Overview
Bu video kalsiyum görüntülemenin arkasındaki kavramları tanıtır ve kalıplanmış agarose kuyularında bulunan solucanların zaman atlamalı görüntülenmesi için örnek bir protokol içerir.
Protocol
Bu protokol, Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp'in Uzun Süreli Kalsiyum Görüntülemesi için Agarose Microchambersolan Turek ve ark.'dan bir alıntıdır. (2015).
1. Kalsiyum Görüntüleme
- HBR16 (goeIs5[pnmr-1::SL1-GCaMP3.35-SL2::unc-54-3'UTR, unc-119(+)]gibi genetik olarak kodlanmış kalsiyum sensörlerini ifade eden transgenik suşlar kullanın.
- Geniş alan epifluoresansı için donatılmış bir bileşik mikroskop kullanın. EMCCD kameranın TTL çıkışını LED'in TTL girişine bağlayın, böylece kamera bir çerçeveyi her kaydettiğinde örnek aydınlatılacaktır. Yaklaşık 5 milislik bir pozlama süresi kullanın. EM kazancını 50 - 300 aralığında kullanın.
- Her solucanın DIC ile 20 saniye boyunca her 15 - 30 dakikada bir görüntülenecek şekilde 24 saat çalışan bir seri film belirtin, ardından GCaMP'yi kaydetmek için bir GFP floresanıyla 20 saniye boyunca ve ardından ifade düzeylerini denetlemek için mKate2 sinyalinin son görüntüsünü alın. Her patlama sırasında 2/sn kare hızı kullanın.
- Görsel veri incelemesi için floresan yoğunluğundaki küçük değişikliklerin görünürlüğünü artırmak için yanlış renk haritası kullanın. Floresan verileri ΔF/F olarak çizin ve F floresanların ortalama temel değeridir. Literatürde kalsiyum veri analizinin ayrıntılı bir açıklamasına rastlanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
|Name||Company||Catalog Number||Comments|
|LED system||CoolLED||pE-2|
|Compound microscope||Nikon||TiE|
|EMCCD camera||Andor||iXon 897||now sold as iXon Ultra 897|
|Z-stage for the microscope||Prior||Nano Scan Z|
|X-Y stage for the microscope||Prior||Proscan III|
|Red light filter||Chroma||ET660/50m|
|35 mm Petri dish||Falcon||Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning|