Neolitik dönemden yüzlerce yıl sonra 1530 yılında adaya gelen St.John'un emrindeki şövalyeler beraberlerinde bambaşka, zengin bir kültür getirdiler. St. John şövalyelerinin tarihi, 11. yüzyılın ortalarında başlar. Şövalyelerin gerçek görevi, savunma yapmak, Hıristiyan hacılara kutsal topraklara kadar refakat etmek ve zor durumda olan insanlara yardımda bulunmaktı. Fakat daha sonraları amaçları değişti. Hıristiyan olmayanlara saldırmak en büyük görevleri haline geldi. Şövalyeler Hıristiyanlık dininin askerleri durumuna geldiler. Kutsal topraklardaki bütün kaleleri, büyük arazileri, her şeyi ele geçirdiler ve bir donanma kurdular.
1291'de Müslümanların gelişiyle, şövalyelerin kaderi değişti.Rodos'u geri alarak Türklere karşı iki yüzyıl mücadele ettiler ama 1522'de Kanuni Sultan Süleyman Rodos'u ele geçirerek, şövalyeleri adanın dışına sürdü. Yeni bir vatana ihtiyaç duyan şövalyeler 1530'da Kutsal Roma İmparatoru V. Karl'ın verdiği imtiyazlarla Malta'ya yerleştiler. Gelir gelmez ticareti ve sosyal ilişkileri geliştirmeye başladılar, yeni hastaneler yaptılar, en önemlisi de adada güçlü bir kalkınma hareketi başlattılar. Fakat Kanuni Sultan Süleyman, Avrupa'nın geçiş yolları üzerinde bulunan Malta'yı da imparatorluk sınırlarına katmak istiyordu. 1565'te güçlü bir donanma ile Malta'ya geldi ve kuşatma başlattı. Kuşatma 4 ay kadar sürdü. Sonunda Sicilya'dan gelen yardımla şövalyeler galip geldiler. Şövalyeler bu savunmayla Güney Avrupa'nın ve Hıristiyanlık aleminin güvenini kazandılar. Osmanlılara karşı kazanılan bu zaferden sonra, Malta ve Gozo'yu büyük bir şevkle geliştirmeye başladılar. Adalar, bu dönemde mimarlık, sanat ve kültür açısından altın devrini yaşadı. Malta'daki pek çok görkemli yapı bu dönemin eserlerindendir.Valletta şehri, ismini şövalyelerin büyük ustası Jean Parisot De La Vallette'den almıştır. Valletta en erken dönem raylı sistemin kullanıldığı şehirlerden biridir.