Amerika’ya yerleşen ikinci kolonidir. 1587′de North Carolina açıklarındaki Roanoke Adası’na yerleşmişler ve 1590 yılında arkalarında hiçbir iz bırakmadan ortadan kaybolmuşlardır. Bu ortadan yokoluş hakkında çeşitli teoriler üretilmiş olsa da, bu kolonidekilere ne olduğu hakkında kesin bir bilgi yoktur.
1585 yılında, Sir Walter Raleigh tarafından gönderilen 100 kişi, Roaneke Adası’nda ilk İngiliz kolonisini kurmuşlardır. Raleigh bu adanın İspanyollarla savaşacak olan İngiliz savaş gemileri için mükemmel bir liman olduğunu düşünmüştü. Gemilerin onarımı burada yapılabilir, eksik cephane ve gıdaları tamamlanan gemiler savaşa tekrar dönebilirlerdi. Ama plan basarîli olamadı. Topraklar hem kolonileri, hem de civardaki Kızılderililerin ihtiyaçlarını karşılayacak kadar bereketli değildi, üstelik adanın etrafındaki suların sığlığı, gemilerin adaya yeterince yaklaşmasına engeldi. Böylelikle ertesi yıl kolonidekiler İngiltere’ye geri dönmeye karar verdiler. Bu sırada Raleigh İngiltere’den bir grup kolonisi daha göndermişti. Yeni grup, ilk yerleşen kolonistlerin ayrılmasından birkaç gün sonra adaya ulaştıklarında, 15 kişi hariç herkesin İngiltere’ye geri dönmüş olduğunu öğrendiler.
1587 yılının ilkbaharında Raleigh yeni kıtaya bir grup kolonist daha gönderdi. Fakat gemiler daha kuzeydeki (şimdiki Virginia) Chesapeake körfezi yakınlarına doğru hareket ettiler. Gemiler temmuz ayında Outer Banks’e ulaştılar ama donanma komutanı, kolonidekilerin Roanoke adası yerine, bu yeni limana yerleşme isteklerini kabul etmedi ve kolonistleri Roanoke Adası’na bıraktı. Koloni lideri John White ki kendisi adaya ilk yerleşen İngiliz kolonisindendi, 1587′nin ağustos ayında, İngiltere malzeme tedariki için geri döndü. Fakat İngiltere ve İspanya arasında devam etmekte olan savaş, adaya geri dönmesini üç yıl kadar ertelemesine neden oldu. Ağustos 1590′da Roanoke Adası’na geri dönen John White ailesi ve yüz kadar kolonist tarafından karşılanmayı beklerken, koloninin terk edilmiş olduğunu gördü.
John White’in rastladığı tek ipucu bir ağacın üzerine kazılmış olan Croatoan kelimesi idi. Croatoan ya da Hatteralar, adanın güneyinde yaşayan ve kolonistlere dostane davranan kizilderililerdi. John White kolonositlerin Hatteralar’a katılıp katılmadıklarını öğrenmek için araştırmalara başladı ancak hava koşulları yüzünden araştırmasını tamamlayamadan İngiltere’ye geri dönmek zorunda kaldı.
Koloniye yerleşenlerin kaybolması ile ilgili iki teori üretildi. İlki, daha en basında Chesapeake Körfezi’ne gitmek isteyen kolonistlerin, buraya hareket ettikleri ve Kızılderili direnişi ile karsılaşıp öldükleri. Diğer teori ise kuzey Carolina’daki diğer kızılderili kabilelerine entegre oldukları. Kolonistlere ne olduğu bilinmiyor, haklarında tek söylenebilecek şey bir daha Avrupalılar tarafından görülmedikleri.