer. Cihazları plazma temizleyici sterilize edecektir, çünkü plazma tedavi cihazlar kullanımdan önce sterilize edilecek gerekmez iken, önce sterilize edilecek bağ olmayan plazma ile kullanılmak üzere olduğunu da not etmek önemlidir.
Protocol
Nöron Hücre Kültürü için mikroakışkan Cihazlar hazırlanması
1) Temiz Corning No.1 24 mm X 40 mm cam slaytlar
- 30 dakika boyunca bir su banyosu sonikatör cam slaytlar sonikasyon
- Cam slaytlar,% 70 EtOH ile durulayın
- Yıkama dH 2 O ile üç kez slaytlar
- Tercihen bir gecede, birkaç saat için bir doku kültürü davlumbaz, Kuru slaytlar
Not: Biz özel metal tepsiler slaytlar yük var. Slaytları tek tek ayrılmış ve bu metal raf yuvalarına yerleştirilir. Daha sonra bir cam tabak, su, su banyosu sonikatör yer ile doldurun bu metal yükleme tepsisi yerleştirin ve 30 dakika sonikasyon. Sonraki yıkar bu yemeğin yürütülmektedir.
2) PDMS cihazları hazırlanması
- PDSM döküm ve çeyrek bu silikon gofret PDMS kalıp kesip, delgeç
- PDMS cihazlar onları genelinde ilk ve inert gaz (argon veya Azot) üfleyerek temizleyin. Daha sonra kalan tüm enkaz kaldırmak için 3M Scotch Marka 471 bandı kullanın
Not: cihazların yüzü yukarı tutmak için önemlidir. Başlangıçta, silikon gofret uzak PDMS kesildiğinde, gofret ile temas tarafında temiz tarafında: mikroakışkan kanallarını içerir. Biz biz de cihaza zarar verebilir ve plazma yapıştırılması için hazır olana kadar temiz yüzleri yetişmek için olabildiğince dikkatli olmaya çalışıyorum.
- Plastik kaplar Otoklav cihazlar
- Otoklav, temiz, No: 1 Corning cam slaytlar ve harrick marka plazma temizleyici, plazma tedavi cihazları sonra www.harrickplasma.com
- Cihazları cam slayt tarafı aşağı temiz bir yerde.
Cihaz şimdi cam slayt gümrüklü plazma.
3) Kaplama Poli L-Lizin (PLL) ile Cihazlar
- PLL cihazın her iki tarafında iyi eklenir ve bir sonraki kuyuya akmasına izin verilir
=> 150 ul büyük küçük kuyuları için kuyu ve 30 μ l PLL PLL. Bu sürece kuyuları tam olarak tam olarak bulunmamış.
Not: Bir aygıt bakarsanız 4 kuyu göreceksiniz: her iki bağlanır. Siz de bu yüzden sonraki kuyuya cihaz üzerinden akacak bir PLL koymak istiyorum.
- PLL yaklaşık 10 dakika boyunca cihaz üzerinden akış ve daha sonra bunları doldurmak için kuyu daha PLL eklemek için izin ver
- (Gece tercih edilir) 37 ° C'de en az 4 saat için bir kuluçka PLL içeren cihazlar yerleştirin
- Tedavi sonrası aşırı PLL Vakum, ancak cihazın tüm sıvı emmek için dikkatli olun
Not: kanalları ya da odasına hava kabarcıkları tanıtmak istemiyorum. Sadece kuyularda aşırı PLL vakum.
- Cihazın her iki tarafında her bir kuyu için otoklava dH 2 O ve kılcal eylem diğer iyi akmasına izin
Şekil 1 mikroakışkan bir cihazın bir diyagram. Mavi (Soma tarafı) nasıl bağlandığına dikkat edin ve Kızıl (Aksonal tarafı) bağlanır. Cihazın her iki tarafında iyi bir PLL, ya su ya da medya, demekle, ne demek istediğimizi, örneğin: Yeri otoklava dH biri Blue Peki o yerde 150 ul otoklava dH 2 O 150 ul Peki bir Kırmızı içine 2 0. Su (ya da PLL, Medya, veya Hücreler) cihaz üzerinden diğer ilgili iyi akacaktır.
Şekil 1
Not: Lütfen artık, diyorum "TOP kuyularda medya, hücreleri, su veya PLL", Soma, soldaki nerede olurdu Yukarıdaki diyagram ve Aksonlar kastediyorum, not büyüyecek hakkını saklı tutar.
- Su (daha dikkatli olmak tam olarak tüm sıvı cihazdan çıkarmak için değil) aspire, sonra otoklava dH 2 O başka bir 150 ul de bağlı her birine ekleyin ve iyi karşılık akmasına izin verin .
- 37 ° dH 2 O içeren bir kuluçka cihaz yerleştirin ° C 1 saat sonra tekrar yıkama adımı tekrarlayın. DH 2 O cihazları, üç kez yıkayın toplam bir saat, her biri .
Not: PLL borat Jeon Lab i bir çift sonra otoklava dH 2 O gecede cihazlar kuluçka tavsiye PDMS emebilir olasılığı nedeniylenitial hızlı durular. Bu, tüm serbest borat önce hücre yükleme PDMS liç olacağını garanti eder. Bu yapılmadığı takdirde, medya içine borat bir açıklaması, sitotoksisiteye neden olabilir zaman içinde olabilir.
- Üst kuyuları için gerekli faktörleri (glutamax, B27, PenStrep) Sinir Bazal Ortam (NBM)
Not: cihazlar inkübe, gece boyunca ve ertesi gün hücreleri ile kaplı veya hücreleri kaplama önce NMB + faktörler ile en az 3 saat inkübe edilebilir.
Nöronlar Into Aygıtlar yüklenmesi için hazırlanması
Biz 18 gün ya Beyin Bit kampüs ya da bizim için burada hazırlanan adında bir şirket satın eski fetal sıçan korteks kullanın. Biz taze doku almak için tercih ederler.
- Hazırda Bekleme E saklanan 1 fetal beynin korteks (2 adet doku) edinmek
- Alkol lamba kullanarak 3 uzun cam pipetler alın ve gittikçe daha küçük boyutlarda her yangın
- NMB + Faktörler 2 ml 15 ml steril bir tüp içinde bir cam pipet ve yer Hazırda Bekleme E dokuların çıkarın.
- Öğütme: korteks yaklaşık 5 ile 10 kat aşağı yukarı geçti ve bir ampul ve cam pipet kullanarak . Ardından, sonraki küçük pipet doku aşağı yukarı pipet ve kullanılır. Son olarak, küçük pipet doku aşağı yukarı pipet ve kullanılır. Biz hiçbir görünür parçaları olmadığından emin olmak istiyorum.
Not: Son zamanlarda, Jeon Lab, başlangıçta% 50,% 0.125 tripsin ile tedavi Doku hazırlanan hücreler Hazırda Bekleme E saklanan doku hücreleri karşılaştırarak başladı Ca + + ve Mg + + ücretsiz diseksiyonu tampon. Konsensus tripsin verim doku hemen kullanmak için DEĞİLDİR Hazırda Bekleme E. başlangıçta yerleştirilen doku daha canlı hücreler kullanarak hazırlanan doku, daha sonra Hazırda Bekleme E. doku saklamak gerekir
Eğer hemen doku kullanmak için gidiyoruz vardır ve artan canlılığı istiyorsanız Eğer aşağıdaki gibi, daha sonra mekanik öğütme önce tripsin ile doku tedavisi: 1) 1 ml Ca + + ücretsiz Mg + + ücretsiz 1 ml% 0.25 tripsin (Gibco, Invitrogen) sulandırmak diseksiyonu tampon içine 15 ml tüp (buz tutmaya) (son tripsin =% 0.125), 2) yer tampon doku ve 8 dakika 37 ° C az hemen inkübe 3) durdurmak için 10 ml% DMEM/10 FBS eklemek tripsin reaksiyon ve aşağıda protokol devam.
- 1 dakika için 1100 rpm'de Santrifüj hücreleri
- Kapalı hücre pelletini dikkatle aspire medya
- NMB + faktörler kadar pipetleme pelet ve yeniden askıya 1 ml ve aşağı
- (BD Falcon hücre süzgecinden 40 um naylon) herhangi bir kümeleri kaldırmak için bir filtre üzerinden yerçekimi akışı ile yeniden askıya hücreleri Pass
- Sayımı ve plaka hücreleri:
- Bir mikrofuge'de tüpe, 60 ul NMB + faktörler, hücre süspansiyonu ul, 20 ve 20 ul tripan mavi karışımı
- Bu çözüm yaklaşık 10 ul bir hemasitometre ekleyin ve canlı hücrelerin sayısı (mavi)
- Konsantrasyonu 2.5 ayarlama - 4,5 x10 6 hücre / ml
Not: Biz genellikle yaklaşık 2,5 'lik bir konsantrasyon elde - 4.5 x 106 hücre / ml. hacmine bağlı olarak hücrelerin (normalde 1 ml NBM + B27/Glutamax/PenStrep percortex) yeniden süspanse. Doku tripsin ile hazırlanmış ise, verim muhtemelen artacaktır.
Cihazlar Kaplama
- Birine cihazın Yük hücreleri (primer nöronlar)
- Plaka küçük bir cihaz başına 5 ul ve büyük cihaz başına 20 ul
Not: cihazın üst ve alt cihazın (yarım toplam hacmi) 10 ul 10 ul hücre yükü, ya da üst warfarin iyi hücrelerin doğrudan 20 ul (5 ul de üst warfarin Küçük cihazlar için).
- 10 dakika 37 ° C inkübatör inkübe hücreleri eklemek başlayabilirsiniz
- NMB + faktörlerin iyi cihaz boyutuna bağlı olarak her biri için yaklaşık 150 / 30 ul
Not: Hacimler PDMS kalınlığına bağlı olarak değişebilir. Tüm bu konularda kuyu tam olmasıdır.
Plazma Yapıştırma olmadan Cihazlar Açık Ek
Plazma tedavisi olmadan, plazma olmaksızın her hafta başarıyla Christina Tu, bir teknisyen, sadece hücreler hemen yüklemek için söylüyor.
Soma tarafında iki kuyu (medya bırakırsanız akson tarafı önemli değil) medya kaldırmak unutmayın. Bu hücrelerin ana kanal girmek için izin sıvı akış. Kuyuların medya varsa, sıvı akışını almazsınız.
Discussion
Burada plazma temizleyici gerek kalmadan nöron mikroakışkan cihaz nasıl kullanılacağını gösterdi. Biz bu gibi non-plazma bağı bakın.
Materials
|Name||Type||Company||Catalog Number||Comments|
|PDMS||Reagent||Dow Corning||Sylgard 184 with curing agent Please consult Dow Corning to find a vendor near you|
|Cornig No. 1 Cover Glass||Cover Glass||Corning||Corning No. X2935 244||Available through Fisher Scientific, Fish Catalog number 12-531D|
|B27||Reagent||Invitrogen||17504-044||B27 is a proprietary supplement available through Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.|
|Glutamax||Reagent||Invitrogen||35050-061||Glutamax is available through Invitrogen under their Gibco line of celll culture reagents.|
|60 mm Petri Dish||Tool||Fisher Scientific||08-757-13A||60 mm polystyrene sterile petri dishes are used to house the device bound to glass.|
|Poly-L-Lysine||Reagent||Sigma-Aldrich||P-1274|
|BD Falcon 50 ml Tube||Tool||BD Biosciences||Falcon No. 352098||Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-49A|
|BD Falcon 15 ml tube||Tool||BD Biosciences||Falcon No. 352097||Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-70C|
References
- Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 1, (4), 2128-2136 (2006).
- Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2, (8), 599-605 (2005).