We are searching data for your request:
Upon completion, a link will appear to access the found materials.
Laboratuvar Amaçları
Laboratuvarın sonunda, öğrenci şunları yapabilmelidir:
- Laboratuarda bir bileşik ışık mikroskobuna karşı bir stereomikroskopun (diseksiyon mikroskobu) ne zaman kullanılacağını belirleyin
- Işık mikroskopları ile elektron mikroskopları arasındaki temel farkları tanımlar
- Mikroskobu taşımanın doğru yolunu tarif edin
- Bileşik ışık mikroskobunun parçalarını tanımlar
- bileşik ışık mikroskobunda slayt görüntüleme adımlarını açıklayın
- oküler lens verilmişse, bileşik ışık mikroskobu tarafından görüntülenen bir nesnenin toplam büyütmesini belirlemek ve
- objektif büyütme
- Büyütmeyi artırdıkça mikroskobun görüş alanının neden azaldığını açıklayın
Bu laboratuvardan sonra başka birine açıklayabilmeniz gereken şeyler:
- Birleştirmek
- Toplam büyütme
- dürbün
- Görüş alanı
- Odak derinliği
- inversiyon fenomeni
Slayt gösterisi
Metnin bu sürümünden bir SlideShare öğesi hariç tutulmuştur. Çevrimiçi olarak buradan görüntüleyebilirsiniz: pb.libretexts.org/bio1lm/?p=134
Not
Bu derste kullanılan ışık mikroskopları, dönem boyunca birçok öğrenci tarafından kullanılan hassas ve pahalı aletlerdir. Bu laboratuvar size mikroskopları uygun şekilde kullanmanız ve bakımını yapmanız için gereken bilgi ve becerileri öğretecektir.
Arka plan
Biyologların incelediği pek çok organizma (bakteri) ve organizma parçaları (hücreler) insan gözüyle görülemeyecek kadar küçüktür. Kullanırız mikroskoplar araştırmamız için örnekleri büyütmek için. Mikroskop kelimesi “küçük görmek” anlamına gelir ve ilk ilkel mikroskop 1595 yılında yapılmıştır.
Birkaç çeşit mikroskop vardır, ancak çoğunlukla bir mikroskop kullanacaksınız. bileşik ışık mikroskobu. Bu mikroskop türü, küçük bir örneği görüntülemek için oküler ve objektif olmak üzere iki mercek aracılığıyla odaklanan görünür ışık kullanır. İki boyutlu bir görüntüde sadece ışığın geçebileceği kadar ince olan hücreler ışık mikroskobu ile görülebilir.
Laboratuvarda kullanacağınız diğer bir mikroskop ise stereoskopik veya bir diseksiyon mikroskobu. Bu tür mikroskop, 3 boyutlu olarak bir böcek gibi daha kalın, daha büyük numunelerin görünür ışık görüntüsünü kullanır. Daha büyük örnekler görüntülediğiniz için, diseksiyon mikroskobunun büyütme aralığı bileşik ışık mikroskobundan daha düşüktür.
Öğretim elemanınız, dönem boyunca kullanacağımız bileşik ışık mikroskoplarının parçalarını ve işlevlerini gözden geçirecektir. Bu önemli bilgiyi hatırlamanıza yardımcı olması için sonraki sayfadaki tabloyu doldurun. Muhtemelen bu sayfaya sık sık başvuracaksınız. İşte etiketlemeniz ve not almanız için bir ışık mikroskobu resmi.
|Mikroskop parçası||İşlev|
|Okülerler (göz mercekleri)|
|Kol|
|Döner Burunluk|
|Sahne|
|Hedefler|
|Slayt klipleri|
|Sahne kontrol düğmesi|
|yoğunlaştırıcı|
|Iris diyaframı|
|Alt sahne lambası (Aydınlatıcı)|
|Kaba ayar|
|İnce ayar|
|Temel|
Bileşik Işık Mikroskoplarını Kullanma Kuralları ve Talimatları
Eğitmeniniz sınıfınızla mikroskop kullanımını tartışacaktır. Doğru odaklanma için izlenecek uygun adımlar gözden geçirilecektir. Eğitmeninizin belirttiği gibi adım adım sırayı izlemelisiniz. Bu tür mikroskoba aşina olsanız bile, sınıfın geri kalanıyla birlikte odaklama incelemesinden geçmeniz beklenir.
- Önemli genel kurallar:
- Mikroskobu her zaman 2 elinizle taşıyın; bir elinizi mikroskop koluna ve diğer elinizi mikroskop tabanının altına yerleştirin.
- Objektif lenslere (yani objektiflerin uçlarına) dokunmayın.
- Slayt eklerken veya çıkarırken hedefleri tarama konumunda tutun ve sahneyi düşük tutun.
- Sahne yüksekliğinde büyük değişiklikler yaparken mikroskoba daima yandan bakın.
- Objektif lensler sadece özel lens kağıdı ve lens temizleme sıvısı ile temizlenmelidir.
- Tamirci OYNAMAYIN - hiçbir mikroskop demonte edilmemelidir. Arızaları eğitmeninize bildirin.
- Laboratuvar dolabından mikroskop elde etmek için:
- Mikroskop için masanın üzerindeki ilk alanı temizleyin—kalabalık bir çalışma alanından kaçının.
- Mikroskoplar oturduğunuz yere göre numaralandırılmıştır. Tezgahınızın altındaki numarayı bulun ve ilgili mikroskobu kullanın.
- Mikroskobu İKİ elinizle taşıyın.
- Elektrik kablosunu sabitleyin - masadan sarkmasına izin vermeyin!
- Mikroskobu laboratuvar dolabına geri gönderirken:
- Sahneyi indirin.
- Tarama hedefini sahne üzerinde konumuna döndürün.
- Slaydınızı sahneden kaldırın.
- Sağlanan özel lens temizleme sıvısını ve kağıdı kullanarak lamı ve objektifi temizleyin.
- Sahneyi ortalayın, böylece her iki tarafa da fazla çıkıntı yapmaz.
- Kordonu mikroskop sahnesinin altına sararak sabitleyin..
- Toz kapağını değiştirin.
- Mikroskobu İKİ elinizle taşıyın.
- Mikroskobu, kola koyduğunuzdan emin olarak aldığınız aynı kübe geri koyun.
- Mikroskobu odaklamak için:
Mikroskoba yandan bakın:
- Sahneyi gidebildiği kadar alçaltın.
- Hedefleri, tarama hedefi aşamada aşağıyı gösterecek şekilde döndürün.
- Sahneyi, açıklık (sahnenin ortasındaki açıklık) ortalanacak şekilde ayarlayın.
- Sabitlemek için sahne kelepçesini kullanarak slaytınızı sahneye yerleştirin. Sahne kelepçesi yalnızca sahnenin yatay düzleminde hareket eder ve slaydın sağ alt köşesine zar zor dokunarak slaydı sabitler.
- Sahneyi hareket ettirerek numuneyi objektifin altında slaytınız üzerinde ortalayın.
- Slaytın objektif merceğe değmemesine dikkat ederek sahneyi gidebildiği kadar yukarı taşıyın - sahneyi ne kadar yükseğe kaldıracağınızı görebilmek için yandan bakın.
- Okülerlere bakın:
- Numuneniz odağa gelene kadar sahneyi aşağı doğru hareket ettirmek için kaba ayar düğmesini kullanın, ardından odağı keskinleştirin.
- Sahneyi hareket ettirerek numuneyi mikroskop alanında ortalayın.
- Mikroskoba yandan bakın:
- Düşük güçlü (10X) objektifi yavaşça konumuna döndürün.
- Okülerlere bakın:
- Gerekirse, kaba ayar düğmesiyle odağı keskinleştirin. Genellikle sadece minimum miktarda ayarlama gereklidir.
- Gerekirse numuneyi sahada ortalayın.
- Mikroskoba yandan bakın:
- Yüksek güç hedefini yerine döndürün çok dikkatli!
- Okülerlere bakın:
- Yalnızca ince ayar düğmesini kullanarak odağı keskinleştirin. Gerekirse yeniden ortalayın. (Numuneniz "kaybolduysa", hemen düşük güce dönün ve numuneyi yeniden ortalayın.)
- Bir slaydı kaldırırken, slaydı kaldırmadan önce her zaman hedefleri tarama konumuna getirin ve sahneyi indirin!
- Sahneyi gidebildiği kadar alçaltın.
Bölüm 1: Toplam Büyütme
Büyütme mikroskoptaki görüntünün boyutunun nesnenin gerçek boyutuna oranıdır. Büyütme oranı 10 dediğinizde, mikroskopta gördüğünüz görüntü, numuneye çıplak gözle bakmaktan on kat daha büyüktür. Bileşik ışık mikroskobu ile iki mercekle büyüttüğünüzü unutmayın, böylece toplam büyütmeyi hesaplamak için objektif büyütmeyi oküler büyütme ile çarparsınız. Mikroskobu görüntüleyin ve her bir lens için toplam büyütmeyi hesaplamak için aşağıdaki tabloyu kullanın:
|Objektif lens||Göz merceği||= Toplam Büyütme|
|Tarama Hedefi|
|Düşük Amaç|
|Yüksek Amaç|
Bölüm 2: Tersine Çevirme Olgusu
Sınıfta bulunan bir “e” harfi slaytı edinin. Slaytı gözlerinizle görün ve ardından mikroskoba yerleştirin. Slaytı düşük güçte görüntülemek için odaklama sırasını kullanın.
Prosedür
- “e” harfini mikroskop olmadan slayta baktığınızda göründüğü gibi çizin.
- Mikroskop altında slayta baktığınızda “e” harfini göründüğü gibi çizin.
- Okülerlerden bakarken mekanik sahne kolunu kullanarak kaydırağınızı sağa hareket ettirin. “e” hangi yöne hareket eder?
- Okülerlerden bakarken mekanik sahne kolunu kullanarak kaydırağınızı kendinizden uzaklaştırın. “e” hangi yöne hareket eder?
Tersine çevirme fenomenini kendi kelimelerinizle ifade edin.
Bölüm 3: Görüş Alanı
NS Görüş alanı hedeflere baktığınızda gördüğünüz örneğin miktarıdır. Daha yüksek büyütmelerde görüş alanı azalır.
Prosedür
Cetvelin kenarı alan çapı boyunca dikey bir çizgi olarak görünecek şekilde sahne açıklığına mavi plastik bir cetvel yerleştirin. Objektif lenslerin her biri için alan boyutunu milimetre cinsinden tahmin edin.
Tarama __________ Düşük (10X) __________ Yüksek (40X) __________
Bölüm 4: Odak Derinliği
NS odak derinliği belirli bir büyütmede odakta kalan numunenin kalınlığıdır. Odak derinliği daha yüksek büyütmelerde azalır.
Prosedür
Renkli bir iplik slaytı alın ve tarama veya düşük güç altında görüntüleyin. Ardından, hangi renk ipliğin olduğunu belirleyin:
- Yukarıda
- Ortada
- En altta
İpucu: odaklama talimatlarını kullanarak üç ipliğin kesiştiği alana odaklanın. İpliklerin sırasını ayırt etmek için ince odağı kullanın.
Bölüm 5: Islak Montaj Yapmak
Dönem boyunca, "wet mounts" adı verilen bir dizi basit slayt hazırlığını başarıyla yapmanız beklenecektir. İncelenecek numune temiz bir lam üzerine yerleştirilir, bir veya iki damla su eklenir ve su ve numunenin üzerine dikkatlice bir lamel yerleştirilir. Eğitmeniniz bu tekniği gösterecektir.
Aşağıdaki prosedürü izleyerek ıslak bir havuz suyu montajı yapın:
- Plastik tek kullanımlık pipeti kullanarak temiz bir cam slayt üzerine bir damla havuz suyu koyun.
- Bir lamel ile slayttaki gölet suyunu örtün. Avid hava kabarcıkları için bir açıyla lamel yerleştirmeye çalışın.
- Slaytınızdaki fazla sıvıyı silin.
- Numuneyi gözlemlemek için lamı mikroskoba yerleştirin.
- Tarama hedefinde başlayın
- Gerektiğinde düşük ve yüksek hedeflere dikkatlice geçin.
Umarım havuz suyunuzda bazı canlı organizmalar görürsünüz. Yeşil malzemeye bakarsanız, muhtemelen bir tür bitkidir. Hareket eden bir şey var mı diye bakın. Aşağıdaki boşluğa mikroskop altında gözlemlediğiniz şeyi açıklayın ve basit bir resim çizin.
Bölüm 6: Stereoskopik Diseksiyon Mikroskop
Eğitmeniniz diseksiyon kapsamının doğru kullanımını gösterecektir. Bu mikroskoplar genellikle kullandığınız bileşik mikroskoptan daha düşük büyütme sağlar.
Prosedür
Diseksiyon mikroskobu kullanarak laboratuvar masasında bulunan örnekleri görüntüleyin. Mikroskobun biri tabandan diğeri yukarıdan olmak üzere iki ışık kaynağına sahip olduğuna dikkat edin. Numuneler her zaman bir slayt üzerine monte edilmez. Ayrıca, nesneleri diseksiyon mikroskobu altında görüntülediğinizde bunların üç boyutlu olduklarını unutmayın.
Laboratuvar Soruları
- Bir stereoskopik diseksiyon mikroskobunun bileşik mikroskoptan farklı olmasının iki yolunu listeleyin.
- Hangi mikroskop, bileşik ışık veya diseksiyon mikroskobunun büyütme oranı daha düşüktür?
Mikroskopun Temizliği ve Bakımı
- Mikroskop merceğini nasıl ve neyle temizleyeceğinizi açıklayın.
- Laboratuvarın sonunda mikroskobu kullanmayı bitirdiğinizde yapmanız gereken dört şeyi listeleyin.
17.4: Mikroskop - Biyoloji
Şarj bağlantılı bir cihazın nihai çözünürlüğü (CCD) veya tamamlayıcı metal oksit yarı iletkeni (CMOS) görüntü sensörü, mikroskop optik sistemi tarafından görüntüleme dizisinin yüzeyine yansıtılan görüntüye göre fotodiyotların sayısının ve boyutlarının bir fonksiyonudur. Mikroskop optik çözünürlüğünü belirli bir dijital kamera ve video bağlayıcı kombinasyonuyla eşleştirmeye çalışırken, mikroskoptan tüm optik verileri yeterli şekilde yakalamak için gereken minimum piksel yoğunluğunu belirlemek için bu hesaplayıcıyı kullanın.
Öğretici, rasgele seçilmiş bir numunenin ekranda belirmesiyle başlatılır. Numune Görüntüsü pencere (kara kutu) ve göz merceği açıklığı veya projeksiyon merceği alan diyaframı ile sınırlandırılmıştır. Sensör tarafından yakalanan numunenin gerçek alanını ortaya çıkarmak için CCD boyutlarını (varsayılan olarak 2/3 inç) gösteren renkli bir dikdörtgen görüntünün üzerine bindirilir. Sürgülerin altındaki gri, sarı ve kırmızı kutularda, mikroskop Optik Çözünürlük (gri), CCD Gerekli Piksel Boyutu (sarı), Optimum CCD Dizi Boyutu (sarı), Monitör Büyütme (kırmızı ve Toplam Büyütme (kırmızı) mikrometre veya bir ürün olarak sunulmuştur. Kaydırıcılar çevrildikçe bu değerler sürekli olarak güncellenir. yeni bir CCD Formatı (boyut), ekranın solunda görünen radyo düğmeleri kullanılarak seçilebilir. Numune Görüntüsü pencere. Fiziksel CCD Boyutları seçilen sensörün yüzdesi (milimetre cinsinden), görüntüleme çipi ile aynı en-boy oranına sahip bir dikdörtgen boyunca görüntü penceresinin sağ tarafında görüntülenir.
Öğreticiyi çalıştırmak için, Sayısal Diyafram ve Objektif Büyütme Göz önünde bulundurulacak mikroskop optik konfigürasyonu için uygun değerleri ayarlamak için kaydırıcıları (değerler kaydırma çubuklarının üzerinde görünür). Ardından, bir mercek veya projeksiyon merceği seçin Alan Numarası (değerler 18 ile 26 milimetre arasında değişir) ve Video Bağlayıcı büyütme (0,5x ile 1,0x arasında). Kuplör kaydırıcısı çevrildikçe, numune görüntüsünün üzerine bindirilen dikdörtgenin boyutu öğretici tarafından CCD sensörü tarafından yakalanan numune alanıyla eşleşecek şekilde değiştirilir. kullanılarak herhangi bir noktada yeni bir numune seçilebilir. Bir Numune Seçin açılır menü.
Bir CCD veya CMOS görüntü sensörünün fotodiyot dizisi üzerine bir optik mikroskop tarafından oluşturulan görüntülerin yakalanmasının verimliliği, objektif büyütme, sayısal açıklık ve çözünürlükten elektronik görüntü sensörü fotodiyot dizisi boyutuna, en boy oranına kadar çeşitli faktörlere bağlıdır. , video bağlaştırıcı büyütme ve dizi içindeki tek tek ışığa duyarlı öğelerin boyutları. Ayrıca kontrast, sinyal-gürültü oranı, sahne içi dinamik aralık ve entegrasyon süresi gibi görüntülenen numuneye özgü parametreler de dikkate alınmalıdır.
Bir CCD'nin nihai optik çözünürlüğü, mikroskop lens sistemi tarafından dizi yüzeyine yansıtılan görüntüye göre fotodiyotların sayısının ve boyutlarının bir fonksiyonudur. Şu anda mevcut CCD dizilerinin boyutu birkaç yüz ile binlerce piksel arasında değişmektedir. Bilimsel araştırmalara yönelik cihazlarda kullanılan modern dizi boyutları, 1000 × 1000 ila 5000 × 5000 sensör elemanı arasında değişmektedir. Tüketici ve bilimsel düzeyde CCD üretimindeki eğilim, sensör boyutunun sürekli olarak küçülmesi yönündedir ve şu anda 4 × 4 mikrometre kadar küçük fotodiyotlara sahip dijital kameralar mevcuttur.
Bir mikroskobun optik elemanları ile görüntülenen bir numunenin yeterli çözünürlüğü, ancak her bir çözülebilir birim için en az iki numune yapıldığında elde edilebilir, ancak birçok araştırmacı yeterli numuneyi sağlamak için çözülebilir birim başına üç numuneyi tercih eder. Mikroskop gibi kırınım sınırlı optik cihazlarda, ortalama görünür ışık dalga boyunda (550 nanometre) optik çözünürlüğün Abbe limiti, sayısal açıklığı 1.4 olan bir objektif lens kullanıldığında 0.20 mikrometredir. Bu durumda, 10 mikrometre karelik bir sensör boyutu, tercih edilen 7 × 7 mikrometre sensör boyutuyla optik ve elektronik çözünürlüğün eşleşmesine izin verecek kadar büyük olacaktır. CCD görüntü sensöründeki daha küçük fotodiyotlar uzamsal çözünürlüğü iyileştirse de, aynı zamanda cihazın dinamik aralığını da sınırlar.
Tablo 1 - Mikroskop Optik Çözünürlüğünü Eşleştirmek için Piksel Boyutu Gereksinimleri
|Amaç |
(Sayısal Diyafram)
|Çözünürlük |
sınır
(Mikrometre)
|Öngörülen |
Boy
(Mikrometre)
|Gerekli Piksel|
Boy
(Mikrometre)
|1x (0.04)||6.9||6.9||3.5|
|2x (0.06)||4.6||9.2||4.6|
|2x (0.10)||2.8||5.6||2.8|
|4x (0.10)||2.8||11.2||5.6|
|4x (0.12)||2.3||9.2||4.6|
|4x (0,20)||1.4||5.6||2.8|
|10x (0,25)||1.1||11.0||5.5|
|10x (0,30)||0.92||9.2||4.6|
|10x (0,45)||0.61||6.1||3.0|
|20x (0,40)||0.69||13.8||6.9|
|20x (0,50)||0.55||11.0||5.5|
|20x (0,75)||0.37||7.4||3.7|
|40x (0,65)||0.42||16.8||8.4|
|40x (0,75)||0.37||14.8||7.4|
|40x (0,95)||0.29||11.6||5.8|
|40x (1.00)||0.28||11.2||5.6|
|40x (1.30)||0.21||8.4||4.2|
|60x (0,80)||0.34||20.4||10.2|
|60x (0.85)||0.32||19.2||9.6|
|60x (0,95)||0.29||17.4||8.7|
|60x (1.40)||0.20||12.0||6.0|
|100x (0,90)||0.31||31.0||15.5|
|100x (1,25)||0.22||22.0||11.0|
|100x (1.30)||0.21||21.0||10.5|
|100x (1.40)||0.20||20.0||10.0|
Mikroskopide, görüntü tipik olarak optik sistem tarafından bir insan gözünün retinası, bir elektrik görüntü sensörü veya geleneksel film üzerindeki hassas kimyasal emülsiyon olabilen bir dedektörün yüzeyine yansıtılır. Ortaya çıkan görüntünün bilgi içeriğini optimize etmek için, dedektörün çözünürlüğü mikroskobunkiyle yakından eşleşmelidir. Bir numunenin görüntüsünü oluşturmak için kullanılan görünür ışığın dalga boyu spektrumu, optik çözünürlük açısından mikroskobun performansında belirleyici faktörlerden biridir. Daha kısa dalga boyları (375-500 nanometre), ayrıntıları daha uzun dalga boylarından (500 nanometreden büyük) daha büyük ölçüde çözme yeteneğine sahiptir. Uzamsal çözünürlüğün sınırları aynı zamanda ışığın optik sistem boyunca kırınımı tarafından da belirlenir; bu terim genellikle şu şekilde adlandırılır: kırınım sınırlı çözüm. Araştırmacılar, sayısal açıklık, dalga boyu ve optik çözünürlük arasındaki ilişkiyi ifade etmek için kullanılan birkaç denklem türetmiştir:
Formül 1 - Sayısal Diyafram, Dalga Boyu ve Optik Çözünürlük
Formül 2 - Sayısal Diyafram, Dalga Boyu ve Optik Çözünürlük
Formül 3 - Sayısal Diyafram, Dalga Boyu ve Optik Çözünürlük
Nereye r çözünürlük (iki numune noktası arasındaki çözülebilir en küçük mesafe), NA nesnel sayısal açıklığa eşittir, λ dalga boyuna eşittir, NA(Obj) objektif sayısal açıklığa eşittir ve NA(Koşul) kondenser sayısal açıklığıdır. Şu denkleme dikkat edin (1) ve (2) denklem için 0,5 olan çarpma faktörü ile farklılık gösterir (1) ve denklem için 0.61 (2). Bu denklemler, optik fizikçiler tarafından objektiflerin ve yoğunlaştırıcıların davranışını açıklamak için yapılan çeşitli teorik hesaplamalar da dahil olmak üzere bir dizi faktöre dayanmaktadır ve herhangi bir genel fizik yasasının mutlak değeri olarak düşünülmemelidir. Varsayım, kaynaklardan biri tarafından oluşturulan Airy diskin merkezi, ikinci Airy diskin kırınım modelindeki birinci dereceden yansıma ile örtüştüğünde, iki nokta ışık kaynağının çözülebileceğidir (ayrı olarak görüntülenebilir). Rayleigh Kriteri. Konfokal ve multifoton floresan mikroskopisi gibi bazı durumlarda, çözünürlük aslında bu üç denklemden herhangi birinin koyduğu sınırları aşabilir. Düşük numune kontrastı ve uygun olmayan aydınlatma gibi diğer faktörler, daha düşük çözünürlüğe ve çoğu zaman gerçek dünyadaki maksimum değere hizmet edebilir. r (550 nanometrelik bir orta spektrum dalga boyu kullanılarak yaklaşık 0,20 mikron) ve 1,35 ila 1,40 sayısal açıklık pratikte gerçekleştirilmez.
Mikroskop mükemmel hizada olduğunda ve alt kademeli kondansatör ile uygun şekilde eşleşen hedeflere sahip olduğunda, objektif sayısal açıklık değeri denklemlerde ikame edilebilir (1) ve (2), eklenen sonuçla bu denklem (3) denkleme indirgenir (2). Unutulmaması gereken önemli bir kavram, büyütmenin bu denklemlerin hiçbirinde bir faktör olarak görünmemesidir, çünkü yalnızca sayısal açıklık ve aydınlatmanın dalga boyu numune çözünürlüğünü belirler. Yukarıda bahsedildiği gibi (ve denklemlerde gözlemlenebilir), ışığın dalga boyu bir mikroskobun çözünürlüğünde önemli bir faktördür. Daha kısa dalga boyları daha yüksek çözünürlük sağlar (daha düşük değerler r) ve tersi. Optik mikroskopide en büyük çözme gücü, en kısa etkili görüntüleme dalga boyu olan yakın ultraviyole ışıkla gerçekleştirilir. Yakın ultraviyole ışığı, numune detayını çözme yeteneğinde mavi, ardından yeşil ve son olarak kırmızı ışık takip eder. Çoğu durumda, mikroskopistler numuneyi aydınlatmak için bir tungsten-halojen ampul tarafından üretilen geniş spektrumlu beyaz ışığı kullanır. Görünür ışık spektrumu, yeşil ışığın baskın dalga boyu olan yaklaşık 550 nanometrede ortalanır (gözlerimiz yeşil ışığa en duyarlıdır). Eğitim için çözünürlük değerlerini hesaplamak için kullanılan ve Tablo 1'de sunulan bu dalga boyudur. Sayısal açıklık değeri de bu denklemlerde önemlidir ve daha yüksek sayısal açıklıklar da daha yüksek çözünürlük üretecektir (bkz. Tablo 1).
Katkıda Bulunan Yazarlar
Matthew J. Parry-Hill, Kimberly M. Vogt, John D. Griffin, ve Michael W. Davidson - Ulusal Yüksek Manyetik Alan Laboratuvarı, 1800 Doğu Paul Dirac Dr., Florida Eyalet Üniversitesi, Tallahassee, Florida, 32310.
İlgili Nikon Ürünleri
Optik
Ünlü CFI60 sonsuzluk optikleri dahil birinci sınıf Nikon objektifler, ultra düşükten en yüksek büyütmelere kadar nefes kesen keskinlik ve netlikte parlak görüntüler sunar.
Hedef Seçici
Nikon'un Objektif Seçici aracıyla mikroskop objektif lenslerini filtreleyin, bulun ve karşılaştırın.
Kameralar
Nikon, araştırmacıların örnekleri ve uygulamaları için ideal olan bir mikroskop görüntüleme sistemi yapılandırmasına olanak tanıyan çok çeşitli bir kamera ve kontrolör serisine sahiptir.
Keşif ve Tespit
Virüsler ilk olarak, mikroskopta görünen tüm bakterileri herhangi bir sıvı numuneden çıkarabilen bir porselen filtrenin (Chamberland-Pasteur filtresi) geliştirilmesinden sonra keşfedildi. 1886'da Adolph Meyer, tütün bitkilerinin bir hastalığının - tütün mozaik hastalığı - sıvı bitki özleri yoluyla hastalıklı bir bitkiden sağlıklı bir bitkiye aktarılabileceğini gösterdi. 1892'de Dmitri Ivanowski, Chamberland-Pasteur filtresinin özütteki tüm canlı bakterileri çıkarmasından sonra bile bu hastalığın bu şekilde bulaşabileceğini gösterdi. Yine de, bu "filtrelenebilir" bulaşıcı ajanların sadece çok küçük bakteriler değil, yeni bir tür çok küçük, hastalığa neden olan parçacıklar olduğu kanıtlanmadan yıllar önceydi.
Çoğu viryonlar veya tek virüs parçacıkları çok küçüktür, çapları yaklaşık 20 ila 250 nanometredir. Bununla birlikte, amiplerden yakın zamanda keşfedilen bazı virüslerin çapı 1000 nm'ye kadar çıkmaktadır. Poksvirüs ve diğer büyük DNA virüsleri gibi büyük viryonlar dışında, virüsler ışık mikroskobu ile görülemez. Bilim adamları, yukarıda tartışılan tütün mozaik virüsünün (TMV) (Şekil 1) ve diğer virüslerin (Şekil 2) yapısı hakkında ilk iyi görüşlerini 1930'ların sonlarında elektron mikroskobunun geliştirilmesine kadar alamadı. Virionların yüzey yapısı hem taramalı hem de transmisyon elektron mikroskobu ile gözlemlenebilirken, virüsün iç yapıları sadece bir transmisyon elektron mikroskobundan alınan görüntülerde gözlemlenebilir. Elektron mikroskobu ve diğer teknolojilerin kullanılması, her tür canlı organizmanın birçok virüsünün keşfedilmesine olanak sağlamıştır.
Şekil 2. Bu transmisyon elektron mikrograflarında, (a) bir virüs, enfekte ettiği bakteri hücresi tarafından cüce edilirken (b) bu E. coli hücreleri, kültürlenmiş kolon hücreleri tarafından cüce edilir. (kredi a: Çalışmanın U.S. Dept. of Energy, Office of Science, LBL, PBD tarafından değiştirilmesi, kredi b: çalışmanın J.P. Nataro ve S. Sears tarafından değiştirilmesi, yayınlanmamış veriler, Matt Russell'dan CDC ölçek çubuğu verileri)
Bitkiler Üzerine En İyi 10 Deney (Diyagramlı)
Bitkiler üzerinde deneyler üzerinde araştırma yapıyor musunuz? Doğru yerdesiniz. Aşağıdaki makale, bitkiler üzerinde yapılan on deneyden oluşan bir koleksiyon içermektedir: 1. Bitki Pigment Dağılımı 2. Bitkilerde Sapın Yükselişi 3. Bitkilerde Guttasyon 4. Bitkilerde Terleme 5. Bitkilerde Mineral Besleme 6. Fotosentez 7. Bitkilerde Solunum 8 Bitkilerde Büyüme Hızı 9. Maddeleri Destekleyerek Bitkilerin Büyümesi 10. Biyoteknoloji.
- Bitki Pigment Dağılımı Üzerine Deneyler
- Bitkilerde Sapın Yükselişi Üzerine Deneyler
- Bitkilerde Guttasyon Deneyleri
- Bitkilerde Terleme Deneyleri
- Bitkilerde Mineral Besleme Deneyleri
- Fotosentez Üzerine Deneyler
- Bitkilerde Solunum Deneyleri
- Bitkilerde Büyüme Hızı Deneyleri
- Maddelerin Teşvik Edilerek Bitkilerin Büyümesi Üzerine Deneyler
- Biyoteknoloji Üzerine Deneyler
1. Bitki Pigment Dağılımı Üzerine Deneyler:
Deneyin Amacı:
Bitki dokularında antoksantin varlığını tespit etmek.
Herhangi bir bitkinin beyaz renkli çiçekleri, konsantre amonyak, su banyosu, alkol, alkali, HCl, bazik kurşun asetat, demir klorür.
1. Verilen bitkinin (örneğin, Phlox veya Chrysanthemum) beyaz çiçekleri veya beyaz çiçeklerinin taç yaprakları, birkaç damla konsantre amonyak ile temas edecek şekilde yerleştirilir. Sarı bir renk elde edilir.
2. Beyaz çiçekleri sulu alkol içeren bir su banyosunda ayıklayın.
3. Ekstraktı süzün ve üç parçaya bölün:
(i) Bir porsiyona bir alkali ekleyin. Renk sarıya döner. Bunu birkaç damla HCl ekleyerek asitlendirin. Renk kaybolur.
(ii) İkinci kısma bazik kurşun asetat çözeltisi ekleyin. Sarı veya turuncu bir çökelti üretilir.
(iii) Ekstraktın üçüncü kısmına demir klorür çözeltisi ekleyin. Yeşil veya kahverengi bir renk belirir.
Bu üç testin tümü, malzemede antoksantinlerin varlığını gösterir.
2. Bitkilerde Öz Özünün Yükselişi ile İlgili Deneyler:
Deneyin Amacı:
Suyun bitkinin ksileminden yukarı doğru hareket ettiğini göstermek.
Balsam bitkisi, büyük test tüpü, test tüpü standı, su, pamuk, eozin lekesi, jilet, slayt, gliserin, mikroskop, lamel.
1. Kökleri, gövdesi, yaprakları ve çiçekleri olan tam bir balzam bitkisi alın.
2. Bitkiyi eozin solüsyonu içeren büyük bir test tüpünde tutun.
3. Test tüpünün ağzına bir pamuk tıkaç takın ve deneyi 2-3 saat boyunca rahatsız etmeyin (Şek. 14).
4. Sapın enine kesitini bir ustura ile kesin, lam üzerine yerleştirin ve mikroskop altında inceleyin.
Yaprak sapı tabanlarının ve petallerin pembe renge dönüştüğü gözlemlenmiştir. Sapın enine kesitinde sadece ksilem lekeyi almıştır.
Yaprak sapı tabanlarında ve taçyapraklarda görülen pembe leke, eozin lekesinin kök sapı ve yapraklar yoluyla yaprak sapı ve çiçeklere kadar ulaştığını gösterir. Mikroskop altında enine kesitin incelenmesi, yalnızca ksilem hücrelerinin boyandığını ortaya çıkarır, böylece çözeltinin ksilemden geçtiğini gösterir.
3. Bitkilerde Guttasyon Deneyleri:
Deneyin Amacı:
Tüm saksı bitkisi ile guttasyon sürecini göstermek.
Bir saksı bitkisi bahçe nasturtium, su, çan kavanozu (Bahçe nasturtium yerine yulaf fidesi, buğday fidesi, domates, Colocasia vb. bitkiler de alınabilir).
1. Saksılı bir bahçe nasturtium bitkisi alın ve bolca sulayın.
2. Bitki boyunca saksıyı bir çan kavanoz ile kapatın ve serin ve karanlık bir yere koyun.
3. Cihazı bir aspiratöre bağlayın ve hava geçirmez hale getirin (Şek. 17).
4. Deneyi birkaç saat a tutun ve değişiklikleri gözlemleyin.
Suyun yavaş eksüdasyonu her yaprağın ucunda başlar. Bu su damlaları yavaş yavaş büyür ve düşebilir veya yaprağın kenarından aşağı akabilir.
Bu su sızıntısı, guttasyon olgusundan kaynaklanmaktadır. Bitki bolca sulandığında, su ksilem damarlarından hücreler arası boşluklardan ve yaprakların kenarlarında bulunan gözenekli ve utangaç yapılardan (hidatodlar, su gözenekleri veya su stomaları, Şekil 19 olarak adlandırılır) bitkinin dışına zorlanır.
Su, ksilem elementlerinin özünde geliştirilen bir basınç yardımıyla hidatodlardan sızar. Kök basıncı ile aynı bir basınç olduğuna inanılmaktadır. Sızan su ayrıca amino asitler, mineral tuzlar, şekerler ve diğer çözünenlerin izlerini içerir.
Guttasyon, suyun kökler tarafından emilmesinin çok yüksek olduğu ve terleme hızının çok yavaş olduğu koşullar olduğunda bol miktarda meydana gelir. Guttasyon, bir mantarla donatılmış ve suyla doldurulmuş bir U-tüpünün bir ucuna sabitlendiğinde, tek bir taze kesilmiş bahçe nasturtium yaprağı ile de gösterilebilir. U-tüpünün diğer ucundan, yaprak sapındaki suyu zorlamaya yardımcı olan az miktarda cıva ekleyin.
4. Bitkilerde Terleme Deneyleri:
Deneyin Amacı:
Kobalt klorür yöntemi ile farklı bitkilerin yapraklarının stoma ve kütikül transpirasyonlarının karşılaştırılması.
Terleme açısından karşılaştırılacak bitkilerin yaprakları (tercihen ekteki durumda çalışılmalıdır), %3'lük kobalt klorür çözeltisi, filtre kağıdı, lamlar, forseps, klipsler, kronometre, desikatör, susuz kalsiyum klorür ve vazelin.
(a) Kobalt klorür disklerinin hazırlanması:
1. %3'lük bir kobalt klorür çözeltisi hazırlayın ve filtre kağıtlarını buna batırın.
2. Filtre kağıtlarını lastik bir rulo ile sıkarak fazla kobalt klorür solüsyonunu alın ve kurumasını bekleyin.
3. Filtre kağıdını belirli çaplarda küçük diskler halinde kesin, 30°-40°C'de fırında tamamen kurutun ve desikatörde saklayın. Kuru diskler mavi renktedir.
(b) Her iki yaprak yüzeyinden su kaybının karşılaştırılması:
4. Bitkinin bir yaprağını alın ve bir disk kobalt klorür kağıdını üst yüzeyine ve bir disk alt yüzeyine yerleştirin. Temiz cam slaytlarla bastırın.
5. İki sürgüyü iki ayrı klipsle birbirine tutturun, vazelinle hava geçirmez hale getirin ve kronometreyi başlatın (Şek. 24).
6. Diskin mavi renginin pembeye dönüştüğü zamanı not edin.
7. Aynı deneyi diğer bitkilerin yaprakları ile de karşılaştırın.
Yukarıda belirtilen gözlemler, yaprakların alt yüzeyinde maviden pembeye geçiş için gereken sürenin üst yüzeye göre daha kısa olduğunu göstermektedir.
İşlenen tüm yapraklarda alt yüzeyde renk üst yüzeye göre daha hızlı değiştiğinden, alt yüzeyden daha fazla su aktığı ve dolayısıyla bu yüzeyde üst yüzeye göre daha fazla stoma bulunduğu sonucuna varılabilir.
5. Bitkilerde Mineral Besleme Deneyleri:
Deneyin Amacı:
Bitkilerde mineral beslenmeyi gösteren su kültürü deneyini göstermek.
Yedi büyük cam kavanoz, yarma mantar, hemen hemen aynı büyüklükteki fideler (mısır, yulaf, domates veya tütün), Sach's besin solüsyonu (normal solüsyonun yanı sıra kalsiyum noksanlığı, azot noksanlığı, potasyum noksanlığı, fosfor noksanlığı olan solüsyonlar, demir eksikliği ve magnezyum eksikliği), siyah kağıt.
(A) Normal Sach’s Besin Çözeltisinin Hazırlanması:
Aşağıdaki bileşim normal Sach's besin çözeltisini yapar:
(B) Farklı eksikliklerle Sach's besin çözeltisinin hazırlanması:
(a) Kalsiyum eksikliği için çözüm:
Kalsiyum sülfat ve kalsiyum fosfat yerine potasyum sülfat ve sodyum fosfat kullanın.
(b) Azot eksikliği için çözüm:
Potasyum nitrat yerine potasyum klorür kullanın.
(c) Fosfor eksikliği için çözüm:
Kalsiyum fosfat yerine kalsiyum nitrat kullanın.
(d) Potasyum eksikliği için çözüm:
Potasyum nitrat yerine sodyum nitrat kullanın.
(e) Demir eksikliği için çözüm:
Demir sülfat kullanmayın.
(f) Magnezyum eksikliği için çözüm:
Magnezyum sülfat yerine potasyum sülfat kullanın.
1. Yedi adet büyük cam kavanoz alın ve sıcak su ve son olarak da distile su ile iyice temizleyin.
2. Bir kavanoza normal Sach's besin çözeltisini, kalan altı kavanoza sırasıyla kalsiyum, azot, fosfor, potasyum, demir ve magnezyum eksikliği olan çözeltileri doldurun. Tüm bu kavanozları cam işaretleme kalemi ile Normal, Ca, N, P, K, Fe ve Mg olarak işaretleyin (Şekil 33).
3. Bitkilerin (yulaf, mısır, domates veya tütün) hemen hemen eşit büyüklükteki genç fidelerini alın, yedi ayrı ayrı mantara yerleştirin ve her bir kavanoza fidelerin köklerine gelecek şekilde birer ayrı mantar yerleştirin. çözümlere daldırılır.
4. Yosun oluşumunu kontrol etmek ve onları aydınlık, sıcak koşullarda tutmak için kavanozları siyah kağıtla sarın.
5. Sıvıyı hemen her gün yenisiyle değiştirin ve yaklaşık bir ay boyunca değişiklikleri not edin.
Fidelerin büyümesi ve genel sağlığı, normal çözümde kesinlikle normaldir, ancak bazı veya diğer elementlerin eksikliği olan çözümlerde farklı, bodur veya birçok yönden kontrol edilir.
Farklı minerallerin eksikliğinin etkileri farklı bitkilerde farklıdır.
6. Fotosentez Üzerine Deneyler:
Deneyin Amacı:
Fotosentez için karbondioksitin gerekli olduğunu göstermek.
İki çan kavanoz, saksı bitkisi, aspiratör, beherler, sodalime, kostik potas, cam tabak (2), bir miktar inert malzeme, ince tüpe biten iki geniş tüp, gres, iyot.
1. İki saksı bitkisini alın ve nişastadan arındırmak için iki gün boyunca karanlıkta bekletin.
2. Tencereleri cam bir tabağa koyun ve üzerlerini bir kavanoz ile kapatın.
3. Her iki çömleğin ağzına iki delikli bir mantar takılmıştır. Bir delikten geniş ağızlı bir boru ince boruya sonlanır ve diğer delikten bir aspiratöre bağlı kalan bükülmüş bir boru takılır (Şekil 35).
4. Bir kavanozun geniş ağızlı tüpü sodalime ile doldurulur. Çan kavanozuna kostik potas içeren iki beher yerleştirin.
5. Diğer kavanozun geniş ağızlı tüpü çakıl gibi bazı inert maddelerle doldurulur ve bu kavanoza kostik potas yerine su içeren iki beher koyun. Bu bir kontrol işlevi görür.
6. Havanın içeri girmesini önlemek için haznenin tabanına gres sürün ve her iki aparatı da birkaç saat güneş ışığında tutun ve gözlemleyin.
Her iki bitkinin yapraklarını nişasta için ayrı ayrı test edin. Beher içinde potas kostik, tüpünde sodalime bulunan bir kavanozun altına yerleştirilen bitkinin yaprakları nişasta için negatif test gösterirken, diğer (beherlerin içinde su ve tüpün çakıllarla dolu olduğu) diğer kavanozun yaprakları pozitiftir. nişasta testi.
Bir bitkinin yapraklarındaki nişasta için negatif test, CO'nun olmaması nedeniyle yapraklarında nişasta oluşumunun olmadığını gösterir.2. Fotosentez için diğer tüm koşullar (yani ışık, klorofil, su ve sıcaklık) normaldir.
Sadece CO2 CO olduğu için tesisin çevresinde mevcut değildir.2 Geniş ağızlı borudan giren havanın % 50'si sodalime tarafından emilir ve giren hava CO'dan arındırılır.2. Öte yandan CO2Bitkinin solunum sürecinde ortaya çıkan, beherlere konulan kostik potas tarafından emilir.
Diğer bitkinin yaprakları, nişasta için pozitif test gösterir, çünkü fotosentez için tüm temel gereksinimler, yani ışık, klorofil, su, sıcaklık ve ayrıca CO22, çevresinde bulunur.
Yani, CO2 fotosentez için gereklidir.
7. Bitkilerde Solunum Deneyleri:
Deneyin Amacı:
Pettinkoffer tüplerini kullanarak çeşitli bitki kısımlarının hacimsel yöntemle solunum hızlarını ölçmek ve karşılaştırmak.
Kavanozlar, solunum substratı, Pettinkoffer's aparatı, baryum hidroksit solüsyonu, ahşap sehpa, basınç düzenleyici (emme pompası), gres, sodalime, oksalik asit, fenolftalein, baryum karbonat, kostik potas, büret, beherler, ölçü silindiri, tartılı terazi kutu.
1. Kavanozları sodalı limonla doldurun ve yaklaşık 100 gm yerleştirin. U-tüp odasında solunum malzemeleri.
2. Şimdi uzun ve dar Pettinkoffer tüplerini bilinen konsantrasyonda (N/10) baryum hidroksit çözeltisi ile doldurun. Pettinkoffer's tüplerini eğik olarak yönlendirilecek şekilde ahşap bir stand üzerine yerleştirin.
3. Tüpleri bir emme pompası veya basınç regülatörü ile bağlayın.
4. Gres uygulayarak tüm aparatı hava geçirmez hale getirin.
5. Şimdi basınç regülatörünün çalışmasına izin verin. Bu nedenle hava akımı, havanın karbon dioksitini emen sodalime ile doldurulmuş kavanozlara akar. Hava şimdi U şeklindeki solunum odasına yerleştirilen bitki materyalinden geçer (Şekil 53).
6. U-şekilli odalardan, hava şimdi baryum hidroksit solüsyonu ile doldurulmuş Pettinkoffer'in tüplerinden geçirilir.
7. Soda kireci, solunum substratı ve baryum hidroksit çözeltisi boyunca havanın ve kabarcıkların yavaş hareketini düzenlemek için basınç regülatörünün çalışmasına izin verilir. Hava önce Pettinkoeffer tüplerinden birinden geçer ve daha sonra ikinci tüpten akmasına izin verilir.
8. Şimdi ilk tüpü çıkarın ve içeriğini titre edin. Çökeltilmiş baryum karbonat (BaCO2) varlığından dolayı3) içerik bulanık hale gelir.
9. Yaklaşık 25 ml ölçün. Pettinkoffer tüpünün içeriği, yani baryum karbonat ve N/10 oksalik asit çözeltisine karşı titre edin.
10. Fenolftalein damlaları, baryum karbonat içeren beherde indikatör olarak kullanılır ve bitiş noktasını not edin.
Gözlemler ve sonuçlar:
Gözlemler ve sonuçlar aşağıdaki tablo şeklinde not edilebilir:
(bir1 = Oksalik asidin bilinen normalliği.
Aşağıdaki gibi hesaplanır:
Oksalik asidin moleküler ağırlığı = 126
Eşdeğer ağırlık 126/2 = 63
N/10= 6.3 gr. 1000 cc suda çözünen oksalik asit
(b) V1 = Kullanılan oksalik asidin bilinen hacmi = 10 cc
(c) N2 = Belirlenecek olan baryum hidroksit çözeltisinin normalliği.
(d) V2 = Baryum karbonat hacmi =25 cc
bu şekilde N1V1 = N2V2 aşağıdaki gibi hesaplanabilir:
Bu nedenle, N2 = 6.3 × 10 / 25= 2.52
CO miktarı2 100 gr olarak üretilmiştir. verilen bitki materyalinin (solunum substratı) bir saatte 2.5 mg/litredir. Aynı şekilde, farklı solunum substratlarının veya farklı bitki kısımlarının solunum hızı belirlenebilir.
8. Bitkilerde Büyüme Hızı Deneyleri:
Deneyin Amacı: Bitkinin büyüme hızını yatay bir mikroskopla ölçmek.
Ölçülecek bitkinin doğrusal ölçeği, kalemi, bitkisi veya dalı ile donatılmış dikey ayaklı yatay mikroskop.
Yatay mikroskopta (Şekil 57), optik yatay konumda kalır. Kayar lineer skala ile donatılmış dikey bir stand tarafından tutulur. Optik tüpü bir vida yardımıyla yukarı ve aşağı hareket ettirilebilir. Doğrusal bir ölçek yardımıyla dikey hareket ölçülebilir.
Bu mikroskoptan büyüme aşağıdaki şekilde ölçülür:
1. Bir kalem yardımıyla sürgünün tepesinde küçük bir nokta oluşturun.
2. Göz merceğinden gözlemleyerek bu mürekkep noktasını mikroskobun odağına getirin.
3. 24 saat sonra, bitkideki büyüme nedeniyle şimdi yükselen aynı mürekkep noktasını tekrar gözlemleyin. Mikroskobu yukarı doğru hareket ettirin, odaklayın ve ilk ve son okumalar arasındaki mesafeyi not edin.
4. 24 saatlik belirli bir aradan sonra 10 gün boyunca günlük okumaları not edin.
Günlük okumalarda bir artış gözlenir. Bu bitkinin her gün büyüdüğünü gösterir.
9. Maddelerin Teşvik Edilerek Bitkilerin Büyümesi Üzerine Deneyler:
Uygun bitki materyali kullanılarak oksin, gibberellin, sitokinin, absisik asit (ABA) ve etilenin biyoanalizi.
Biyoassay, bir maddenin, örneğin büyüme, yani bir organizmanın çevreyi test etmek için kullanılması üzerindeki biyolojik etkilerini ölçerek nicel olarak belirlenmesi anlamına gelir, Veya, bir biyolojik ürünün, bir organizma üzerindeki etkisini test ederek gücünün belirlenmesidir. .
Aşağıdaki Tabloda belirtilen uygun bitki materyalleri veya biyo-tahlil materyalleri.
Yöntem, gözlemler ve sonuçlar:
Aşağıdaki tabloya bakın:
10. Biyoteknoloji Deneyleri:
Deneyin Amacı:
Bir bitki materyalinde doku kültürü metodolojisinde kullanılan genelleştirilmiş adımları çözmek.
Bitki materyali (örn. olgun havuç bitkisi), su, neşter veya jilet, mantar kurdu, steril petri kapları, nasır başlatma ortamı (örn. Murashige-Skoog’s ortamı), 2, 4-D, sürgün geliştirme ortamı, topraklı saksı.
1. Musluk kökü bozulmamış olgun bir havuç bitkisini (Şekil 2A) alın, yapraklarını çıkarın ve musluk kökünü iyice yıkayın (Şekil 2B).
2. Musluk kökünü keskin bir neşter veya ustura ile 3 veya 4 parçaya (Şekil 2C) kesin.
3. Mantar deliciyi bir kök parçasına yerleştirin (Şekil 2D) ve istenen kök bölgelerini çıkarın.
4. Bu şekilde çıkarılan bir musluk kökü parçasını steril bir petri kabına koyun ve (Şekil 2E)'de gösterildiği gibi enine küçük parçalar halinde kesin.
5. Steril bir petri kabına 2, 4-D ile bir miktar kallus başlatma besiyeri (örn. Murashige-Skoog's besiyeri veya MS besiyeri) alın, üzerine bazı diskler veya kesilmiş kök parçaları yerleştirin ve 6-8 hafta inkübe edin. Kallus oluşumu 4-6 hafta içinde başlar (Şekil 2F).
6. Kalusu sürgün geliştirme ortamı içeren başka bir petri kabına aktarın. Kökleri ve sürgünleri olan genç bitkiler (Şek. 2G) 4-8 hafta içinde gelişmeye başlar.
7. Bu genç bitkiler, olgun bitkilere (Şekil 2A) dönüştükleri toprak içeren saksılara (Şekil 2 H) aktarılır.
Mikroskopi ve Dijital Görüntüleme Eğitimi
Geniş alanlı ve konfokal floresan mikroskopisi, ışık yayan floroforları bir mikrometrenin çeyreğine yaklaşan bir çözünürlükle büyütebilir ve görüntüleyebilir, böylece dinamik olayların ve hücresel mimarinin ince yapısal detaylarının incelenmesini sağlar. Bu teknikleri kullanarak, veziküllerin intrasitoplazmik taşınması, hücre iskeleti yapısı, doku yeniden şekillenme mekanizmaları ve hastalıklı bir organizmada kanser hücrelerinin göçü dahil olmak üzere hücreler, dokular ve tüm organizmalar içinde meydana gelen sayısız olaya ilişkin temel bilgiler elde edilmiştir. Hücre biyolojisinde floresan mikroskopi kullanımındaki son dramatik artışın merkezinde, neredeyse her proteinin veya peptidin görüntüleme ve analiz için bir floresan hedef arama işareti olmasını sağlamak için endojen etiketler olarak işlev gören genetik olarak kodlanmış floresan proteinlerin geliştirilmesi yer almaktadır. Gelişmiş yeni enstrümantasyon ve son derece hassas dedektör sistemlerinin yaygın olarak bulunması, çeşitli biyolojik soruları ele almak için uygun uzay-zamansal özelliklere sahip üstün görüntülerin elde edilmesine izin verdi.
Biyoloji üzerindeki devrim niteliğindeki etkisine rağmen, tüm geleneksel floresan mikroskopi biçimleri (geniş alan, konfokal ve multifoton dahil), ışığın lensler ve dairesel açıklıklar yoluyla kırınımı tarafından dayatılan bir çözünürlük sınırıyla karşı karşıyadır. Kırılan ışığın dalga benzeri karakteri, yanal ( x , y ) boyutlarda yaklaşık 200 nanometreden ve eksenel ( z ) boyutta yaklaşık 500 nanometreden daha küçük nesnelerin bulanıklıktan başka bir şey olarak görüntülenmesini engeller. Çoğu hücre altı yapının (aktin lifleri, ara filamentler, mikrotübüller, ribozomlar ve taşıma kesecikleri gibi) bu boyuttan çok daha küçük özellikler sergilemesi nedeniyle, kırınım bariyerini kırmak için bir mekanizma ve boyut sınırlamasının altında görüntüleme. tanımlar, yüzyıllardır optik mikroskopinin kutsal kâsesi olmuştur.
Geçtiğimiz on yılda, kırınım engelini aşmak ve biyolojik yapıların süper çözünürlük seviyesinde analizini sağlamak için birkaç farklı kavramsal strateji tanıtıldı. Genellikle nokta yayılımlı fonksiyon mühendisliği veya aydınlatma tabanlı süper çözünürlük olarak adlandırılan oldukça gelişmiş bir strateji, odak noktası boyutunu azaltmak için doğrusal olmayan optik yaklaşımları kullanır. Bu tip süper çözünürlüklü görüntülemenin örnekleri, uyarılmış emisyon tükenmesi (STED), temel durum tükenmesi (GSD) ve doymuş yapılandırılmış aydınlatma (SSIM) mikroskobudur. Bu gelişmiş teknikler, çok daha küçük bir odak noktası boyutu üretmek için nokta yayılma fonksiyonunun kontrollü mühendisliği yoluyla uyarma ışık modelini değiştirerek, biyolojik numunelerdeki ince yapısal detayları çözme yeteneğine sahiptir. Yanal boyutlarda sırasıyla STED ve SSIM ile 20 ve 50 nanometreye yaklaşan çözünürlükler elde edilmiştir.
Kırınım bariyerinin üstesinden gelmek için ikinci (ve giderek daha popüler hale gelen) bir strateji, yoğun molekül popülasyonlarındaki uzamsal farklılıkları süper çözünürlüklü olarak çözmek için foto-değiştirilebilir floresan probları kullanır. Bu yaklaşım, floresansın stokastik aktivasyonuna dayalıdır ve ışıkla aktifleştirilebilen molekülleri aralıklı olarak parlak bir duruma geçirir ve daha sonra bunlar görüntülenir ve ışıkla ağartılır. Böylece, aynı kırınım-sınırlı hacimde bulunan (ve aksi takdirde uzamsal olarak ayırt edilemeyecek olan, Şekil 1(a)'ya bakınız) çok yakın aralıklı moleküller zamansal olarak ayrılır. Tekrarlanan fotoaktivasyon döngüleri ile elde edilen tüm tek molekül pozisyonlarının birleştirilmesi, ardından görüntüleme ve ağartma, nihai süper çözünürlüklü görüntüyü üretir (Şekil 1(b)). Bu stratejiye dayalı teknikler genellikle prob tabanlı süper çözünürlük olarak adlandırılır ve genellikle fotoaktive edilmiş lokalizasyon mikroskobu (PALM), floresan fotoaktivasyon lokalizasyon mikroskobu (FPALM) ve stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (STORM) adlarıyla anılır. Her üç yöntem de aynı ilkelere dayanmaktadır, ancak orijinal olarak farklı fotodeğiştirilebilir problar kullanılarak yayınlanmıştır. Şekil 1'de sunulan, toplam dahili yansıma floresan (TIRF) mikroskobu kullanılarak süper çözünürlüklü görüntülemenin bir örneğidir. Şekil 1(a), bir lamel üzerine eklenmiş floresan protein tek moleküllerinin pikselleştirilmiş görüntüsüdür. Tek tek moleküllerin konumları, örtüşen nokta yayılma işlevleri nedeniyle kesin olarak belirlenemez, ancak protein moleküllerinin merkezi, PALM veya benzer teknikler kullanılarak yüksek doğrulukla (Şekil 1(b)) geçici olarak çözülebilir.
PALM ve FPALM, değiştirilebilir problar olarak ışıkla etkinleştirilebilir veya ışıkla dönüştürülebilir floresan proteinler (tandem dimer Eos ve ışıkla etkinleştirilebilir GFP, PA-GFP) kullanılarak geliştirildi, oysa STORM orijinal olarak kısa DNA moleküllerini etiketlemek için sentetik karbosiyanin boyaları Cy3 ve Cy5 kullanılarak yayınlandı. Tarihsel gelişimdeki küçük farklılıklardan bağımsız olarak, sentetik boyalarla PALM deneyleri ve floresan proteinlerle STORM deneyleri yapmak mümkün ve pratiktir. Klasik floresan mikroskobundaki durumun aksine, prob tabanlı süper çözünürlüklü mikroskopi, biyolojik yapıların en karmaşık aydınlatma tabanlı süper çözünürlük tekniklerine benzer şekilde nanometrik doğrulukla tanımlanmasına izin verir. Bununla birlikte, tek moleküllü lokalizasyon görüntüleme tekniklerinin uygulanması, hücre içi yapıları vurgulayan floresan probların, dağılımları ve dinamikleri analiz edilebilmesi için yüksek moleküler yoğunluklarda ayrı ayrı tanımlanmasına da izin verir. Böyle yüksek çözünürlük, moleküler makinelerin haritalanmasının yanı sıra stokiyometri ve dinamikler de dahil olmak üzere biyolojik fonksiyonla ilgili mekanik soruları ele almak için birçok olasılığa kapı açar.
Geniş alan toplam iç yansıma (TIRF) tek moleküllü süper çözünürlük için temel mikroskop konfigürasyonu Şekil 2'de sunulmuştur. Fotoaktivasyon ve okuma lazerleri (sırasıyla 405 ve 561 nanometre), gerektiğinde kapatılabilecekleri veya aynı anda kullanılabilecekleri şekilde konumlandırılmıştır. En çok yönlü düzenleme, maksimum güç miktarını sağlamak için lazerleri fiber optik olmadan doğrudan mikroskoba bağlar (ticari enstrümanlar lazeri/lazerleri optik fiberler kullanarak verimli bir şekilde birleştirir). Mikroskobun arka portuna, maksimum sinyal-gürültü için emisyon ışığının yüzde 100'ünü alması gereken, soğutulmuş bir elektron-çoğaltıcı şarj-bağlı cihaz (EMCCD) kamera sistemi takılıdır. Numune özel bir tutucuya monte edilir ve tek moleküllerin geçici görüntülerini toplamak için hassas x - y aşamasına cıvatalanır. Numunenin altına yüksek bir sayısal açıklık hedefi yerleştirilir ve TIRF modunda çalışır. Diferansiyel girişim kontrastı (DIC) ile donatılmış bir yardımcı aydınlık alan yoğunlaştırıcı sisteminin (gösterilmemiştir) kullanılması, tek moleküllü görüntüleme için numunenin uygun bölgelerini aramak için numunenin incelenmesini sağlar. Enstrümantasyonun merkezinde, kamera tarafından kaydedilen görüntüleri alan ve işleyen yüksek hızlı bir bilgisayar sistemi bulunur.
Hem STED gibi aydınlatma tabanlı süperçözünürlük teknikleri hem de PALM gibi prob tabanlı teknikler artık biyologların hücrelerdeki yapıları ve dinamik süreçleri moleküler düzeyde veya moleküler düzeyde görselleştirmelerine izin veriyor. Önceki optik mikroskopi metodolojisine göre uzamsal çözünürlükte elde edilen büyüklük sırası iyileştirmesi, bu yeni yaklaşımların 200 nanometrelik kırınım sınırının altında noktadan noktaya çözünürlük gerektiren sayısız biyolojik soruyu ele almak için muazzam bir potansiyel gösterdiğini göstermektedir. Bugüne kadar, süper çözünürlüklü mikroskopi, mitokondri, lizozomlar, fokal adezyonlar, mikrotübüller, aktin filamentleri ve kaplanmış veziküller gibi hücre yapılarının ince mimarisi hakkında ayrıntılar sağlamıştır. Fokal yapışma komplekslerinin hareketi, alt çözünürlüklü kesecik taşınması ve bakteri polarite komplekslerinin yanı sıra plazma zarına sınırlı tek moleküller dahil olmak üzere dinamik süreçler de gözlenmiştir. Hiç şüphe yok ki, bu keşif çabaları nihayetinde hücresel yapı ve işlevin gizemlerine yönelik sayısız araştırmaya yol açacaktır.
Başa dön ^ PALM Görüntülemede Temel Kavramlar
Fotoaktive edilmiş lokalizasyon mikroskobu ve ilgili teknikleri çevreleyen ilke, tek floroforların (tek moleküllü görüntüleme) görüntülenmesi ve bu etiketlerin seyrek alt kümelerinin zaman içinde kontrollü aktivasyonu ve örneklenmesinin bir kombinasyonuna dayanır. Tek moleküllü görüntüleme ilk olarak 1989'da, önce kriyojenik sıcaklıklarda ve daha sonra yakın alan taramalı optik mikroskopi kullanılarak oda sıcaklığında gösterildi. O zamandan beri, metodoloji standart bir geniş alan mikroskopi tekniği haline geldi. Bir molekülün kırınım sınırlı görüntüsünün tek bir kaynaktan geldiğine dair ön bilgi, o molekülün konumunun (merkez) kırınım sınırının çok ötesinde bir hassasiyetle tahmin edilmesini sağlar. Bu yüksek hassasiyet seviyesi, aşağıda açıklanacağı gibi, tespit edilen foton sayısının ters karesiyle ölçeklenebilir.
Genel anlamda, tek bir flüoresan molekülü, uyarma dalga boyu, görüntüleme ortamının kırılma indisi ve mikroskop hedefinin açısal açıklığı ile tanımlanan yanal ve eksenel boyutlara sahip kırınım sınırlı bir görüntü oluşturur:
Çözünürlük x,y = λ / 2[η • sin(α)] (1) Çözünürlük z = 2λ / [η • günah(α)] 2 ( 2)
burada λ ışığın dalga boyudur (floresanda uyarım) ve birleşik terim η • sin(α) objektif sayısal açıklık ( NA ) olarak bilinir. Mikroskopide yaygın olarak kullanılan hedeflerin sayısal açıklığı 1.5'ten azdır (her ne kadar yeni yüksek performanslı hedefler bu sınıra çok yaklaşsa da), Denklem (1) ve (2)'deki α terimini 70 dereceden daha az bir değerle sınırlandırır. Bu nedenle, en kısa pratik uyarma dalga boyunda (1.40 sayısal açıklığa sahip bir objektif kullanıldığında yaklaşık 400 nanometre) teorik çözünürlük sınırı, yanal boyutta yaklaşık 150 nanometre ve eksenel boyutta 400 nanometreye yaklaşmaktadır. Canlı hücrelerde geliştirilmiş yeşil floresan proteinin (EGFP) görüntülenmesi için pratik açıdan, bu değerler sırasıyla yaklaşık 200 ve 500 nanometredir. Bu nedenle, 200 ila 250 nanometreden daha yakın olan yapılar, geniş alan veya konfokal floresan mikroskobu kullanılarak yanal düzlemde çözülemez.
Tek moleküllü emitörlerin bir görüş alanında yanal görüntü düzlemini incelerken, her kırınım sınırlı noktanın merkezi kısmı, bir molekülün olası konumuna karşılık gelir ve yeterli sayıda foton toplanarak yüksek nanometrik hassasiyetle lokalize edilebilir. Lokalizasyon merkezini belirlemeye yönelik yöntemler, ölçülen foton dağılımının (aslında görüntü noktası, ama aynı zamanda nokta yayılım işlevi olarak da anılır) bir Gauss işlevine istatistiksel bir eğri uydurmasına dayanır (bkz. Şekil 3). Bu alıştırmadaki nihai amaç, aşağıdaki denkleme göre foton dağılımının ( μ = x 0 , y 0 ) merkezini veya ortalama değerini ve belirsizliğini, ortalamanın standart hatasını σ belirlemektir:
burada N, toplanan fotonların sayısıdır, a, görüntüleme CCD dedektörünün piksel boyutudur, b, arka planın standart sapmasıdır (detektör gürültüsüyle birlikte arka plan floresan emisyonunu içerir) ve si, standart sapması veya genişliğidir. dağılım (i yönünde). i indeksi, x veya y yönünü ifade eder. Denklem (3)'ün sağ tarafında karekök altında yer alan ilk terim foton gürültüsünü ifade ederken, ikinci terim detektörün sonlu piksel boyutunun etkisini kapsar. Son terim, arka plan gürültüsünün etkisini hesaba katar. Bu basit matematiksel teknikleri uygulayarak, arka plan gürültüsü ihmal edilebilir olduğunda yaklaşık 1000 fotonluk bir foton dağılımı ile yaklaşık 10 nanometrelik bir lokalizasyon doğruluğu elde edilebilir. Bu kavrayışın genişletilmesi, etiketli moleküler motorlar ve nano ölçekli DNA moleküler "cetvelleri" gibi kırınım sınırından daha azıyla ayrılmış izole yapıları inceleyen bir dizi akıllı deneyle sonuçlandı. Prob tabanlı süper çözünürlüğün desteklenmesinde önemli bir teknolojik gelişme, tek foton duyarlılığına sahip EMCCD kamera sistemlerinin (bkz. Şekil 2) yaygın olarak bulunması ve kullanım kolaylığıdır.
Denklem (3)'te açıklandığı gibi, tek moleküllü süper çözünürlüklü görüntülemede moleküler lokalizasyon için yüksek hassasiyetli sonuçların anahtarı, arka plan gürültüsünü en aza indirmek ve floresan probdan foton çıkışını en üst düzeye çıkarmaktır; bu, başarılmasından daha kolay açıklanan bir görevdir. En iyi senaryoda, florofor ağartmadan veya kapatılmadan önce arka planın yokluğunda 10.000 foton toplanabiliyorsa, lokalizasyon merkezi yaklaşık 1 ila 2 nanometre doğrulukla belirlenebilir. Buna karşılık, yalnızca 400 foton toplanırsa, yerelleştirme doğruluğu yaklaşık 20 nanometre veya daha kötü bir değere düşer. Süper çözünürlüklü numunelerdeki arka plan, doğal veya transfeksiyon reaktifi ile indüklenen otofloresansın yanı sıra karanlık duruma giren çevreleyen probların artık floresansından kaynaklanır. Bu nedenle, PALM gibi prob tabanlı tek molekül süper çözünürlüklü görüntüleme teknikleri için, flüoresan molekülleri, fotoaktivasyondan önce ve sonra flüoresans oranı olarak tanımlanan yüksek bir kontrast oranı (veya dinamik aralık) göstermelidir. Floresan proteinlerdeki ve sentetik floroforlardaki kontrast oranlarındaki değişkenlik, kontrollü aktivasyon yokluğunda spontan fotodönüşümlerindeki farklılıklardan kaynaklanmaktadır.
Şekil 3'te nokta-yayılma fonksiyonunu bir Gauss fonksiyonuna uydurarak tek moleküllerin yüksek hassasiyetle lokalize edilmesinde yer alan adımlar gösterilmektedir. Şekil 3(a)'da, bir geniş alan floresan mikroskobunun nokta yayılma fonksiyonu, hem iki (sol üst) hem de üç boyutlu diyagramlarda bir dijital kameradan alınan piksel dizisinin bir tel kafes temsili üzerine bindirilmiştir. Bir EMCCD ile görüntülendiği gibi tek bir floroforun pikselli nokta yayılma işlevi, Şekil 3(b)'nin sol üst köşesinde gösterilir ve her pikselin yoğunluğunun merkezde renk eşlemesi ile üç boyutlu bir Gauss işleviyle modellenir. Şekil 3(b)'nin kısmı. Yoğunlukların bir kontur haritası Şekil 3(c)'de sunulmaktadır. Kırınım sınırından daha kısa bir ayırma mesafesine sahip floroforlar tarafından emisyon nedeniyle iki kontur haritasının üst üste geldiği durumlarda, her bir floroforun ağırlık merkezi, bir floroforun nokta yayılma fonksiyonunu diğerinden çıkararak (karanlık bir ortama girdikten sonra) ayrı ayrı lokalize edilebilir. PALM görüntüleri oluşturmak için zamansal haritalama stratejisi nedeniyle durum veya ışıkla ağartılmış).
Biyolojik sistemlerde floresan mikroskobu ile gözlemlenen yapıların ve organellerin çoğu, aynı kırınım sınırlı hacmi paylaşan birden fazla molekül ile çok yoğun bir şekilde floroforlarla doldurulur. Bu gibi durumlarda, ortaya çıkan flüoresans görüntülerinin, bulanık kırınımla sınırlı noktaların oldukça örtüşen bir dağılımı olarak görünmesi nedeniyle, tek moleküllü lokalizasyon neredeyse imkansızdır. Bu çıkmazın etrafındaki ve PALM'yi çevreleyen kavramın merkezinde yer alan mekanizma, moleküllerin seyrek alt kümelerini sırayla lokalize etmektir. Bu kavram ilk olarak Eric Betzig ve Harald Hess tarafından PALM'nin tanıtılmasından on yıl önce, yoğun bir şekilde dağılmış ışıldayan merkezlerin (farklı spektrumlara sahip) ince bir şekilde bindirilmiş dalga boyu ile görüntüleme yoluyla bir kuantum kuyusunda çözülmesiyle gösterildi. Sonuç olarak, bir uzaysal çözünürlük hacmi içinde hapsedilmiş birçok merkez olmasına rağmen, bunlar başka bir boyut olan dalga boyu boyunca ayrıldıklarında çözülebilir hale geldiler.
Betzig ve Hess'in mikroskopi deneyinin genelleştirilmesi, eğer bir moleküller topluluğundan gelen floresan tepkisi daha yüksek boyutlu bir uzayda yayılabilirse, o zaman kaynakları tek tek görüntülemek, merkezlerinin her birini lokalize etmek ve daha sonra mümkün olacaktır. süper çözünürlüklü bir görüntü oluşturmak için merkez koordinatlarını toplayın. Konsept, PALM ve STORM'un tanıtılmasından önce çeşitli araştırmalarda başarıyla uygulandı. Lazer spektroskopisi kullanılarak, üst üste binen organik floroforların spektrumları (ve lokalizasyonu), kriyojenik sıcaklıklarda da olsa başarıyla ayrıldı. Daha sonra, metodoloji, sıralı fotoağartma yoluyla veya floresan probların sabit bir bağlanma bölgesine stokastik olarak alınması yoluyla tek moleküllü lokalizasyona genişletildi. Ek olarak, kuantum noktalarının stokastik yanıp sönmesinin analizi yoluyla tek moleküllü lokalizasyon gösterilmiştir.
Sonda tabanlı süper çözünürlüklü mikroskopi, binlerce seyrek alt küme üretmek için sırayla açılabilen fotoaktive edilebilir floresan etiketlerin (hem floresan proteinler hem de sentetik floroforlar) keşfiyle bir gerçeklik haline geldi. Bu metodolojinin çalışma prensibi, floresan etiketlerin büyük çoğunluğunu aktif olmayan durumda ve numune floresansına katkıda bulunmadan başlamaktır. Küçük bir kısım (yüzde 1'den az) daha sonra, birkaç molekülde floresan ışık saçmasını sağlayan kimyasal bir modifikasyonu indüklemek için ultraviyoleye yakın ışıkla (bazı durumlarda diğer spektral bölgeler yararlıdır) aydınlatma ile aktive edilir.Bu seyrek alt küme daha sonra nanometre düzeyinde hassasiyete sahip koordinatlar oluşturmak için görüntülenir ve yerelleştirilir (bkz. Şekil 3). Kayıtlı etiketler daha sonra fotoağartma ile kaldırılır, böylece yeni bir seyrek alt küme aktif duruma aktarılabilir ve yeni bir moleküler koordinat kümesi toplamak için örneklenebilir. İşlem, görüntülenen bölge içinde bu tür milyonlarca moleküler koordinatın biriktiği noktaya kadar binlerce kez tekrarlanabilir. Tüm koordinat kümelerinden oluşturulan birleşik bir görüntü, araştırılmakta olan floresan etiketli yapının tek moleküllü süper çözünürlüklü bir görüntüsünü üretir. Moleküler koordinatların uzaysal konumlarını tanımlamak için gerçekte tek bir nokta ile temsil edilmediğine, daha ziyade görüntü haritasını oluşturmak için konumlarının konumsal belirsizliğine karşılık gelen bir Gauss yoğunluk dağılımının kullanıldığına dikkat edin.
Başa dön ^ Moleküler Lokalizasyon Teknikleri
Kırınım sınırlı odak noktası başına birden fazla molekülü tanımlayan bir dizi moleküler lokalizasyon tekniği tarif edilmiştir. Yukarıda tartışıldığı gibi, bu alandaki ilk başarılı deneylerden biri, bir kuantum kuyusunda yoğun olarak dağılmış lüminesan türler üzerinde spektral gruplama kullanılarak gerçekleştirildi. Benzer bir teknik, yanal ve eksenel boyutlarda sırasıyla yaklaşık 40 ve 100 nanometrelik lokalizasyon hassasiyetleri elde etmek için bir para-terfenil kristaline gömülü pentasen moleküllerine uygulandı. Başka bir yaklaşım, aynı kırınım sınırlı bölge içinde benzer dalga boylarına sahip floresan iki farklı molekülü lokalize etmek için karbosiyanin boyası Cy5 ve rodamin türevi JF9'daki farklı floresan ömürlerini inceledi. Benzer şekilde, fotoağartma oranlarındaki varyasyonlar, tümü ağartılana kadar molekül alanlarını sırayla görüntülemek ve lokalize etmek için kullanıldı. Bu deneyde, en fotostabil molekül ile başlatılan sentroid tayini, o molekülü lokalize etti ve aynı odak noktasında 10 nanometre hassasiyetle beş moleküle kadar lokalize etmek için işlemi tekrarladı.
Yüksek hassasiyetli tek molekül lokalizasyonuna yönelik birkaç başka yaklaşım da rapor edilmiştir, ancak hiçbiri yüksek düzeyde floresan fokal yapışmada bulunanlar gibi büyük topluluklara başarıyla uygulanmamıştır. Buna karşılık, PALM ve yakından ilişkili teknikler (FPALM gibi) bu kavramları, ışığa dönüştürülebilir veya ışıkla etkinleştirilebilir floresan proteinler kullanarak binlerce molekülü lokalize edecek şekilde genişletmiştir. STORM tekniği, birbirine yakın (2 nanometreden daha az) yerleştirildiğinde yaygın siyanin boyalarının foto-anahtarlama fenomenine dayalı olarak tanıtıldı. Bu önemli gelişmeler, araştırmacıların molekülleri kontrollü bir şekilde tekrar tekrar açıp kapatmasını ve böylece tespit edilen moleküllerin gerekli düşük yoğunluğunu korumasını sağladı. PALM, FPALM ve STORM'un yeni tanıtılan tek moleküllü süperçözünürlük teknikleri çok daha fazla sayıda moleküle moleküler lokalizasyonu ilerlettiğinden, bu yaklaşımların hücre biyolojisi üzerinde devrim niteliğinde bir etkisi olmuştur ve benzer ilkelere dayanan birçok başka yeni gelişmeye yol açmalıdır.
Belirtildiği gibi, prob tabanlı süper çözünürlüklü görüntüleme kavramının merkezinde, bir floresan molekülünü, parlak ve karanlık bir durum (foto anahtarlama) veya bir floresan emisyon spektrumu ile diğeri (foto dönüştürme) arasında seçici olarak değiştirme yeteneği vardır. Bu tür geçiş, tersine çevrilebilir doyurulabilir/değiştirilebilir optik floresan geçişi (RESOLFT) olarak adlandırılan bir kavramda ayrıntılı olarak açıklanan moleküler bir anahtarın temelidir. RESOLFT konsepti, cis ve trans durumları ve floroforlarda diğer çeşitli optik olarak iki durumlu geçişler arasında anahtarlamalı izomerizasyon içerir. STED ve GSD dahil olmak üzere neredeyse tüm rapor edilen süperçözünürlük teknikleri, bir tür fotoğraf değiştirme veya fotoğraf dönüştürme içerir. Örneğin, bağımsız çalışan edinimli (PALMIRA) PALM olarak adlandırılan bir yöntem, ışıkla değiştirilebilir floresan proteinleri kullanırken, doğrudan STORM (dSTORM), tersinir ışıkla ağartma mikroskobu (RPM), bireysel molekül dönüşüyle temel durum tükenmesi (GSDIM) dahil olmak üzere diğer birçok teknik ) ve çift sarmal nokta yayma işlevi (DH-PSF) mikroskopisi, aşağıda tartışılacağı gibi, bir veya daha fazla geleneksel sentetik boya kullanılarak karanlık durumlara foto anahtarlamayı kullanır.
Şekil 4'te gösterilen, temel durum tükenmesi ve tek molekül geri dönüşü kavramını göstermek için orta lazer gücü altında bir ksanten halka sistemi içeren birkaç floroforun foto-anahtarlanmasıdır. Şekil 4(a)'da sunulan grafik, uyarma lazeri yoğunluğu arttıkça üçlü durum söndürme ajanı (beta-merkaptoetanol) varlığında rodamin 6G ve ATTO 532 probları için floresan yoğunluğundaki hızlı düşüşü gösterir. Floresan yoğunluğunun, santimetre kare başına yaklaşık 2 kilovatlık nispeten düşük lazer gücünde hızla düşmeye başladığını ve ardından güç aralığının geri kalanında çok daha yavaş düştüğünü (neredeyse bir platoya ulaştığını) unutmayın. Şekil 4(b), lamellerde büyütülen HeLa hücrelerinde fare anti-alfa-tubulinini hedefleyen keçi ikincil antikorlarına konjuge edilmiş ATTO 532 moleküllerinden tek moleküllü floresan emisyonunun hızlandırılmış bir izini gösterir. Sabitlenmiş ve boyanmış hücreler, milimolar miktarlarda beta-merkaptoetanol varlığında polivinil alkole daldırıldı. Daha yüksek lazer güçlerinde, benzer sentetik boyaların (Alexa Fluor 488 ve 568 gibi) uzun ömürlü karanlık bir duruma gireceğini ve bu durumdan stokastik olarak tiyol veya yüksek viskoziteli alkol eklenmeden sadece basit salin solüsyonları kullanarak geri döneceğine dikkat edin. İkinci teknik, yukarıda bahsedildiği gibi, tersinir ışıkla ağartma mikroskobu olarak anılır, ancak foto-anahtarlama muhtemelen fenomeni tanımlamak için daha uygun bir terim olacaktır.
Başa dön ^ Yüksek Yoğunluklu Moleküler Lokalizasyon
Tek moleküllü lokalizasyon süper çözünürlüklü mikroskopisinde büyük veri setlerinin toplanması, uzun zaman ölçekleri gerektirdiğinden (özellikle geleneksel geniş alan ve konfokal görüntüleme ile karşılaştırıldığında), PALM deneylerinin büyük kısmı sabit hücre veya doku preparatları üzerinde gerçekleştirilir. Paraformaldehit ile sabitlenmiş yapışkan doku kültürü hücrelerinin herhangi bir yapısal değişikliğe uğraması olası değildir, bu nedenle görüntü alma süresi kritik bir faktör değildir ve normalde araştırmacının sabrıyla birleştiğinde numunedeki floresan moleküllerin sayısı tarafından belirlenir. Bu kategorideki numuneler, filamentli aktin ve mikrotübül ağları dahil olmak üzere nanometre çözünürlükte hücre altı yapılar içindeki proteinlerin moleküler organizasyonunu ortaya çıkaran çok sayıda görüntü üretmiştir. Mikrotübüller, yaklaşık 25 nanometre çapında ve birbirinden farklı mesafelerde bulunan farklı, iyi karakterize edilmiş filamentler olduğundan, bu yapılar, çözünürlük testleri ve mikroskop konfigürasyon çalışmaları için mükemmel adaylardır. Doğrulama için diğer potansiyel olarak yararlı örnekler, fokal yapışma bileşenleri ve plazma zarı veya mitokondri içine gömülü proteinlerdir.
Tüm tek moleküllü lokalizasyon teknikleriyle ilişkili benzersiz bir özellik, araştırmacının nihai çıktıda görüntülenen molekül kümesini tanımlama özgürlüğüne sahip olmasıdır. Örneğin, bazı durumlarda sadece 10 nanometreden daha iyi belirsizlikle lokalize olan moleküller gösterilirken, diğer durumlarda aynı veri setine dayanan 20 nanometre veya daha az hassasiyetle lokalize olan moleküller dahil edilebilir. Bu çok yönlülük, tek moleküllü PALM görüntülemede, yüksek moleküler kesinlik ile spesifik problar ve numune hazırlıkları ile elde edilebilen çözünürlük arasında ayrım yapan kritik bir noktayı gündeme getiriyor. Bir numune içindeki moleküllerin konumu yüksek hassasiyetle (en iyi durumda birkaç nanometreye kadar) belirlenebilse de, yine de farklı yapısal elemanların belirtilen çözünürlüğü, çözünürlük birimi başına yaklaşık iki veri noktası olan Nyquist örnekleme kriterine uymalıdır. . Bu nedenle, Şekil 5'te genç bir çocuğun geleneksel bir fotoğrafı için gösterildiği gibi, lokalize moleküllerin yoğunluğu, çözünürlük iddiaları için önemli bir faktör haline gelir.
Tek moleküllü lokalizasyonda lokalizasyon kesinliği, çözünürlük ve moleküler yoğunluk kavramı Şekil 5'te soyut olarak gösterilmektedir. Örnekleme amacıyla, (a)'dan (c)'ye kadar olan panellerdeki nokta boyutları, panel (d)'de sunulan nihai görüntüyü elde etmek için gerekli olandan çok daha büyük gösterilmiştir. Çocuğun Şekil 5(a)'daki görüntüsü birçok lokalize noktayı gösterir, ancak nispeten düşük yoğunluk görüntünün tanınmasını sağlamaz. Şekil 5(b) ve 5(c)'deki görüntülere daha fazla nokta eklendikçe, çocuk daha tanınabilir hale gelir, ancak yüzüyle ilişkili ince özellikleri ayırt etmek (çözmek) Şekilde gösterildiği gibi daha yüksek yoğunlukta veri noktaları gerektirir. 5(d). Unutulmaması gereken önemli kavram, tek moleküllü yerelleştirme teknikleri kullanılarak tam olarak yerelleştirilmiş veri noktaları içeren bir görüntünün oluşturulabilmesidir, ancak bu noktaların yoğunluğu, görüntüdeki özellikleri çözme yeteneğini doğrudan etkiler.
PALM ve diğer tek moleküllü lokalizasyon yöntemlerinde, zayıf lokalizasyona sahip veri noktalarını seçici olarak hariç tutarak en yüksek hassasiyette (bir veya iki nanometre) lokalize edilmiş moleküllerle görüntüler oluşturulabilir, ancak bu başarı moleküler yoğunluğun (ve bu nedenle, çözünürlük) son görüntüde. Bu durum, moleküler kesinliğe keyfi olarak dayatılan bir sınırlamadan ziyade, basitçe numunenin tipine ve ilgilenilen hedef moleküle bağlı olarak ortaya çıkabilir. Bu nedenle, hedef molekülün numunede seyrek olarak temsil edilmesi gerçeğinden dolayı düşük moleküler yoğunluk ortaya çıkabilir. Örnek olarak, bir floresan proteinin ortalama çapı yaklaşık 2.5 nanometre olarak alınırsa ve protein iki boyutlu bir düzlemle (örneğin bir zarla) sınırlı bir organel içine gömülürse, floresan protein moleküllerinin maksimum yoğunluğu şöyle olur: mikrometre kare başına yaklaşık 20.000. Ayrıca, bu kadar yüksek bir yoğunluğa ulaşmak için bu hesaplama, bu düzlemde yalnızca floresan protein moleküllerinin bulunduğunu varsayar.
Biyolojik örneklerde moleküler yoğunlukların aşırı derecede yüksek olduğu, yukarıda tartışılan paketlenmiş zar gibi nadir durumlar ortaya çıkabilse de, genellikle hücrenin başka yerlerinde olası fizyolojik bir durum değildir. Floresan protein füzyonları, bir organel zarındaki moleküllerin yüzde birini oluşturuyorsa, bu, mikrometre kare başına yaklaşık 2000 moleküle veya her 40 ila 50 nanometrede yaklaşık iki moleküle yol açar. Bu seviyenin örnekleme yoğunlukları, elektron mikroskobu ile gözlemlenen elde edilebilir moleküler kesinlik ile karşılaştırıldığında soluktur ve yapısal özelliklerle ilgili herhangi bir çözünürlük iddiasını sınırlar. Ne olursa olsun, bir organel zarında santimetre kare başına 2000 molekülü gözlemleyen bir PALM deneyi, çözünürlük sınırlamalarına rağmen önemli miktarda bilgi sunar. Aslında, bu yoğunluktaki görüntüler, genellikle bir görüntüleme deneyinin amacı olan numune içindeki nispi moleküler dağılımları ortaya çıkarabilir. Bu veriler örneğin diğer bilinen özellikleriyle (bağıntılı elektron mikroskobu kullanmak gibi) bağlam içine yerleştirilirse, çok daha fazla bilgi elde etme potansiyeli artar.
Başa dön ^ Tek Moleküllü Süper Çözünürlüklü Mikroskopi için Problar
PALM ve ilgili tekniklerde hücre altı hedefleri etiketlemek için en iyi adaylar olarak öne çıkan birkaç florofor sınıfı ortaya çıkmıştır. Bunlar, genetik olarak kodlanmış floresan protein füzyonlarını, sentetik boyaları, kuantum noktalarını ve genetik olarak kodlanmış bir hedef peptidi membran geçirgen olan ayrı bir sentetik bileşenle (FAsH/ReAsH sistemi gibi) birleştiren hibrit sistemleri içerir. Her bir spesifik floresan prob sınıfının kendine özgü güçlü ve zayıf yönleri vardır, ancak tek moleküllü süper çözünürlüklü mikroskopideki herhangi bir uygulama için ideal bir probun tercih edilen tüm özelliklerini birleştiren tek bir sınıf veya bireysel florofor henüz geliştirilmemiştir. Süper çözünürlüklü problar geliştirmek için temel husus, seçilen alt popülasyonların tespiti için spektral özelliklerini değiştirmenin bir yolu olarak, tanımlanmış bir dalga boyu bandının ışığı ile fotoaktifleştirilebilmeleri, foto-anahtarlanabilmeleri veya foto-dönüştürülebilmeleri gerektiğidir.
Tek moleküllü süper çözünürlüklü problar için en çok arzu edilen özellikler arasında, çok yüksek parlaklık ve kontrast seviyeleri vardır; bunlar, molekül başına ışıkla ağartmadan veya karanlık, floresan olmayan bir duruma dönmeden önce algılanabilecek foton sayısını en üst düzeye çıkarmak için gereklidir. Parlaklık, molar yok olma katsayısının ( ε abs ) ve floresan kuantum veriminin ( φ ) çarpımı ile belirlenir. Bu nedenle, en iyi problar yüksek sönme katsayılarına ve kuantum verimlerine sahiptir ve arka plan üzerinde mükemmel kontrast sağlar. Genel olarak, Cy5, ATTO 650 ve Alexa Fluor 488 gibi popüler sentetik boyaların parlaklık seviyeleri, 100.000 ortalama sönme katsayıları ve 0.90'ı aşan kuantum verimleri nedeniyle çok yüksektir. Benzer şekilde, kuantum noktaları da eşit derecede yüksek parlaklık seviyelerine sahiptir. Buna karşılık, optik vurgulayıcı floresan proteinlerin optik özellikleri, yaklaşık 15.000 ila 85.000 arasında değişen sönme katsayıları ve 0.05 ila 0.80 arasındaki kuantum verimleri ile çok daha az optimaldir. Açıkça, süper çözünürlüklü görüntüleme için daha kullanışlı floresan proteinleri genetik olarak tasarlamaya önemli bir ihtiyaç vardır.
Yüksek parlaklık seviyelerine sahip olmanın yanı sıra, süper çözünürlüklü mikroskopi için en iyi problar, yeterince iyi ayrılmış ve termal olarak kararlı olan aktif ve aktif olmayan türler için spektral profiller göstermelidir, böylece kendiliğinden dönüşüm enerjileri, ışık kontrollü aktivasyon enerjisine kıyasla çok düşüktür. İdeal olarak, bu problar ayrıca yüksek anahtarlama güvenilirliği, düşük yorulma oranları (aslında, hayatta kalabilen anahtarlama döngülerinin sayısı) ve kolaylıkla kontrol edilebilen anahtarlama kinetiği sergilemelidir. Işıkla ağartma veya karanlık bir duruma geçme açısından en iyi problar, okuma için yalnızca küçük bir molekül popülasyonunun etkinleştirilmesini (floresan olmasını) ve bu etkinleştirilmiş moleküllerin kamera sisteminin çözünürlük sınırlarından daha büyük bir mesafe ile ayrılır. Ayrıca, fotoaktive edilmiş her molekül, yanal konum koordinatlarını doğru bir şekilde belirlemek için aktive edilmiş durumdayken yeterli miktarda foton yaymalıdır.
Gerekli floresan emisyonunu ve diğer fotofiziksel özellikleri göstermenin yanı sıra, PALM süper çözünürlüklü probları aynı zamanda amaçlanan hedeflerine yüksek hassasiyetle lokalize edebilmeli ve mümkün olan en düşük arka plan gürültü seviyelerini gösterebilmelidir. Floresan proteinler, hibrit sistemler ve oldukça spesifik sentetik floroforlar (MitoTrackers gibi) seçici olarak protein gruplarını veya organellerini hedefleyebilir, ancak sentetik boyaların ve kuantum noktalarının çoğu, hassas etiketleme için önce bir taşıyıcı moleküle konjuge edilmelidir. Birçok durumda, özellikle küçük sentetik boya molekülleri veya kuantum noktaları büyük antikorlara konjuge edildiğinde, dahil olan gerçek florofor birimlerinin sayısı gibi, floresan probun hedefe tam yakınlığı sorgulanabilir. Ayrıca, çevresel dalgalanmalar veya moleküller arası etkileşimler tarafından indüklenen fotofiziksel özelliklerdeki (floresan kuantum verimi gibi) değişiklikler de veri analizini karmaşıklaştırabilir. Son olarak, lokalizasyon analizinin sabit veya canlı hücreler üzerinde gerçekleştirilip gerçekleştirilmediğine bakılmaksızın, fiksatiflerden ve transfeksiyon reaktiflerinden kaynaklanan otofloresan sıklıkla aşırı yüksek arka plan sinyali üretebilir, böylece lokalizasyon doğruluğunu azaltır.
Süper Çözünürlük Mikroskobu için Seçilmiş Floresan Probların Özellikleri


Tablo 1
Süper çözünürlüklü mikroskopi için en kullanışlı floresan proteinlerin ve sentetik boyaların özelliklerinin bir derlemesi Tablo 1'de sunulmuştur. Her bir floroforun ortak adı ve/veya kısaltması, tepe eksitasyon (Ex) ve emisyon (Em) dalga boyları, molar sönme ile birlikte. katsayısı ( EC ), kuantum verimi ( QY ), bağıl parlaklık, molekül başına yayılan foton sayısı ( N Foton ) ve fizyolojik olarak ilgili kuaterner yapı listelenir. C-Rhodamine ve C-Fluorescein kafesli türevleri ifade eder. Hesaplanan parlaklık değerleri, molar yok olma katsayısı ve kuantum veriminin çarpımından, EGFP değerine bölünerek elde edildi. ND işareti, değerlerin belirlenmediğini gösterirken NA, değerin listelenen prob için geçerli olmadığı anlamına gelir. Bu liste, bilimsel ve ticari literatür kaynaklarından oluşturulmuştur ve kapsamlı olması amaçlanmamıştır. Listelenen uyarma ve emisyon tepe değerleri, bazı durumlarda geniş spektral profiller nedeniyle yayınlanan raporlarda değişiklik gösterebilir. Gerçek floresan mikroskobu araştırmalarında, belirli bir floroforun deneysel parlaklığı (göreceli olarak) bu tabloda verilen parlaklıktan farklı olabilir. Bu farklılıkların birçok olası nedeni arasında, mikroskop optiklerinin iletimi veya yansımasındaki dalga boyuna bağlı varyasyonlar ve kameranın verimliliği yer alır.
Floresan proteinlerin bir alt kümesinin, mükemmel hedefleme özgüllükleri ile birleştiğinde, belirli bir dalga boyundaki ışığa maruz kaldıklarında spektral özelliklerini değiştirmeye yönelik içsel yeteneği, süper çözünürlüklü görüntülemede yaygın olarak kullanılmıştır (bkz. Tablo 1'de listelenen problar).Floresan proteinlerin, farklı salımsal ve salımsal olmayan durumların yanı sıra açık ve kapalı yanıp sönme davranışı dahil olmak üzere çeşitli ışık kaynaklı fotoanahtarlama özelliklerine maruz kaldıkları bilinmesine rağmen, en kullanışlı özellikler fotoaktivasyon, fotodönüşüm ve fotoanahtarlamadır. topluca optik vurgulama olarak adlandırılabilen özellikler (aşağıda açıklandığı gibi). Işıkla etkinleştirilebilir floresan proteinler, morötesi veya mor ışıkla aydınlatma üzerine karanlık bir durumdan parlak bir floresan durumuna etkinleştirilebilirken, ışığa dönüştürülebilir floresan proteinler, bir floresan emisyon bant genişliğinden diğerine optik olarak dönüştürülebilir. Süper çözünürlüklü görüntüleme için ışıkla etkinleştirilebilir floresan proteinlerin araç kutusundaki en kullanışlı üyeler arasında PA-GFP ve PA-mCherry1 bulunur. PALM ve ilgili tekniklerde fayda bulan foto-dönüştürülebilir floresan proteinler, tandem dimer Eos (tdEos), mEos2, Dronpa, rsCherry (ve ters türev) ve PS-CFP2'dir.
Potansiyel olarak en kullanışlı floresan protein optik vurgulayıcı sınıfının üyeleri, parlak floresan ve karanlık durum arasında foto geçiş yapabilenler, parlak durumdaki düşük foton çıkışı nedeniyle tek moleküllü süper çözünürlük araştırmalarında özellikle yararlı olmamıştır. Dronpa, daha sonra tartışılacağı gibi, çift renkli PALM görüntülemede kullanıldı, ancak molekül başına foton çıktısı açısından foto-aktive edilebilir ve foto-dönüştürülebilir floresan proteinlerin çoğu ile karşılaştırıldığında marjinaldir. Bununla birlikte, Dronpa çok yüksek foto-anahtarlama kontrastına sahiptir ve canlı hücre görüntüleme için avantajlı olabilen uzun bir süre boyunca floresan yayar (örneğin, aşağıda açıklandığı gibi tek parçacık izleme kullanılarak). Floresan proteinlerin süper çözünürlüklü görüntüleme için bir tür optik vurgulama davranışı sergilemesi gerekliliğinin yanı sıra, yetersiz hedefleme ve işlev bozukluğu gibi yapaylık olmadan füzyonu ifade etmek için yeterli parlaklığa, kromofor olgunlaşma oranlarına ve monomerik karaktere sahip olmaları gerekir. Ek olarak, floresan proteinlerdeki oligomerizasyon, her lokalize prob molekülü başına birden fazla kromofor olduğu için stokastik süper çözünürlüklü mikroskopide bir problem sunabilir.
Hızla artan sayıda sentetik organik florofor, geniş alan ve eş odaklı floresan mikroskobu için numunelerin hazırlanmasında birkaç on yıl boyunca kullanılan geleneksel probların birçoğu dahil olmak üzere, tek moleküllü süper çözünürlüklü görüntüleme için mükemmel adaylar olarak ortaya çıkmaktadır (bkz. Tablo 1). Başlangıçta fotostabil olduğu düşünülen birçok bileşiğin, alifatik tiyollerin mevcudiyetinde düşük oksijen koşulları altında karanlık durumlara girdiği gösterilmiştir. Bu nedenle, tersine çevrilebilir fotoanahtarlama, muhtemelen başlangıçta şüphelenilenden daha yaygın bir fenomendir ve bu da daha fazla sayıda potansiyel prob adayına kapı açar. Ek olarak, geri dönüşü olmayan fotoaktivasyon, floroforların ultraviyole ışıkla ışınlama yoluyla uzaklaştırılan koruyucu bir reaktif kısım ile "kafeslenmesi" ile elde edilebilir. Ne yazık ki, bugüne kadar bir emisyon dalga boyu bandından diğerine foto-dönüştürülebilen organik bileşikler veya kuantum noktaları hakkında herhangi bir rapor bulunmamaktadır.
Şekil 6'da, tek moleküllü süper çözünürlüklü görüntülemede potansiyel olarak faydalı olan çeşitli floresan probların şerit yapıları, moleküler modelleri ve/veya karikatür çizimleri gösterilmektedir. Sentetik karbosiyanin boyası Cy5 (Şekil 6(a)) sarı bir kuantum noktasından (Şekil 6(c)) veya bir floresan proteinin tipik beta varil kutu şeklindeki polipeptit mimarisinden (yeşil şerit yapısı) önemli ölçüde daha küçüktür Şekil 6( NS)). Benzer şekilde, bu probların tümü, 12 ila 15 nanometreye yayılabilen bir birincil veya ikincil IgG antikoruna kıyasla boyut olarak küçültülür (kırmızı şerit yapısı Şekil 6(b)). Kuantum noktaları, spesifik hücre altı bölgeleri hedeflemek için antikor fragmanları, streptavidin, phalloidin veya diğer bazı fonksiyonel kısım ile tedavi edilmelidir. Çoğu durumda, bir veya daha fazla ikincil antikora konjuge edilmiş bir kuantum noktasının birleşik boyutu, monomerik bir floresan proteinin boyutunu önemli ölçüde aşan 25 ila 30 nanometre arasında değişebilir. En küçük floresan problar sentetik boyalardır (Şekil 6(a)), ancak bunlar nispeten zayıf hedefleme verimliliğine sahiptir ve genellikle büyük arka plan sinyali üretir.
Süper çözünürlüklü görüntüleme için floresan proteinlere göre sentetik floroforlar ve kuantum noktaları kullanmanın birincil avantajı, yüksek içsel parlaklıkları, mükemmel fotostabiliteleri, iyi kontrastları ve daha fazla yorulma direncidir. Örneğin, tdEos, Cy3 ve Cy5'in foto-değiştirilebilir florofor kombinasyonu için tipik olarak gözlemlenen 6000'den fazla fotonun aksine molekül başına yaklaşık 750 foton verir. Ayrıca, karbosiyanin boyaları, fotoağartma işleminden önce 200'den fazla anahtarlama döngüsünden geçebilir. Kuantum noktaları ve sentetik floroforları kullanmanın birincil dezavantajı, floresan proteinlerle karşılaştırıldığında belirli yerleri ve yüksek arka plan sinyalini hedeflemedeki zorluktur. Bu sınıftaki floroforlar için en güvenilir hedefleme stratejisi, birkaç yeni sentetik boyanın bağımsız olarak belirli organellerde lokalize olduğu gösterilmiş olmasına rağmen, birincil veya ikincil bir antikora konjugasyondur.
Süper çözünürlüklü görüntüleme için hücre içi yapıları etiketlemek için antikorların ve immünofloresan tekniklerinin kullanılmasının dezavantajı, proteinlerin zarlara nüfuz edemeyecek kadar büyük olmaları ve bu nedenle hedef plazma zarının dış bölgesinde görüntülenmedikçe yalnızca sabit ve geçirgenleştirilmiş hücrelerde yararlı olmalarıdır. Antikorlarla etiketleme de verimlilik açısından nispeten düşüktür ve etiket ile hedef arasındaki lokalizasyon belirsizliğine 10 ila 20 nanometre ekler. Ek olarak, kuantum noktalarının antikorlara eşlenikleri, Alexa Fluors ve karbosiyaninler gibi sentetik boyalar kullanan benzer eşleniklerle aynı düzeyde performans göstermez. Bununla birlikte, perspektif olarak, PALM ve ilgili teknikler için sentetik probları hedeflemek üzere antikorların kullanılması, canlı hücre görüntülemede daha faydalı olan floresan proteinlerden çok daha yüksek bir sinyal seviyesi sağlar. Ne yazık ki, popüler sentetik boyalarla foto-anahtarlama üretmek için gerekli olan oksijen süpürücüler ve tiyoller, canlı hücrelerle uyumlu değildir, bu nedenle bir geçici çözüm geliştirilinceye kadar, canlı hücre süper çözünürlüklü mikroskopisi için floresan proteinler tercih edilen problar olacaktır.
Kuantum noktaları, sınırlı eksiton emisyonu nedeniyle floresan özellikler sergileyen bir çinko sülfür (ZnS) kabuğu ile çevrili bir kadmiyum selenit (CdSe) çekirdekten oluşan inorganik yarı iletken nanokristallerdir. Biyolojik uygulamalar için kuantum noktalarına bir pasivasyon katmanı ve hidrofilik kaplama uygulanmalı ve ayrıca hedefleme için streptavidin veya antikorlara konjuge edilmelidir. Kuantum noktalarının floresan emisyon profili oldukça simetriktir ve genellikle büyük bir kuantum verimi sergilerken, geniş absorpsiyon profilleri, alışılmadık derecede geniş bir dalga boyu aralığında uyarılmalarını sağlar. CdSe çekirdeğinin boyutu, mavi ve camgöbeği bölgelerinde yayılan daha küçük çekirdekler (yaklaşık 2 nanometreye kadar değişen) ve sarı ve kırmızı dalga boylarında yayılan daha büyük çekirdekler (5 ila 7 nanometre) ile emisyon spektral profilini belirler.
Genel olarak, kuantum noktalarının fotostabilitesi, sentetik flüoroforlar ve flüoresan proteinler de dahil olmak üzere bilinen tüm diğer flüoroforların fotostabilitesini önemli ölçüde aşar; bu, kuantum noktaları bir fotodeğiştirilebilir duruma dönüştürülemedikçe stokastik süper çözünürlüklü görüntüleme için bir sorun yaratır. Son zamanlarda, araştırmacılar, ZnSe kuantum noktalarının manganez dopinginin, harici aktivatörler veya söndürücüler (efektörler) gerektirmeden ışık kullanılarak yüksek verimlilikle tersine çevrilebilir bir şekilde foto-anahtarlanabilen bir tür oluşturmak için kullanılabileceğini gösterdi. Hedefleme, kuantum noktalarıyla ilgili bir sorun olmaya devam ediyor, ancak kuantum nokta kimyasındaki devam eden ilerlemeler, şüphesiz bu sınıfta yeni ve daha iyi problara yol açacaktır.
Süper çözünürlüklü görüntülemede fayda bulan sentetik tersine çevrilebilir foto-değiştirilebilir problar arasında rodamin türevleri, karbosiyanin boyaları (Cy2 ila Cy7), Alexa Fluors ve ATTO boyaları bulunur ve sürekli olarak yeni adaylar geliştirilir ve test edilir. Fotoğrafla değiştirilebilir siyanin boyaları, stokastik süper çözünürlüklü görüntülemede en yaygın kullanılan sentetik organik problardır. Yakın-kızılötesi boya Cy5, Cy5'in ikincil bir kromoforla (Cy3, Cy2 veya Alexa Fluor 405 gibi) birleştirilmesi fotoğraf anahtarlamayı önemli ölçüde kolaylaştırmasına rağmen, en fazla görevi gördü ve efektör olmadan kullanılabilir. Örnek bir uygulama olarak, Cy5'i Cy3 ile birleştirmek, Cy5'i kararlı bir karanlık duruma geçirmek için kırmızı bir lazerin (635 nanometre) kullanılmasını sağlarken 543 nanometre ışığa maruz kalma Cy5'i floresan türlerine geri dönüştürür. Floresan türlere geri dönüşüm oranı, ikincil efektörün (Cy3) yakınlığına bağlıdır.
Cy3 ve Cy5.5 veya Cy7 ve Alexa Fluor 647 ile Cy2 veya Cy3 gibi siyanin ve Alexa Fluor boyalarının ek kombinasyonları, süper çözünürlüklü görüntüleme için mevcut renk paletini büyük ölçüde genişleterek rapor edilmiştir. Ayrıca, Alexa Fluor ve ATTO boya ailelerinin çoğu dahil olmak üzere ticari olarak temin edilebilen çok sayıda sentetik maddenin, tiyol içeren indirgeyici ajanlar (β-merkaptoetilamin, ditiyotreitol veya Glutatyon) stabil bir floresan olmayan durum oluşturmak için. Bu nedenle, çok renkli görüntüleme için sentetik organik foto değiştiriciler üretme potansiyeli, anahtarlama mekanizması henüz belirlenmemiş olsa da, şu anda ışık kaynaklı modülasyona giren sınırlı FP paletini aşmaktadır. Şekil 7'de sunulanlar, süper çözünürlüklü görüntüleme için faydalı bulunan floroforların geniş çeşitliliğini gösteren birkaç sentetik probun yapılarıdır.
Fotoaktive edilebilir FP'lere (PA-GFP ve PA-mCherry) benzer şekilde, büyük bir kafesli sentetik kitaplığı, stokastik süper çözünürlüklü görüntüleme için özellikle yararlı olacaktır. Ne yazık ki, bugüne kadar yalnızca birkaç umut verici aday rapor edilmiştir: PALM görüntülemede PA-GFP'ye benzer bir şekilde hareket ettiği gösterilen floresein ve rodaminin kafesli versiyonları. Uygulamada, kafesli sentetikler, yüksek hassasiyetle lokalize edilebilen ve daha sonra ışıkla ağartılabilen mükemmel kontrast sergileyen bir floresan türü oluşturmak için ultraviyole ışıkla ışınlama kullanılarak koruyucu ester gruplarından serbest bırakılır. Çok çeşitli kafesli floroforlar ortaya çıkana kadar, bu sınıf süper çözünürlüklü görüntüleme uygulamalarında sınırlı kalacaktır.
Süper çözünürlüklü görüntülemenin geleceği, çok parlak ışıkla değiştirilebilir floroforların özgüllüğünün ve etiketleme verimliliğinin artırılmasına ve aynı anda hedefleme peptitlerinin boyutunun azaltılmasına dayanır. Sentetik floroforları genetik olarak kodlanmış hedeflerle birleştirmek için tasarlanmış geniş bir hibrit sistem yelpazesi, bir gün bu hedefe ulaşma yeteneğine sahip olabilir. Bu sistemlerin tümü, canlı hücrelerde ifade edilen ve floresan vermek için küçük bir sentetik molekülü işe alabilen bir peptit veya protein dizisini kullanır. Bu sınıftaki en gelişmiş aday, sistein kalıntılarına bağlanabilen mavi, yeşil veya kırmızı floroforları (sırasıyla CHoAsH, FlAsH ve ReAsH) toplamak için çeşitli genetik hedeflere kaynaşmış bir tetrasistein motifi kullanır. FP'lere özgüllük. Bu kombinasyonların en büyük dezavantajı, kontrastı azaltan bağlanmamış floroforun yüksek arka plan seviyelerinin üstesinden gelinememesidir. Bir dizi başka hibrit sistem adayı geliştirildi, ancak hiçbiri süper çözünürlüklü görüntülemede önemli bir kullanım görmedi.
Başa dön ^ İki Renkli Süper Çözünürlüklü Mikroskopi
İki renkli tek moleküllü süper çözünürlüklü görüntüleme gerçekleştirmek, iyi ayrılmış ve ideal durumda, farklı dalga boylarında aydınlatma ile foto-anahtarlanmış veya fotoaktive edilmiş emisyon spektrumlu bir çift floresan prob gerektirir. Halihazırda, çift renkli görüntüleme için potansiyel olarak yararlı olan flüoresan protein paleti, emisyon spektral örtüşme çakışmaları, stratejik spektral profillere (kırmızı emisyon) sahip problarda düşük foton çıkışı ve bu sınıftaki çoğu probun aktif hale getirilmesi gerçeğiyle sınırlıdır. aynı dalga boyu bölgesindeki ışık (ultraviyole veya mor). 405'ten daha fazla dalga boyuna kadar değişen lazer çizgileriyle etkinleştirilebilen karbosiyaninler, Alexa Fluors ve ATTO boyaları dahil olmak üzere büyüyen sentetik problar sınıfında eşzamanlı veya sıralı görüntüleme için iki veya daha fazla floroforu bir araya getirmek için önemli ölçüde daha fazla potansiyel vardır. 647 nanometreden fazla. PALM ve ilgili tekniklerde ikili veya üçlü renkli görüntülemenin anahtarı, her aktifleştirilmiş probun emisyonunu tanımlama ve geçici olarak ayırma yeteneği olduğundan, sentetik boyaların probları ayırt etmek için emisyon, uyarma veya aktivasyon dalga boylarını kullanma konusunda sağladığı çok yönlülük, güçlü bir varlık.
Çok renkli görüntüleme için floresan proteinlerin uygulanması, şu anda mevcut olan kırmızı yayan probların çoğunun, yeşil yayan probların aktivasyon sonrası emisyonu ile örtüşen aktivasyon öncesi floresan emisyonuna sahip olması nedeniyle daha zor hale getirilir. Örneğin, Dronpa ve tdEos'un birbirine bağlanması, Dronpa'nın yeşil spektral profilinin tdEos'un önceden dönüştürülmüş profiliyle önemli ölçüde örtüşmesi gerçeğiyle engellenir. Bununla birlikte, araştırmacılar, yoğun 488 nanometre ışık kullanarak Dronpa moleküllerini devre dışı bırakmadan önce tüm moleküller tespit edilene, lokalize edilene ve ışıkla ağartılana kadar tdEos'u fotoaktive ederek ve görüntüleyerek bu floresan protein çiftini iki renkli PALM'de görüntülemeyi başardılar. Dronpa molekülleri daha sonra yeniden etkinleştirildi, lokalize edildi ve son iki renkli bir görüntü oluşturmak için tdEos görüntüleri ile birleştirildi. Ancak genel uygulamada, bir floresan probu diğerini görüntülemeden önce tüketmek, aynı bölgenin birden fazla zaman noktasında iki renkli görüntülenmesini sağlamaz ve dinamik olayları kaydetme potansiyeli çok azdır.
Şekil 8'de, çift renkli PALM ile görüntülenen bir insan fibroblast hücresindeki (HFF-1 çizgisi) hücre iskeleti aktin ve fokal yapışma proteini paxillinin nanoyapısal organizasyonu gösterilmektedir. Şekil 8(a), floresan protein Dronpa'ya (sözde renkli yeşil) kaynaşmış aktin ve optik vurgulayıcı tdEos'a (sözde renkli kırmızı) kaynaşmış aktin'in, yüksek büyütmede bir odak yapışmasında göründükleri gibi bileşik (çift renkli üst üste bindirme) bir görüntüsüdür. . Şekil 8(a)'daki beyaz kutu, aktin ve paxillin (beyaz ok uçları) arasında gözlemlenen çok az doğrudan örtüşme olduğunu ortaya çıkarmak için Şekil 8(b)'de büyütülmüştür, ancak aktin demetleri birkaç fibriler paxillin yapışıklığı etrafında yoğun bir şekilde kümelenmiştir (beyaz oklar) . Geniş alan TIRF görüntülemede, aktin ve paxillin, süper çözünürlüklü mikroskopi tarafından sağlanan bilgilerin aksine, fokal adezyonlarda birlikte lokalize görünüyor.
İki renkli PALM deneylerini yürütmek için üstün bir yaklaşım, spektral örtüşme çok az olan veya hiç olmayan yeşil ve kırmızı yayan floresan proteinleri kullanır. Yüksek foton çıkışlı, kırmızı-floresan ışıkla aktive olabilen bir mCherry floresan protein türevi olan PA-mCherry1'in geliştirilmesi, yeşil floresan proteinin yeşil-floresan PA-GFP türevi ile çift renkli görüntülemeyi mümkün kılmıştır. Böylece, PA-GFP ve PA-mCherry1, 405 nanometre lazerle aynı anda açılırken, tek moleküllü floresan sırasıyla 488 nanometre ve 651 nanometre lazerler kullanılarak görüntüleniyor. PA-mCherry1 performansta daha fazla iyileştirmeden faydalanacak olsa da, prob, benzer sonuçlar elde etmek için Dronpa, rsFastLime ve PS-CFP2 gibi diğer birkaç yeşil ışıkla etkinleştirilebilir floresan protein ile potansiyel olarak kullanılabilir. İyileştirilmiş foton çıkışı ve spektral özelliklere sahip yeni optik vurgulayıcılar geliştirildikçe, hem sabit hem de canlı hücrelerde floresan proteinlerle iki renkli PALM deneyleri yürütme yeteneğinde büyük olasılıkla çarpıcı gelişmeler olacaktır.
Foto-değiştirilebilir karbosiyanin boyaları, değişken aktivasyon dalga boylarına sahip aktivatör floroforlarla birleştiğinde çok renkli PALM ve STORM görüntüleme için geniş bir prob paleti sunar. Uzak-kırmızı ve yakın-kızılötesi boyalar Cy5, Cy5.5 ve Cy7, Alexa Fluor 405, Cy2 ve Cy3'ü içeren çok çeşitli aktivatör boyalar için foto-değiştirilebilir alıcı raportörler olarak işlev görebilir. Bu sınıftaki aktivatörlerin ve habercilerin eşleştirilmesini karıştırmak, çok renkli görüntüleme için aktivasyonlarına veya emisyon dalga boylarına göre ayırt edilebilen potansiyel kombinasyonların sayısını artırır. Ayrıca, Cy5'ten Cy7'ye kadar olan karbosiyaninler, aktivatörlere gerek kalmadan tek bir lazerle spontane olarak etkinleştirilebilir ve devre dışı bırakılabilirken, yine de kolayca ayrılan floresan emisyon spektrumları üretir. 500 ile 647 nanometre arasındaki emisyon aralığındaki Alexa Fluors ve belirli fotokromik rodamin boyaları ve ATTO boyaları gibi bir dizi ksanten boyası, aynı lazerle foto-anahtarlanabilir ve potansiyel olarak çok renkli görüntülemeyi mümkün kılar. Floresan proteinler, Cy5 ile eşleştirilmiş rsFastLime kullanılarak PALMIRA için gösterildiği gibi, çok renkli görüntüleme için sentetik boyalarla da birleştirilebilir. Tek moleküllü süper çözünürlüklü görüntülemede kullanımları için yeni problar geliştirilip test edildikçe, çok renkli deneyler için adayların listesi şüphesiz önümüzdeki yıllarda artacaktır.
Başa dön ^ Üç Boyutlu PALM Görüntüleme
Orijinal olarak geliştirildiği gibi, PALM ve ilgili tek moleküllü lokalizasyon süperçözünürlük teknikleri, bireysel floroforlar hakkında konumsal bilgi elde etmek için büyük ölçüde yanal, iki boyutlu düzlemde görüntüleme ile sınırlıydı. Görüntülemeyi uygulamak için toplam dahili yansıma mikroskobu uygulanması ve numunelerin bir mikrotom ile üretilen nispeten ince bölümlerden oluşması nedeniyle eksenel boyutun araştırılması kısıtlanmıştır. Her iki metodoloji de z düzleminde görüntülemeyi yaklaşık 100 nanometrelik bir derinliğe hapseder, bu da küçük üst yapıların eksenel görüntülemesine göre bir miktar enlem sağlar, ancak diğerlerinin boyutunun altındadır. Genişletilmiş dikey (eksenel) konum bilgisi, fotoaktivasyon ve lokalizasyonla birlikte çeşitli tekniklerle ortaya çıkarılabilir. Bu yöntemler, z'ye bağlı nokta yayılma fonksiyonunun kullanılması, numunenin yandan görünüm yaklaşımından incelenmesi ve eksenel yön boyunca interferometri kullanılması dahil olmak üzere birkaç farklı kategoride gruplandırılabilir.
Eksenel ( z ) bağımlı nokta yayılma fonksiyonu açısından, en basit örnek, ideal odakta yanal görüntü düzleminin üstünde veya altında konumlanmış bir nokta nesnesinin (örneğin tek moleküllü bir emitör) odağının bozulmasıdır. Böyle bir nokta kaynağının görüntüsü genişleyebilir, merkezi bir tepe etrafında eşmerkezli halkalar geliştirebilir veya normal nokta yayılma işlevinden sapan bir forma evrilebilir. Bu tür görüntülemeye temel yaklaşım, biri az odaklı ve diğeri aşırı odaklı olmak üzere iki farklı yanal düzlemde iki eşzamanlı görüntü yakalamaktır.Bu, iki farklı odak mesafesini görüntüleyecek şekilde ayarlanmış dedektörlerle birleştirilmiş bir ışın ayırıcı kullanılarak gerçekleştirilebilir. Nokta boyutlarının oranı, eksenel konumun monoton bir fonksiyonudur ve kolayca hesaplanabilir. Çift düzlemli yöntem olarak bilinen bu yaklaşım, floresan proteinlerle yaklaşık 75 nanometrelik yarı maksimumda (FWHM) tam genişlikte bir nokta yayılma işlevi sağlamak için standart PALM yanal çözünürlüğünün yüzde 20 ila 30'u içinde başarmıştır. Çift düzlemli görüntülemenin birincil avantajı, ekstra boyuta erişmedeki göreceli basitliktir.
Benzer bir aşırı odak ve yetersiz odak yaklaşımı, tek bir görüntünün iki dikey ekseni boyunca uygulanabilir, böylece x ekseni, y ekseninden farklı bir eksenel konuma odaklanabilir. Teknik ilk olarak STORM ile objektif ve EMCCD detektörü arasına zayıf bir silindirik lens eklenmesiyle gösterildi. Pratikte, tek bir molekülden gelen floresan, emitörün göreceli eksenel konumunu ortaya çıkaran x ve y çaplarının oranını içeren eliptik bir görüntü üretir. Floresan eliptikliklerin okunması, STORM görüntülemede karbosiyanin (Cy3 ve Cy5) boya çiftleri kullanılarak yaklaşık 20 nanometre yanal ve 50 ila 60 nanometre dikey çözünürlük vermiştir. Bir uzaysal faz modülatörü ile daha egzotik eksenel bağımlı nokta yayılma fonksiyonları üretilmiştir. Örnek olarak, bu ikilinin açısal yönünün eksenel konuma bağlı olduğu tek bir nokta kaynağından bir çift nokta görüntüsü oluşturulabilir. Böylece açısal yön, eksenel koordinatların bir okuması olarak kullanılabilir.
Uzamsal odaklamaya bir alternatif olarak, femtosaniye uyarma ışığı darbeleri zaman içinde odaklanabilir, ancak önemli ölçüde daha karmaşık bir mikroskop konfigürasyonu gereklidir ve teknik, tek fotonlu lineer uyarmadan ziyade lineer olmayan iki fotona bağlıdır. Bu yöntemin birincil avantajı, ilgi alanından çıkarılan bölgelerde sahte uyarımın azaltılmasıdır. Bu şekilde, birden fazla 1 mikrometre düzleminin yaklaşık 10 mikrometre kalınlığa kadar PALM görüntü yığınları oluşturmasını sağlayarak, ışıkla etkinleştirilebilir floresansı korur. Üç boyutlu görüntülemenin farklı bir stratejisi, yansıyan bir ayna yüzeyi tarafından oluşturulan yandan görünüşlü bir sanal görüntü kullanarak ortogonal bir yönden bir PALM görüntüsünü yakalamaktır. Mikroskop kurulumu, numunenin v-oluk aynalar içeren bir tutucuya veya basitçe güçlü eğimli bir ayna yüzeyine monte edilmesini içerir. Kalibrasyon ve birleştirilmiş verilerden verileri hesaplamak için özel yazılım gereklidir.
Üç boyutlu tek moleküllü görüntülemede belki de en iyi çözünürlük, PALM ile birlikte interferometri ile elde edilir. Teknik, interferans-PALM (iPALM) olarak bilinir ve floresan protein etiketleri kullanılarak 20 nanometre yanal lokalizasyon hassasiyeti ile birleştirilmiş 10 nanometre dikey göstermiştir. İnterferometri, pozisyonları ölçmek için yaygın bir tekniktir ve ışığın bir ışın ayırıcı ile yeniden birleştirilmeden önce iki farklı konuma bağlı yol aldıktan sonra nasıl girişimde bulunduğuna dayanır. Floresansın son derece kararsız dalgalanan doğasının özel tutarlılık, kalibrasyon ve tolerans gereksinimleri, 4Pi sistemine benzer karşıt amaçlarla en iyi şekilde uygulanan cihaz konfigürasyonunun ayrıntılarına dikkatli bir şekilde dikkat edilmesini gerektirir. Tutarlılık, yayılan herhangi bir fotonun her zaman kendisine karşı tutarlı olduğunun farkına varılarak korunabilir, bu iPALM için kritik bir kavramdır. Farklı eksenel bağımlı yol uzunluklarına sahip iki yol alan aynı fotonu içeren girişim bu gereksinimi karşılar. Kendi kendine kalibrasyon gereksinimi, tek fotonlu kendi kendine girişim ile de karşılanır ve özel bir ışın ayırıcı tarafından sağlanan eşzamanlı çok fazlı interferometri kullanılarak bir floresan kaynağının dalgalanmalarına karşı toleranslı olabilir.
Şekil 9'da sunulan, yayılan fotonların sayısı ve eksenel ve yanal çözünürlük FWHM'ye göre floresan proteinler ve sentetik boyalar için üç boyutlu tek molekül lokalizasyon tekniklerinin bir karşılaştırmasıdır. iPALM'in üç boyutlu kesinliği ve odak dışı bırakma tekniği, altın boncuklardan yayılan foton sayısının bir fonksiyonu olarak gösterilir. iPALM (dolgulu daireler ve kareler ile temsil edilir), yayılan foton başına odak dışı bırakma tekniklerinden (açık daireler ve kareler) daha iyi lokalizasyon hassasiyeti sergiler ve yanal (dolu mavi kareler) çözünürlükten daha iyi eksenel (dolu kırmızı daireler) görüntüler. Buna karşılık, odaktan çıkarma teknikleri, eksenel boyutta (doldurulmamış kırmızı daireler) yayılan foton başına yanal yöne (doldurulmamış mavi kareler) kıyasla önemli ölçüde daha az hassasiyete sahiptir. Genel olarak, süper çözünürlük için olanlar da dahil olmak üzere çoğu floresan mikroskopi tekniği, iPALM bir istisna olmakla birlikte, yanal çözünürlükten daha zayıf eksenel çözünürlük sergiler.
Belirli bir deney için farklı üç boyutlu PALM yaklaşımlarının eksiksiz bir değerlendirmesi için, çözünürlük ile birlikte tolere edilebilir kalınlık, yanal boyut, zaman ölçeği, prob etiketleme yoğunluğu ve doğruluğu dahil olmak üzere numune parametreleri üzerindeki pratik kısıtlamalar dikkate alınmalıdır. Çözünürlüğün sadece araçsal bir sayı olmadığı, aslında etiketleme yaklaşımıyla eleştirel bir şekilde iç içe olduğu akılda tutulmalıdır. Örneğin, daha fazla foton üreten daha parlak etiketler daha iyi lokalizasyon doğruluğu sağlar, ancak antikor bağlantı uzunlukları, hedefleme özgüllüğü ve moleküler etiketlemenin yoğunluğu gibi hususlarla tavlanır. tdEos gibi endojen floresan protein etiketleri, parlaklığı azaltmıştır ve tatmin edici veriler elde etmek için daha verimli bir lokalizasyon prosedürü gerektirir. iPALM görüntüleme ve odaktan uzaklaştırma teknikleri için yapılan ödünleşimler Şekil 9'da sunulmuştur.
Başa dön ^ PALM ile Canlı Hücre Görüntüleme
PALM ve benzeri tek moleküllü lokalizasyon teknikleriyle ilgili tekrarlayan fotoaktivasyon, görüntüleme ve fotoağartma işlemi, numunelerin gözlemlenmesinde önemli zamansal kısıtlamalar getirir. Tekniği canlı hücre görüntülemeye geçirmek için, moleküllerin dönüşümünü hızlandırmak için hem aktivasyon hem de uyarma ışık yoğunlukları artırılarak PALM süreci hızlandırılabilir, ancak canlı hücrelerin sağlıklı olduklarından emin olmak için dikkatle izlenmelidir. Süper çözünürlüklü mikroskopi ile canlı hücre görüntülemesi henüz emekleme aşamasında olmasına rağmen, birkaç araştırma, gelecekteki araştırmaların muhtemelen dayanacağı temeli güçlendirmeye hizmet ediyor. Bunlar, hızlandırılmış PALM görüntüleri oluşturmak, canlı hücrelerdeki moleküller arasındaki ortalama dağılımları veya mesafeleri belirlemek ve dinamik moleküler haritalar oluşturmak için optik vurgulayıcı floresan proteinlerin kullanılmasını içerir. Yukarıda açıklanan tekniklere benzer şekilde, hızlandırılmış bir PALM deneyinin herhangi bir tek karesinde görüntülenen moleküler yoğunluk, tek molekülleri izole etmek için yeterince düşük kalmalıdır.
Unutulmaması gereken önemli bir nokta, canlı hücreli PALM'de, eğer amaç protein açısından zengin yapıların hareketlerini ve yeniden düzenlemelerini alt kırınım hassasiyetinde ölçmekse, lokalize moleküllerin yoğunluğunun süper çözünürlüklü bir görüntü oluşturacak kadar yüksek olması gerektiğidir. Bu nedenle, fokal yapışma kompleksleri, filamentli aktin hücre iskeleti, mikrotübüller, ara filamentler veya endoplazmik retikulum morfolojik değişiklikleri gibi yavaş hareket eden makromoleküler yapılar uygun adaylardır. Pratikte, cihaz konfigürasyonu ile çerçeve başına yaklaşık 500 ila 1000 molekül mümkün olduğunca çabuk görüntülenmelidir (veri toplama aralıkları bir dakika veya daha az ile sınırlandırılmalıdır). PALM ile canlı hücre görüntülemesi, bireysel bir yapışma kompleksinin değişken oranlarda hareket ettiğini, farklı toplam sayıda molekülü topladığını veya kaybettiğini ve farklı şekil değişiklikleri geçirdiğini ortaya çıkarmak için fokal adezyonlar üzerinde yapılmıştır. Gelecekteki çalışmalar, bir dizi başka görüntüleme senaryosunu ele alacaktır.
Canlı hücre PALM görüntülemenin benzersiz bir uygulamasında (bakınız Şekil 10), tek parçacık izleme PALM (sptPALM) olarak bilinen bir teknikle binlerce ayrı floresan protein füzyonu izlendi. Floresan proteinlerin yörüngeleri, plazma zarında eksprese edilen iki viral proteinin (ts045 veziküler stomatit viral G proteini, VSVG ve insan immün yetmezlik virüsü tip 1 yapısal proteini, Gag) dağılımını ve dinamiklerini karşılaştırmak için kullanıldı. Şekil 10'da, VSVG-tdEos floresan proteininin moleküler hareketi, aynı anda tdEos moleküllerinin alt kümelerini fotoaktive ederken 561 nanometre ışık kullanılarak bir COS7 hücresinde görüntülendi. Moleküller her çerçevede lokalize edildi ve ardışık çerçevelerdeki belirlenen konumları izlere bağlandı. Şekil 10(a)'daki izler, 0.75 saniyeden fazla floresan kalan molekülleri temsil eder (tek izleri ayırt etmek için farklı renklerle çizilmiştir). Her bir iz için difüzyon katsayısı belirlendi ve yolun başlangıcında dolu bir daire olarak çizildi (Şekil 10(b)). Her ize, difüzyon değerine göre bir renk atanmıştır.
Şekil 10'daki sptPALM görüntülemenin sonucu, çarpıcı biçimde farklı difüzyon davranışı ortaya çıkaran, tek moleküllü difüzyon katsayılarının uzamsal olarak çözümlenmiş haritalarıydı. VSVG moleküllerinin plazma zarını serbestçe keşfetmek için oldukça hareketli olduğu belirlenirken, Gag proteinleri genellikle 100 ila 200 nanometre çapında virüs benzeri parçacıkların boyutuna yaklaşan hareketsiz kümelerde bulundu. Dendra2 kullanan bakterilerde yapılan benzer deneyler, bakteriyel sitokinezde yer alan sarmal bir ipliksi yapı (bir Z-halkası olarak adlandırılır) oluşturan memeli tübülin homologu Ftx'i izledi. Yavaş dinamikleri yakalayan odak yapışmalarının süper çözünürlüklü videolarının aksine, moleküler tek parçacık izleme, molekül topluluklarında çok daha hızlı dinamikleri ortaya çıkarabilir.
Hala gelişmekte olan bir teknik olmasına rağmen, tek moleküllü süper çözünürlüklü mikroskopi, nano ölçekte hücresel süreçleri anlamakla ilgilenen biyologlar arasında artan bir ilgi görüyor. Geniş alan ve konfokal floresan mikroskopisi tarafından dayatılan kırınım sınırlı çözünürlük engelini aşmak için şu anda bir dizi metodoloji mevcuttur ve daha fazlası geliştirilmektedir. STED, GSD ve SSIM gibi aydınlatmaya dayalı süper çözünürlük teknikleri, geleneksel floroforları kullanarak çözünürlükleri 30 ila 50 nanometre aralığına iterken, tek moleküllü lokalizasyon teknikleri (PALM ve STORM) özel fotoaktive edilebilir problar gerektirir. Konvansiyonel problar, moleküllerin açık ve koyu durumlar arasındaki geçişlerine dayanarak tek moleküllü lokalizasyonda başarılı bir şekilde kullanılmıştır, ancak bunlar, floresanı tek moleküllü görüntülemeye düşürmek için gerekli olan deney öncesi ışınlama adımları sırasında moleküler yoğunluk kaybıyla gelebilir. seviyeler.
PALM'nin arkasındaki birincil itici güç, hem konsept hem de enstrümantasyondaki mutlak basitliktir, yalnızca modifiye edilmiş bir geniş alan floresan mikroskobu (tek moleküllü görüntüleme yapmak için) ve yapışık hücre kültürlerinde floresan füzyonları ifade etme yeteneği gerektirir. Bununla birlikte, PALM'nin ve ilgili tek moleküllü lokalizasyon tekniklerinin geleceği, muhtemelen daha gelişmiş enstrümantasyon ve mükemmel fotoanahtarlama özelliklerine sahip daha iyi foton yayıcılar olan ve tüm görünür spektrum üzerinde flüoresans sergileyen yeni flüoroforlarla aydınlanacaktır. Ayrıca araştırmacılar, bu tekniklerin ciddi olarak on yıldan daha az bir süre önce başladığını ve hala gelişim aşamasında kabul edilebileceğini unutmamalıdır. Ne olursa olsun, teknikler, ticari enstrümantasyonun artık mevcut olduğu kadar iyi gelişmiştir. Gelecekte, enstrümantasyon ve analizdeki gelişmelerle birlikte floresan probların fotofiziksel davranışındaki iyileştirmeler, deneylerin hızını artırabilir ve alım sürelerini önemli ölçüde azaltabilir. Artan bu sıkıntılara rağmen, süper çözünürlüklü mikroskopinin hızlı temposu, önümüzdeki birkaç yıl içinde kırınım bariyerinin altında görüntülemenin günümüzdeki konfokal görüntüleme kadar yaygın hale geleceğine dair güven vermektedir.
Katkıda Bulunan Yazarlar
Eric Betzig ve Harald F. Hess - Howard Hughes Tıp Enstitüsü, Janelia Çiftliği Araştırma Kampüsü, Ashburn, Virginia, 20147.
Hari Shroff - Yüksek Çözünürlüklü Optik Görüntüleme Bölümü, Ulusal Biyomedikal Görüntüleme ve Biyomühendislik Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Bethesda, Maryland, 20892.
George H. Patterson - Biyofotonik Bölümü, Ulusal Biyomedikal Görüntüleme ve Biyomühendislik Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Bethesda, Maryland, 20892.
Jennifer Lippincott-Schwartz - Hücre Biyolojisi ve Metabolizma Programı, Eunice Kennedy Shriver Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsan Gelişimi Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Bethesda, Maryland, 20892.
Michael W. Davidson - Ulusal Yüksek Manyetik Alan Laboratuvarı, 1800 Doğu Paul Dirac Dr., Florida Eyalet Üniversitesi, Tallahassee, Florida, 32310.
Figür 3
Şekil 3. Sıralı konfokal taramalar için bisbenzimid ve FITC ile karşılaştırıldığında GaInP'nin fotostabilitesi. Bisbenzimid etiketli hücresel DNA'nın (mavi), FITC-phalloidin etiketli aktin filamentlerinin (yeşil) ve GaInP nanotellerinin (kırmızı) konfokal çerçeve numarasının bir fonksiyonu olarak nispi yoğunluğu (her çerçeve, biri 405 nm ve 488 nm uyarma dalga boyuna sahip). Nanoteller, bisbenzimid ve FITC ile karşılaştırıldığında fotoağarmaya daha az eğilimlidir. Her durumda, sinyal ilk çerçevede ölçülen değere normalize edilmiştir.
GaP–GaInP heteroyapılarının nanotelleri barkod tanımlama sistemlerinde olduğu gibi in vitro ve in vivo olarak tanımlamak için kullanılabileceğinin bir kanıtı olarak, farklı boyutlardaki nanoteller ve farklı yüzey işlemlerine sahip nanoteller.
Benzer uzunluklardaki ancak farklı çaplardaki nanotelleri ayırt etmek için, tek bir flüoresan segmentli (GaP–GaInP) 40 nm çapında nanoteller ve iki flüoresan segmentli (GaP–GaInP–GaP–GaInP) 80 nm çapında nanoteller sentezledik (Şekil 4) ve onları bir hücre kültürüne ekledi (detaylı bir deney protokolü için Destekleyici Bilgilere bakın).
17.4: Mikroskop - Biyoloji
b Pekin Ulusal Moleküler Bilimler Laboratuvarı, CAS Temel Organik Katılar Laboratuvarı, Kimya Enstitüsü, Çin Bilimler Akademisi, P. R. Çin
c Fizik, Kimya ve Biyoloji Bölümü (IFM), Linköping Üniversitesi, Linkoping 58183, İsveç
Soyut
Düşük maliyetli (<$/g), yüksek verimli (>%90), alkolde çözünür yüzey aktif madde kapsüllü polioksometalat kompleksi [(C)8H17)4N]4[SiW12Ö40] sentezlenmiş ve polimer güneş pillerinde (PSC'ler) bir katot ara tabakası (CIL) olarak kullanılmıştır. PTB7-Th (poli[[2,6′-4,8-di(5-etilheksiltienil)benzo[1,2-] bazlı PSC'ler için %10,1'lik bir güç dönüşüm verimliliği elde edilebilir.B3,3-B]-ditiofen][3-floro-2[(2-etilheksil)karbonil] tieno [3,4-B]-tiyofendiil]]):PC71[(C)'nin dahil edilmesinden dolayı BM ([6,6]-fenil C71-butirik asitmetil ester)8H17)4N]4[SiW12Ö40]. Akım yoğunluğu-voltaj karakteristikleri, geçici fotoakım, yük taşıyıcı hareketliliği ve kapasitans-voltaj karakteristiklerinin birleşik ölçümleri şunu göstermektedir [(C8H17)4N]4[SiW12Ö40] yerleşik potansiyeli, yük taşıyıcı yoğunluğunu ve mobiliteyi etkili bir şekilde artırabilir ve PSC'lerde yük taşıyıcı çıkarımını hızlandırabilir. En önemlisi, kullanma mekanizması [(C8H17)4N]4[SiW12Ö40] CIL, metal/[(C)'nin X-ışını fotoemisyon spektroskopisi (XPS) ve ultraviyole fotoemisyon spektroskopisi (UPS) ile daha fazla gün ışığına çıkarıldığından8H17)4N]4[SiW12Ö40] arayüz. Bulgular şunu gösteriyor ki [(C8H17)4N]4[SiW12Ö40] sadece metal katotların çalışma fonksiyonunu azaltmakla kalmadı, aynı zamanda metallerle temas üzerine n-katkılı oldu, bu da CIL'lerin çalışma mekanizmasına ilişkin içgörüler sağlayarak, PSC'lerde açık devre voltajını, kısa devre akımını ve doldurma faktörünü aynı anda iyileştirdi.
6 VLP AŞI TERCÜMESİ
Ar-Ge'den ruhsatlandırmaya kadar, yeni aşıların meyve vermesi yirmi yıl kadar sürebilir ve maliyetinin 500 milyon ABD dolarından 1 milyarın üzerine çıktığı tahmin edilmektedir (S. A. Plotkin, Mahmoud ve Farrar, 2015). VLP aşıları 30 yıldan uzun süredir geliştirilmektedir (Lua ve diğerleri, 2014). Bugün, ticari olarak lisanslanmış altı VLP aşısı ve www.clinicaltrials.gov adresinde belgelenen 110'dan fazla VLP aşı denemesi (tamamlanmış ve mevcut) bulunmaktadır. Bu denemelerin %50'den fazlası VLP aşı adaylarını çeşitli kanserlere (Merck Sharp & Dohme Corp. ve GlaxoSmithKline plc. denemeler). VBI Vaccines Inc. ve Takeda Pharmaceutical Co. Ltd. şu anda sırasıyla sitomegalovirüs ve norovirüse karşı aşılar için denemeler yürütüyor. Hindistan merkezli üreticiler, CPL Biologicals Pvt. Ltd., faz 3 denemelerini başarıyla tamamlayan dünyanın ilk VLP grip aşısı olan Cadiflu-S'yi geliştirdi (http://cadilapharma.com). Bu çok aşamalı klinik deneyler, güvenlik ve etkinliği değerlendirir ve aşı adaylarının lisans onayı için uygunluğunu belirler. Ancak aşıların başarılı bir şekilde çevrilmesi, güvenilir aşı tedariki sağlamak ve üretim maliyetlerini en aza indirmek için uygulanabilir aşı üretim süreçlerine bağlıdır.
6.1 Düzenleme ve ekonomi
Yeni aşıların üretilmesiyle ilişkili artan maliyet ve düzenleyici belirsizlik, aşı üreticileri için uzun süredir zorluklar oluşturmaktadır (Ulmer, Valley, & Rappuoli, 2006). Aşı üretiminin karmaşıklığı, önemli miktarda uzmanlık gerektirir ve maliyete önemli ölçüde katkıda bulunur (S. Plotkin ve diğerleri, 2017). Mevcut ilaç pazarlarına kıyasla düşük kar marjının yanı sıra aşı Ar-Ge, test ve üretimle ilgili harcamalar, kâr odaklı ilaç şirketlerinden sağlanan fonlarda çarpıcı bir düşüşe yol açmıştır (Offit, 2005). Ancak bu düşüşün erken olduğu düşünülüyor. Bu inceleme boyunca gösterildiği gibi, VLP teknolojileri, özellikle tek kullanımlık biyoişleme sistemleriyle birleştirildiğinde, daha güvenli ve daha ucuz aşıların hızlı üretimini sağlamak için platform yeteneklerini geliştirmeye ve VLP üretim verimlerini iyileştirmeye güçlü bir şekilde odaklanarak hızla ilerlemektedir. Bu ilerleme, ulusal hükümetler, uluslararası kuruluşlar ve hayırsever kuruluşlar gibi “kar amacı gütmeyen” kaynaklardan sağlanan finansal yatırımla devam edecek şekilde ayarlanmıştır. Özellikle Gavi, aşı İttifakı (Balaji, 2004 ) ve Bill & Melinda Gates Vakfı (www.gatesfoundation.org), dünyanın en büyük aşı pazarı olan üçüncü dünya ülkelerine uygun fiyatlı aşılar sağlamak için motive olmuştur. Aşı saflığını, güvenliğini, etkinliğini ve kararlılığını sağlamak için düzenleyici makamlar, ham maddelerden ve üretim süreçlerinden klinik deneylere ve ötesine kadar aşı üretiminin her aşamasını yönetir. Bu, güvenli ve uygulanabilir üretim süreçlerinin değerlendirilmesini ve sertifikalandırılmasını içerir (S. Plotkin ve diğerleri, 2017).Mevzuat gerekliliklerini karşılamak, özellikle denizaşırı pazarlar için aşı üretirken veya yeni geliştirilmiş biyoprosesleri kullanırken karmaşık bir süreç olabilir. Yukarı ve aşağı süreçleri düzene sokarak ve genel bir VLP tabanı kullanarak, VLP platform teknolojisinin, bazın ve saflaştırılmasının iyi karakterize edileceği göz önüne alındığında, bireysel aşıların düzenleyici yükünü azaltması bekleniyor. VLP platformları, pandemik koşullara yanıt olarak aşı dağıtımını hızlı bir şekilde takip edebilir.
Teşekkür
Laboratuvar alanı için Stanford Üniversitesi'nden Dr. Stephen R. Palumbi'ye, mercan örneklerini sağladığı için Monterey Bay Akvaryumu'ndan Raymond Direen'e ve bu projedeki yardımları için Dr. Varghese K. George ve Dr. Savita Pahwa'ya teşekkür ederiz. Nazikçe sağladıkları için Dr. Lorraine Ling ve Dr. John R Pringle'a teşekkür ederiz. A. pallida suşlar. Karla'ya da teşekkür etmek isteriz. J. palmeri, Dr. Jody M. Beers ve düzenleme için Paul A. K. Bump. Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı Okyanus Bilimi Doktora Sonrası Bursu OCE-1323652 tarafından finanse edildi ve N.T.K. B.R.'nin çalışması Human Frontier Science Program Organisation'ın Doktora Sonrası Bursu ve NIH Hematology eğitim hibesi T32 HL120824-03 tarafından desteklenmiştir.
Bağlantılar
Spektroskopi Bölümü, Fizik Bölümü, Ulusal Araştırma Merkezi, Dokki, Kahire, 12622, Mısır
Güncel Adres: Biyomühendislik Enstitüsü, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL), Lozan, İsviçre
Biyonanobilim Bölümü, Delft Teknoloji Üniversitesi, 2628 CJ, Delft, Hollanda
Laboratoire de Biologie Moléculaire Eucaryote (LBME), Centre de Biologie Integrative (CBI), CNRS, UPS, Toulouse Üniversitesi, 31062, Toulouse, Fransa