Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Zebra Balığı Kornea Yara İyileşmesi: Aşınmadan Yara Kapatma Görüntüleme Analizine
Chapters
Summary
Automatic Translation
March 1st, 2022
Please note that all translations are automatically generated.
Bu protokol, hücresel düzeyde sonraki yara kapanmasını değerlendirmek için zebra balıklarının oküler yüzeyine aşınma yoluyla zarar vermeye odaklanır. Bu yaklaşım, kornea epitelini kısmen çıkarmak için bir oküler çapaktan yararlanır ve yara kapanması sırasında hücre morfolojisindeki değişiklikleri izlemek için taramalı elektron mikroskobu kullanır.
Transcript
Kornea şeffaflığı net görme için etkilidir. Patolojik bağlamda, bu şeffaflık zor olabilir. Patogenez mekanizmasının incelenmesi, insan organına yüksek benzerliğe sahip basit modeller gerektirir.
Bu açılardan, zebra balığı mükemmel bir modeldir. Ve bu, zebra balıklarında kornea aşınmasının ilk ayrıntılı açıklamasıdır. Bu teknik, göze yüzey girişini indüklemenin basit ve hızlı bir yoludur.
Aşınma sonrası yara kapanması rahatlıkla takip edilebilir. Ayrıca, yara kapanması üzerindeki etkilerini incelemek için tank suyuna kimyasallar veya belirli faktörler eklenebilir. Yara manuel olarak oluşturulduğundan, yöntem tutarlı sonuçlar elde etmek için bazı uygulamalar gerektirir.
Deneyden önce,% 0.02'lik bir trikain çözeltisi hazırlayın. 2 mL% 0.4 stok çözeltisini çözün. 40 mL sistem suyuna ekleyin.
Ve çözeltiyi küçük bir kaba koyun. Çapak ucunun temiz olup olmadığını kontrol ederek oftalmik çapağı hazır bulundurun. Gerekirse, hücre kalıntılarını nemli bir pamuklu çubukla temizleyin.
Yumuşak bir süngerin yanına bir kesi yapın. Ve süngeri sistem suyuyla nemlendirin. Süngeri diseksiyon mikroskobunun sahnesine yerleştirin.
Çapağı kullanmak için yeterli çalışma alanı sağlayın. Ve göz yüzeyini doğru bir şekilde görmek için yandan ve yukarıdan yeterli aydınlatma. Anestezi uygulanan balığı, bir kaşıkla sünger yüzeyinden çıkıntı yapan kafa ile sünger üzerindeki kesiye yavaşça yerleştirin.
Göz yüzeyine çapak ucu ile dikkatlice yaklaşın. Ve ucu göz yüzeyinde dairesel bir hareketle hareket ettirmeye başlayın. Aşınma tamamlandığında, balıkları iyileşme için analjezik içeren tatlı sistem suyuna dikkatlice yerleştirin.
Çapağı kullanımdan hemen sonra nemli bir pamuklu çubukla temizleyin. Balıkları istediğiniz zaman noktasında toplayın ve% 0.02 trikain çözeltisine yerleştirin. Operküler hareket tamamen durana ve balık dokunmaya tepki vermeyene kadar hayvanı çözelti içinde tutun.
Balıkları bir kaşıkla Petri kabına yerleştirin ve cımbızla tutun. Balıkları disseksiyon makası ile kafasını kesin. Göz yüzeyinde çizikler çiziklerden kaçının.
Dokuyu 0.1 M sodyum fosfat içeren bir numune tüpüne koyun. Ve çözeltide kan kalmaması için temiz bir tamponla durulayın. Dokuyu 4 C'de 24 saat boyunca 0.1 M sodyum fosfatta% 2.5 glutaraldehit içinde sabitleyin.Sabitleme çözeltisini çıkarın ve numuneyi 0.1 M sodyum fosfat ile birkaç kez durulayın.
Numuneyi, diseksiyon plakası üzerinde 0.1 M sodyum fosfat damlasına yerleştirerek diseke edin. Kafa örneğini ince diseksiyon makası ile ikiye bölün. Alternatif olarak, ince cımbızların uçlarını gözün yanından göz yuvalarına dikkatlice yerleştirerek gözleri toplayın.
Ardından, gözü soketten çıkarın ve ekstra dokuyu çıkarın. Disseke edilen numuneyi 0,1 M sodyum fosfat içeren bir tüpe aktarın. Numune işleme sırasında gözün üst kısmına yapışabileceğinden, numune tüpünde ekstra doku olmadığından emin olun.
Montajı, tırnağı bir tutucu üzerine yerleştirin. Ve tutucu diseksiyon yapan bir mikroskobun tabanına. Doku örneğini ince cımbızla, kornea yukarı bakacak şekilde yavaşça montaja yerleştirin.
Uygun cihazı kullanarak numuneyi platin ile kaplayın. Ve örnekleri görüntülemeye kadar oda sıcaklığında saklayın. İstediğiniz büyütmenin görüntülerini elde edin.
Ve analiz için 2000 ila 2500x görüntü kullanın. Tüm hücre kenarlıklarını ve mikro sırtları net bir şekilde görmek için parlaklığı ve kontrastı ayarlayın. Ve görüntüdeki aşırı pozlanmış alanlardan kaçının.
TIFF görüntüsünü Fiji ImageJ 1.53 ile açın. Ölçeği ayarlamak için bir ölçek çubuğu kullanın. Çizgi aracıyla ölçek çubuğuna eşit bir çizgi oluşturun.
Analiz Et'i seçin. Ardından, ölçeği ayarlayın. Ve bilinen mesafeyi yazın.
Ardından, Analiz, Araçlar menüsünü kullanarak YG yöneticisini açın. Hücre boyutu ve yuvarlaklık için Analiz Et, Ölçümleri Ayarla, Şekil tanımlayıcıları'nı seçin. Ve büyütme altındaki hücreleri görmek için Büyüteç aracını kullanın.
Poligon aracıyla hücreleri seçin ve her seçimi YG yöneticisine ekleyin. Son olarak, seçilen hücreleri ölçün ve ölçümü kaydedin. Microridge analizine devam etmek için, Görüntü, Tür menüsüne tıklayarak görüntünün 8 bit biçiminde olduğundan emin olun.
Ardından, Poligon aracıyla hücreyi seçin. Ve Düzenle'ye ve ardından Dışarıyı Temizle'ye tıklayarak arka planı temizleyin. İşleme, Düzgün'ü seçerek görüntüyü bir ila üç kez düzgünleştirin.
Ve parlaklığı ve kontrastı Görüntü, Ayarla, Parlaklık / Kontrast'tan ayarlayın, böylece mikro sırtlar mümkün olduğunca net bir şekilde öne çıkar. İşlem, Filtreler, Convolve'ye tıklayarak görüntüyü birleştirin. Ve İşlem, İkili, İkili Yap'ı tıklatarak ikili hale getirin.
Ardından, İşlem, İkili, İskelettonize seçeneğini belirleyerek siyah beyaz görüntüyü iskeletleştirin. Microridge parametrelerini ölçmek ve değerleri kaydetmek için Analiz Edilmiş İskelet işlevini kullanın. Yara bölgesi yaradan üç saat sonra kapatılır.
Ancak yara sınırlarının birleştirildiği yer görünür kalır. Sonuçlar, aşınmış kornea epitelinde yara bölgesinin yanındaki bazı uzun hücrelerde mikrosırtların gözlenebileceğini göstermiştir. Bazı periferik bölgelerde, mikrosırtlar hücrenin merkezinden kaybolur.
Periferik bölgelerin ikisi arasındaki bir karşılaştırma, daha kısa ortalama mikrosırtlara sahip uzun hücreler gösterdi ve bu da yaralanmaya tepki olarak hücre yeniden düzenlemelerini gösterdi. Bu sonuçlar, hücre şekli değişikliklerinin mikroridge modifikasyonu ile ilişkili olduğunu ve yara yanıtında kornea epiteli içindeki heterojenliği vurguladığını göstermektedir. Operasyonun homojen ve tekrarlanabilir bir yara gerçekleştirmek için eğitim gerektirdiğini unutmayın.
Elektron mikroskobuna ek olarak, doku histoloji, immünolojik boyamalar ve in situ hibridizasyon için kullanılabilir. Bunlar, yara iyileşmesi sırasında hücre ve moleküler değişiklikler hakkında daha fazla bilgi sağlayacaktır. Zebra balığı kullanmak, kornea biyolojisi hakkındaki bilgilerimizi genişletir.
Dahası, bu model farmakolojik çalışmalar için mükemmeldir ve göz evrimi hakkında daha fazla bilgi edinmek için kullanılabilir.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact email@example.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact firstname.lastname@example.org.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact email@example.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to firstname.lastname@example.org. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.