Overview
Bu videoda, Nil Kırmızısı boyası kullanarak lipitleri bütün, sabit solucanlarda lekeleme protokolü açıklanmaktadır. Lipid damlacıklarının çekirdeğindeki nötr lipitleri özellikle görüntülemek için, lekeli C. elegans'ın yeşil emisyon spektrumunu görüntüleyin.
Protocol
Bu protokol, Escorcia ve ark.
1. Lipitlerin Nil Kırmızısı (NR) Boyanmesi
- 5 mg/mL NR stok çözeltisinin hazırlanması
- 500 mL'lik bir şişede, %100 asetonun 200 mL'sine 100 mg NR tozu ekleyin.
- Işığa maruz kalmamak için şişeyi alüminyum folyo ile örtün.
- Kullanmadan önce, çözeltiyi karanlıkta 2 saat karıştırın.
- Uzun süreli kullanım için, NR stok çözeltisini herhangi bir ışığa maruz kalmadan sıkıca kapatılmış bir şişede saklayın. NR stok çözümünü araştırma ihtiyaçlarına göre ölçeklendirin. Tutarlı boyama ve görüntüleme sonuçları elde etmek için aynı stok çözümünün NR boyama deneylerinde kullanıldığından emin olun.
- NR çalışma çözümünün hazırlanması
- %40 izopropanol (v/v) her 1 mL için 6 μL NR stok çözeltisi ekleyin.
- Her numune için 600 μL NR çalışma çözümü hazırlayın.
NOT: Boyamadan hemen önce taze NR çalışma çözümü yapın. NR stok çözümü ihtiyaçlarına bağlı olarak, 15 mL veya 50 mL mezunu konik tüp kullanın.
- NR lipid boyama için solucanların hazırlanması
- Solucanları geç kütük OP50 E. coliile tohumlanmış nematod büyüme ortamında (NGM) 20 °C'de erken L4 aşamasına yetiştirin.
- Solucanları plakadan 1 mL 1x fosfat tamponlu salin + % 0.01 Triton X-100 (PBST) çözeltisi ile yıkayın ve solucan süspansiyonunu 1.5 mL mikrofuge tüpüne koyun.
- Solucanları 1 dakika boyunca 560 x g'da santrifüj edin. Süpernatantı çıkarın ve E. coli süspansiyondan temizlenene kadar bu adımı tekrarlayın.
- Solucan peletine 100 μL% 40 izopropanol ekleyin ve oda sıcaklığında 3 dakika kuluçkaya yatırın.
- Solucanları 560 x g'da 1 dakika santrifüj edin ve solucan peletini bozmadan süpernatantı çıkarın.
NOT: Daha büyük plakalar kullanıyorsanız veya plaka başına daha fazla solucanı lekeliyorsanız solucanları plakalardan yıkamak için daha yüksek hacimlerde PBST kullanın. Solucanları, örnek sabitlemeden 15 dakikadan fazla pbst'de yıkamayın. Süpernatant bakterilerden temizlenmezse ek yıkamalar gerçekleştirin. Kuluçkayı bir besleyici veya rocker kullanarak% 40 izopropanolde gerçekleştirin. Tam numune ajitasyonunun meydana olduğundan emin olmak için her zaman tüpleri izleyin.
- NR ile lipid boyama
- Karanlıkta, her numuneye 600 μL NR çalışma çözümü ekleyin. Tüpleri üç kez ters çevirin ve solucanları NR çözeltisinde tamamen karıştırın.
- Numuneyi oda sıcaklığında 2 saat boyunca karanlıkta döndürün.
- Kuluçkadan sonra, solucanları 1 dakika boyunca 560 x g'da santrifüj edin ve süpernatantı çıkarın.
- 600 μL PBST ekleyin ve fazla NR lekesini çıkarmak için numuneleri 30 dakika boyunca karanlıkta kuluçkaya yatırın.
- Numuneleri 560 x g'da 1 dakika santrifüj edin ve yaklaşık 50 μL süpernatant hariç hepsini çıkarın.
NOT: NR inkübasyonu ajitasyon gerektirmez. Solucanların yerleştirilmesi bu adım sırasında yaygındır.
- Mikroskop görüntüleme için slaytların hazırlanması
- Solucan peletini kalan süpernatanta yeniden sür.
- Bir mikroskop kaydırağı üzerine 5 μL solucan süspansiyonu yerleştirin ve herhangi bir hava kabarcığı yakalamamak için dikkatlice bir kapakçık takın.
- Solucanları görüntülemeden önce kapak kapağını oje ile kapatın.
- Aynı anda yalnızca birkaç slayt hazırlayın. Bu, NR görüntülemenin numuneler arasında sabit kalmasını sağlayacaktır. NR lekeli görüntülerin kalitesi 6 saat sonra azalır. Ayrık lipid damlacıklarının gözlemlanması zordur ve arka plan floresan artar, bu da NR sinyal algılamasını müdahale eder.
- NR lekeli solucanların görüntülenmesi
- Görüş alanı başına birkaç hayvanı yakalamak için solucanları 5X büyütmede görüntüleyin.
- Tek tek solucanların daha iyi ölçülmesi için 10X büyütmeye geçin.
- NR lekeli solucanları görüntülemek ve nicelik için en uygun koşulları belirlemek için farklı pozlama süreleri denemek için FITC/GFP kanalını kullanın.
- Sıkıştırma nedeniyle veri kaybetmemek için dosyaları TIF biçiminde kaydedin.
NOT: Tipik maruz kalma süreleri 100-1000 ms arasında değişmektedir. En uygun pozlama süresine sahip olarak, görüntüleme tutarlılığını korumak için tüm örnekler için kullanın.
Materials
|Name||Company||Catalog Number||Comments|
|Imager.M2m Microscope||Zeiss||n/a||Fluorescence microscope|
|ERC5s camera||Axiocam||n/a||Color-capable|
|MRm camera||Axiocam||n/a||Fluorescence-capable|
|Nile red||Thermo Fisher||N1142||Lipid Stain|
|Isopropyl Alcohol||BDH||BDH1133-1LP||Fixative solution|
|Centrifuge 5430||Eppendorf||5428000015||Centrifuge|
|Tube Rotator||VWR||10136-084||Rotator|