Summary
Ekipman yoğun yöntemler kullanılmadan hücre göçünün belirlenmesinde yeni bir yaklaşım sağlayan sıfırdan geçiş testini uygun maliyetli bir yöntem savuruyoruz. Bu protokolde fibroblastlar kullanılırken, ek hücre tipleri ve hücre göçü üzerindeki etkileri incelemek için uyarlanabilir ve kullanılabilir.
Abstract
Hücre göçü hem fizyolojik hem de patolojik olayların önemli bir bileşenidir. Normal hücre göçü geliştirme ve bir bağışıklık yanıtı montaj gibi temel fonksiyonlar için gereklidir. Hücre göç süreci ile bir defekt veya değişiklik meydana geldiğinde, zararlı sonuçlar (yani, kanser metastazı, yara iyileşmesi ve skar oluşumu) olabilir. Hücre geçişinin önemi nedeniyle, uygun fiyatlı, uyarlanabilir ve tekrarlanabilir bir hücre geçiş tadına erişim olması gerekir. Ortak sıfırdan geçiş testini kullanarak, genel laboratuvar ekipmanı kullanan hücre göçlerini analiz etmek için yeni bir yaklaşım geliştirdik. Açıklanan yöntem, hızlandırılmış mikroskopi kullanılmadan belirli ilgi alanlarının yeniden yakalanmasına olanak tanıyan görsel belirteçler kullanır. Buna ek olarak, deneysel tasarımda esneklik sağlar, göç matris substrat ı değiştirmekten farmakolojik değiştiriciler eklenmesine kadar. Ayrıca, bu protokol hücre geçişi incelenirken çeşitli yöntemlertarafından dikkate alınmayan hücre geçişi alanını hesaba katmanın bir yolunu özetler. Bu yeni yaklaşım daha büyük bir kitleye bir sıfırdan göç tetkik sunuyor ve araştırmacılar için hücre göç fizyolojik ve patofizyolojik etkisini incelemek için daha büyük bir fırsat sağlayacaktır.
Introduction
Hücre göçü birçok fizyolojik ve patolojik olaylar için çok önemlidir. Bu gelişme sırasında gereklidir, bir bağışıklık yanıtı montaj için, ve uygun yara iyileşmesi için1,2,3. Bu hücre geçiş olaylarının çoğu fiziksel veya kimyasal sinyaller tarafından tetiklenebilir. Örneğin, bir bağışıklık yanıtı sırasında, lökositler bir kemoattractant yanıt olarak yaralanma bir siteye doğru göç edecek2. Ayrıca, lökositler de ek bağışıklık hücrelerinin göç indüklemek için sitokinler serbest bırakacaktır, yanı sıra diğer hücre tipleri, fibroblastlar gibi, yara iyileşme sürecinde yer alan, ve böylece, çok hücreli bir yanıt başlatılması4. Hücrelerin göç yeteneği uygun fizyolojik fonksiyon için gereklidir; ancak, hücre göçü kontrolsüz gittiğinde, bu olumsuz bir yanıt olabilir ve patolojik olaylara katkıda bulunmak, kronik inflamasyon gibi, vasküler hastalık, kanser metastazı, ve bozulmuş yara iyileşmesi2,3,4,5,6,7. Bozulmuş yara iyileşmesi hücre göçündeki bozukluklar nedeniyle şeker hastalarının sık görülen bir hastalığıdır ve bu bozukluklar ele alınmazsa daha fazla komplikasyona yol açabilir (örn. ampütasyon8,9). Bu çalışma, diğerleri gibi, hücre göçünün normal fizyolojik veya patolojik koşullar altında meydana geldiği süreci daha iyi anlama gereğini ortaya konmuş ve bu araştırma alanını ilerletmek için hayati önem taşımaktadır. Bunu başarmak için, bu tahlilleri yapmak için gerekli ekipmana sahip olmayan araştırmacılar için hem erişilebilir hem de uygun fiyatlı göç tahlilleri olması gerekir.
Şu anda, hücre geçişi ile ilgili konuların geniş bir yelpazede incelemek için kullanılabilir geçiş tahlilleri çeşitli vardır. Her biri hücre göçlerini etkileyen belirli alanları hedefleyen 2B ve 3B geçiş modelleri geliştirilmiştir. 3D göç modelleri genellikle hücre istilası çalışmaları ile ilişkilidir ve hücre göçü üzerinde hücre dışı matriks etkisini değerlendirmek10,11,12, 2D göç tahlilleri uygulama daha geniş bir aralığı var ve öncelikle kemotaktik göç çalışma için kullanılır, yara iyileşmesi, ve hücre göçü sırasında fonksiyonel değişiklikler13,14,15,16. Bu tahlillerin bazıları, Boyden odaları veya dışlama halkaları gibi bazı araştırmacılara bu tahlillerin kullanılabilirliğini azaltabilecek ek ekipman gerektirir. Daha uygun maliyetli tahlillerden biri, genellikle yara iyileşmesini ve hücre göçündeki genel değişiklikleri değerlendirmek için kullanılan çizik tahlilleridir14,17. Çoğu laboratuvar bir çizik teşp yapmak için donanımlı olsa da, hücre göç izlemek için kullanılan ekipman ya kullanılamaz ya da satın almak için çok pahalı olma eğilimindedir. Bu, ters mikroskop ve canlı görüntüleme sistemi gerektiren hızlandırılmış mikroskobu içerir. Bu pahalı ekipman parçaları her laboratuvar için yaygın olarak erişilebilir değildir. Bu nedenle, bu gözlem daha hazır ekipman ile hücre göçünün değerlendirilmesi sağlayan yeni bir protokol ihtiyacını vurgulamaktadır.
Burada sunulan protokol hücre göçünü değerlendirmek için yeni ve uygun fiyatlı bir yol sağlar. Bu yöntem, çizik tahlilleri ile ilişkili aynı prosedürü izler, ancak temel bilimler laboratuvar ortamında daha yaygın olarak bulunan ekipmanları kullanarak hücre göçünün incelenmesinde farklılık gösterir. Ortak ekipman kullanan bu protokol, hızlandırılmış mikroskopi kullanılmadan hücre geçişinin daha doğru belirlenmesini sağlar. Bu yöntem, geçişi belirlemenin yanı sıra, hücre geçişini büyük ölçüde etkilediği belirtilen çizilme alanındaki değişken faktörleri de hesaba kattırır. Genel olarak, hücre göçü analizi için bu yeni protokol, daha fazla laboratuvarın hücre göçü alanını keşfetmesi ve katkıda bulunması için bir fırsat sağlamaktadır.
Protocol
1. Genel hücre kültürü
- 1 g/L glukoz içeren Dulbecco'nun Modifiye Eagles Medium (DMEM) kültür kardiyak fibroblastları, sodyum pirüuvat, L-glutamin, ve 14.2 mM NaHCO3,14.9 mM HEPES, %15 ısı-inaktive fetal sığır serumu (FBS), %2 L-glutamin ve %0.02 antimikrobiyal reaktif (Bkz. Malzeme Tablosu)ile desteklenir ve 37 °C'de CO2 inkübatörde muhafaza edilir.
- 0 (P0) geçitte %90-95 birleşme ye kadar kültür kardiyak fibroblastları bulunur. Bu noktada fibroblastlar göç teşriği için kullanılan 48 kuyuluk bir plakaya bölünmeye hazırdır.
2. Geçiş plakasının hazırlanması
- Bir çizgi çizerek 48-iyi hücre kültür plakası hazırlayın, sarı veya açık renkli kalıcı marker kullanarak, kuyunun merkezindeaşağı. Daha sonra, kuyuyu üç ayrı ilgi alanına bölen üç karma işaret çizin. Bu bölümler görüntüleme için kullanılacaktır.
NOT: Açık renk kalıcı bir işaretleyici kullanmak, geçiş yapan hücrelerin kolayca görüntülenmesine olanak sağlar. Siyah veya mavi gibi koyu işaretçiler, göç eden hücrelerin görselleştirilmesini engeller.
- Bir substrat (örneğin, kollajen) üzerinde göç değerlendirirken, belirli substrat için kullanılan talimatlar ve konsantrasyonları aşağıdaki şu anda kuyu kat.
- Plaka ~ 15.000-20.000 kardiyak fibroblastlar, P1, her kuyu ve kültür hücrelerine, normal mensup koşulları altında (önceki bölümde listelenen koşullar), onlar% 90-95 kesişme ulaşıncaya kadar. 24-48 saat arasında bir araya ulaşılmalıdır.
NOT: Geçiş plakasını ayarlarken pozitif denetim (3T3 hücreleri 18 gibi bilinen bir göçmen hücresi18),negatif denetim (çizilmemiş hücreler) ve boş bir kuyu içerdiğinden emin olun.
3. Scratch geçiş tsay & fiksasyon
- Hücreler %90-95 birleştiğinde, steril bir P200 pipet ucu kullanarak ortamı çıkarın ve çizilmiş çizgi boyunca çizin.
NOT: P200 pipet ucu, çizik teksi10,14,19ile birlikte kullanılan ortak pipet ucudur. Ayrıca, birden fazla deneme birden fazla çizik hatları neden olabilir gibi sadece P200 ucu ile bir geçiş yapmak.
- Herhangi bir bekar kardiyak fibroblastları çıkarmak için düşük serum media (%1.5 FBS) ile kuyuyu durula.
- Her kuyuya 500 μL düşük serum media ekleyin. Herhangi bir farmakolojik ajanlar kullanıyorsanız, şu anda ekleyin.
NOT: Düşük serum media, hücre geçişinin oluşmasına izin verdiği/teşvik ettiği ve fibroblastların çoğalmasını önlediği için kullanılır ve bu da göç tahtının sonuçlarını çarpıtabilir20. Bu protokol için %1.5 FBS kullanılmıştır.
- Fibroblastları %5 CO2 kuluçka makinesinde 24 saat boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırmadan önce 0 saat lik görüntüler yakalayın.
- 20x hedefiyle ters bir mikroskop kullanarak 0 saat görüntü yakalayın. Kuyu başına iki 0 saat görüntü alın. Bu, geçiş çizgisinin daha eksiksiz bir kapsama alanı sağlar.
- İşaretleri (çizgi ve tireler) kullanarak, kazıkazan çizgisinin üst yarısını yakalamak için kuyuyu konumlandırın. Aynı geçiş alanının iki kez görüntülenmediğinden emin olmak için orta çizginin görüntülenmesinden kaçının, bu da sonuçları çarpıtabilir.
- 0 saat görüntü #1 yakalamak için görüntüleme yazılımı(Tablo Malzemeler)kullanın. Ardından plakayı kameranın görünümünde kuyunun/çizilişin alt yarısını konumlandırmak için hareket ettirin. Yine, orta çizgi yakalamaktan kaçının. Yerleştirildikten sonra, 0 saat görüntü #2(Şekil 1)yakalayın.
NOT: Her iki 0 saat görüntüde de orta çizgiden kaçınmak, geçiş alanlarının iki kez yakalanmasını önler, bu da yapılırsa yinelenen sonuçlar üretebilir ve verileri çarpıtabilir.
- 24 saat kuluçkadan sonra, iyi medya kaldırmak ve 1x steril olmayan PBS (bundan böyle kullanılan tüm 1x PBS steril değildir) ile iyi yıkayın.
- Duman kaputunda, kuyuya %4 paraformaldehit in500 μL ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın (RT).
- Paraformaldehit çıkarın ve RT her 5 dakika için 1x PBS ile 3x yıkayın.
- Hücreler yıkandıktan sonra, 24 saat görüntü yakalamaya devam edin veya her kuyuya 1x PBS ekleyin ve daha sonrasına kadar 4 °C'ye yerleştirin. Hücreler 4 °C'de 1-2 hafta görüntülenmeye hazır olana kadar kalabilirler.
- Her kuyuya 300 μL permeabilizing çözeltisi (1x PBS ve %0,01 triton X-100) ekleyerek hücreleri permeabilize edin. RT'de 30 dakika boyunca hafif, sürekli sallanan hücreleri/plakayı kuluçkaya yatırın.
- Permeabilizing çözeltisi çıkarın ve% 1 Coomassie Brilliant Blue leke ekleyin (3% Coomassie Brilliant Blue, 10% asetik asit, 45% metanol, ve 45% dH2O) 10 dakika için nazik, RT sürekli sallanan.
NOT: Plakalar hücre dışı bir matris substrat ile kaplanmışsa, göç testi yapmadan önce coomassie boyama ile kaplanmış bir plakayı test etmeyi unutmayın. Şekil 2, bir matris substratının bu tetkik ile kullanılabileceğini ve hücrelerin görselleştirilmesini etkilemediğini göstermektedir.
- Her biri 5 dakika boyunca sürekli sallanan RT'de 1x PBS ile kuyuları 3x yıkayın.
- YıkAndıktan sonra 300 μL 1x PBS ilave edilir ve 24 saat görüntü çekin.
- Kuyuyu 0 saat görüntüleri yakalamak için kullanılan aynı konuma getirerek 24 saat görüntü yakalayın. Bunu başarmak için, daha önce yakalanan 0 saat görüntüleri açın ve kalıcı işaretçi ile yapılan işaretlemeyi kullanarak kuyuyu aynı konuma getirin. Ortadaki çizgi ve ek çizgi işaretleri, 24 saat görüntü ile 0 saat görüntü arasındaki yakın hizalamayı vermelidir (Şekil 1).
4. 0 saat ve 24 saat görüntülerin hazırlanması
- Aynı kuyunun ve görüntüleme yazılımının(Malzeme Tablosu)çekilen 0 saat ve 24 saat lik görüntüleri açın.
- 0 saat görüntü üzerinde yeni bir katman oluşturun. Ardından, yeni katmanı tıklatın ve metnin üzerine çift tıklayarak katmanın adını "satır katmanı" olarak değiştirin.
NOT: Bu katman, bu noktadan itibaren çizgi katmanı olarak anılacaktır.
- Fırça Aracı'nı (fırça simgesi) tıklatın ve boyutu 10 px ve rengi kırmızıya ayarlayın.
- Seçilen çizgi katmanıyla, çizilme alanını özetleyen iki ayrı çizgi çizin. Geçiş alanını işaretleyen bu çizgiler nedeniyle çizgiler hiçbir hücreye dokunmamalıdır.
- Aracı Taşı'yı (ok simgesi) tıklatın ve ardından Ctrl düğmesini basılı takın ve hem satır hem de arka plan katmanlarına tıklayın.
- 0 h görüntünün ortasına tıklayın ve bu katmanları 24 saat görüntünün ortasına sürükleyin.
- Şimdi 24 saat görüntü kullanarak, 0 h arka plan katmanı tıklayın ve% 50 opaklık değiştirin.
- Ctrl düğmesini basılı tutarak, hem 0 saat arka plan ve çizgi katmanına tıklayın ve ardından katmanları serbestçe dönüştürün(Düzenle>Serbest Dönüştür). Serbest dönüştürme yi kullanarak, 0 saat arka plan ve çizgi görüntüsünü 24 saat arka plan görüntüsüne hizala. Bu adım, 24 saat görüntüüzerinde doğru konumda geçiş alanını işaretleyen çizgileri konumlandırmak için gerekli olan 0 h ve 24 h görüntünün örtüşmeyle sonuçlanır.
- 0 h arka plan ve çizgi katmanlarının 24 saat arka plan görüntüsüne başarılı bir şekilde yerle bir edilmesinden sonra, 0 h arka plan katmanını silin. 0 h arka plan katmanını tıklatarak sil, ardından sağ tıklatın ve sil katmanını tıklatın.
- 0 h arka plan görüntüsünüsesi siler, sadece çizgiyi ve 24 saat arka plan katmanını (şimdi geçiş görüntüsü olarak adlandırılır) bırakır. Çizgi katmanı, 24 saat görüntüdeki geçiş/çizilme alanını gösterir ve geçiş hücre sayısını belirlemek için kullanılabilir.
- Hem photoshop dosyası hem de TIFF/JPEG olarak yeni geçiş görüntüsünü kaydedin. NOT: Bu işlemi gösteren bir temsilci rakam Şekil 3'tesunulmuştur.
5. Göç eden hücre sayısını sayma
- Geçiş görüntüsünü açın. Bu, TIFF/JPEG dosyalarını kabul eden bir programda yapılabilir(Malzeme Tablosu).
- İki kırmızı çizgiye dokunmanın yanı sıra arada bulunan hücre sayısını da sayın.
- Görüntü başına geçirilen hücrelerin sayısını kaydedin. Kuyu başına iki geçiş görüntüsü olacaktır ve bu değerler geçiş alanı için değerler düzeltilene kadar birleştirilmemelidir (sonraki bölümde ayrıntılı olarak).
6. Göç alanını belirleme
- Bölüm 5 'deki görüntüleme yazılımı programında ki geçiş çizgilerini içeren 24 saatlik görüntüyü açın (Malzeme Tablosu).
- Bu görüntüyü "Geçiş Alanı Görüntüsü" olarak kaydedin.
- Kaydolduktan sonra arka plan katmanını tıklatın, sağ tıklatın ve katmanı sil'i tıklatın. Bu, görüntüde yalnızca çizilme çizgileri bırakmalıdır (Şekil 3).
- Fırça Aracı'nı (fırça simgesi) kullanarak çizilme çizgileri arasındaki alanı doldurun. Fırçanın rengini geçiş için çizgiler çizmek için kullanılan renkle eşleştirin.
- Siyah beyaz görüntü(Image>Mode>Grayscale)oluşturmak için görüntüyü gri tonlama yla değiştirin ve ardından görüntüyü kaydedin (Şekil 4).
- Analiz yazılımını(Malzeme Tablosu)başlatın ve analiz yazılımı içinde "Geçiş Alanı" dosyasını açın.
- Geçiş satırının alanını belirlemek için Resim>Ayarla>Eşik'itıklatın. Siyah geçiş alanı kırmızıya döner ve yüzde alanı Eşik kutusunda gösterilir. Alan, görüntüde yakalanan tüm alana kıyasla göç hattının kapsadığı alanın yüzdesi olarak bildirilecektir.
- Geçiş satırı için yüzde alanını kaydedin ve bu değerin aynı görüntü için geçiş yapan hücre sayısıyla eşleştirdiğinden emin olun.
7. Veri analizi
- Çizilmeye göre göç eden hücre sayısını normalleştirin. Göç eden hücre sayısını geçiş çizgisinin yüzde alanına bölün (# geçirilen hücreler % Geçiş alanı). Bunu görüntü başına yapın, kuyu başına geçişe dayalı bir ortalama değil.
- Görüntü başına değerleri normale döndürtükten sonra, bir bireyi temsil eden iki görüntünün değerlerini ekleyin. Bu değer grafiksel ve istatistiksel analiz için kullanılacaktır. Eğer deneysel tasarım birden fazla kopya içeriyorsa. İstatistiksel analizden önce ortalama çoğaltma değerleri.
Representative Results
Bu yordam, çoğu laboratuvar için hem uygun maliyetli hem de kolayca uyarlanabilen hücre geçişini incelemek için yeni bir yaklaşım belgeletir. Birçok çalışma hücre göçlerini değerlendirmek için hızlandırılmış mikroskobu kullanmaktadır, ancak bu yöntem için gerekli olan ekipman birçok laboratuvar için hazır değildir. Sınır çizimi için çizgilerve çizgiler kullanmak, pahalı ekipman kullanmadan farklı zaman noktalarında belirli ilgi alanlarını yeniden yakalama olanağı sağlarken(Şekil 1 & Şekil 3). Bu yeni yaklaşım için sınır çizimlerinin kullanımı şart olmakla birlikte, bu yöntemin bireysel araştırmacı ihtiyaçlarına göre uyarlanabilecek birçok alanı vardır. Protokol 24 saat uç noktası nı gösteriyordu; ancak, bu uç nokta tek bir laboratuvarın ihtiyaçlarına göre uzatılabilir. Protokolün bitiş noktasının ayarlanması, daha fazla kullanım için hücrelerin sürekli birliş culturing için izin verebilir. Buna ek olarak, bu protokol farmakolojik değiştiricilerin ve hücre dışı matris alt tabakalarının göç üzerindeki etkisini test etme esnekliğine izin verir. Son olarak, bu yöntemin en pahalı bileşeni lisanslı yazılım olabilir görüntüleme yazılımı, kullanımı, ancak lisanslı yazılım kullanımı tek seçenek değildir. Bu yöntemle çizgilerin ve büzüşme görüntülerinin oluşmasına olanak tanıyan diğer görüntüleme yazılımlarından yararlanılabilir. Buna ek olarak, bu yöntemin maliyet etkin ve uyarlanabilir doğası, çizik alanı faktoring hücre göçü incelemek için yeni bir yaklaşım sunuyor.
Bu yeni yaklaşım son zamanlarda Burr ve ark 2020 yılında non-diyabetik ve diyabetik kalplerden izole hücreler arasındaki kardiyak fibroblast göçü farklılıklarını değerlendirmek için kullanılmıştır20. Şekil 3 fibroblast göçünü değerlendirmek için kullanılan temsili görüntüler sunar. Bu görüntülerden, deney süresinin 24 saat boyunca diyabetik olmayan kalplerden 46, diyabetik kalplerden 129 fibroblastın göç ettiği tespit edilmiştir. Grup karşılaştırmaları üzerine, diyabetik kalplerden alınan hücre sayısı diyabetik olmayan kalplerden 2.8 kat daha fazla göç etmiştir(Tablo 1). Bu sonuçlar diyabetik kalplerden hücrelerin daha fazla göç ettiğini gösterse de, çizik alanı her iki grup için farklı olduğu için sayılar yanıltıcıydı. Diyabetik olmayan çizilme alanı ölçülen toplam alanın %24,78'i, diyabetik göç çizik alanının %16,77'si olarak ölçüldü. Çizik alanı düşünüldüğünde, diyabetik kalplerden gelen fibroblastların diyabetik olmayan kalplerden 4.13 kat daha fazla göç ettiğini gösteren bir oran (hücre sayısı/% scratch alanı) sağlanmıştır. Bu sonuçlar, göç tahlilleri yaparken göç alanının göz önünde bulundurulması açısından önemi vurgulamıştır.
Göç alanına normalleştirme hücre göçünün daha iyi ve daha titiz bir değerlendirmesini sağlar ve potansiyel insan hatasını inkâr eder. Açıklanan yöntem, düzgün ve tutarlı bir çizik sağlaması gereken bir P200 pipet ucu kullanırken, insan tutarsızlıkları nedeniyle düzensiz çizikler oluşabilir. Şekil 5, çizilme alanındaki faktoring farklılıklarının önemini vurgulamaktadır. Eğer bir tanesi sadece göç eden fibroblast ların sayısını karşılaştırırsa, Şekil 5A'nın Şekil 5B'yegöre göç eden hücre sayısının iki katı olduğunu gösterir. Çizilme alanı verileri normalleştirmek için kullanıldığında ise, fibroblastların göç alanına oranının şekil 5A ve Şekil 5B'debenzer olduğunu gösterir. Bu örnekte, farklı fibroblast izolasyonlarından tedavi edilmeyen diyabetik olmayan kardiyak fibroblastlar kullandık; bu nedenle Şekil 5'tekullanılan hücrelerin yapısı ndan dolayı benzer bir göç oranı beklenen sonuç olmalıdır. Eğer biri yalnızca geçirilen hücre sayısını sunuyorsa, çizilen alan tüm örneklerde düzgün ve tutarlı değilse, bu bulgu yanlış temsil edilebilir. Bu nedenle, bu yöntem le çizilen alanın yanı sıra diğer çizik geçiş tahlilleri ile hesaba katmak önemlidir. Şekil 5'te sunulan bu temsil edilen sonuçlar, çizilen alana geçirilen hücre sayısının normalleştirilmesinin doğru, yinelenebilir ve güvenilir geçiş verilerini nasıl sunabileceğini göstermiştir.
Şekil 1: Fibroblast çizik göçü için deneysel tasarımın diyagramı. Kurulum: Hücreleri iyi kaplamadan önce, plakanın altına bir çizgi ve 3 çizgi işareti çizin. 0 h: Kültür hücreleri kadar 95% birleştirme ve tasvir çizgi paralel bir çizik yönetmek. Orta çizginin üstünde ve altında bir bölüm seçerek 0 saat görüntüleri yakalayın. 24 saat: Sabitleme ve boyama dan önce hücrelerin 24 saat boyunca göç etmesine izin verin. 24 saat görüntüler için, geçirilen hücreleri yakalamak için 0 saat görüntülerle aynı konuma hizala. Çözüm: Geçiş alanını 0 saat görüntüüzerinde anahatve sonra geçiş ve alan görüntüleri oluşturmak için 24 saat görüntü üzerine 0 h görüntü bötürlü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Coomassie boyama gösteren temsili görüntüler hücrelerin görselleştirilmesi ile müdahale etmez. Kardiyak fibroblastlar ya kollajen (plastik çanak), diyabetik olmayan fare kuyruklarından izole edilen kollajen veya diyabetik fare kuyruklarından izole edilen kollajen üzerine kaplandı. Hücreler burada açıklanan yöntemlerden sonra çizik göç titresinde kullanılmıştır. Hücreler %1'lik Coomassie Brilliant Blue lekesi ile boyandı ve daha sonra göç eden hücrelerin görüntüleri yakalandı. Resimde gösterilen ölçek çubuğu 100 μm'dir. Kollajen izolasyonu ve/veya kollajen üzerindeki hücre göçü ile ilgili ayrıntılar Burr ve ark.20'desunulmuştur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Diyabetik olmayan ve diyabetik hücreler arasındaki kardiyak fibroblast göçündeki farkı gösteren temsili veriler. Diyabetik olmayan ve diyabetik farelerden izole edilen göç eden kardiyak fibroblast ların sayısını hesaplamak için kullanılan 0 saat ve 24 saatlik görüntüler (kırmızı çizgi, 20x'te ölçek çubuğu = 100 μm ile çekilen göç alanını ve görüntüleri tasvir eder). Diyabetik kardiyak hücrelerde 129 hücre %16.77'lik bir alanda göç etmiş ve bu da 7.69'luk bir göç oranına yol açmıştır. Diyabetik olmayan fibroblastlarda %24,78'lik bir alanla 46 hücre göç etmiş ve bu oran 1,86'ya yol açmıştır. Bu şekilde sunulan resimler Burr ve ark.20'de sunulan sonuçlarda kullanılmış, ancak burada gösterilen resimler Burr ve ark.20'degösterilmemiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Geçiş görüntüsünün alanının oluşumunu gösteren diyagram. Adım #1: Geçiş çizgileri içeren geçiş görüntüsünü açın. Adım #2: 24 saat görüntü kaldırılır ve görüntü alanında geçiş çizgileri bırakılı. Adım #3: Fırça aracı geçiş alanını doldurmak için kullanıldı. Adım #4: Görüntü gri tonlama dönüştürülür ve sonra yeni bir görüntü olarak kaydedilir. Ölçek çubuğu 100 μm'yi temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Farklı göç alanlarının fibroblast göçü üzerindeki etkisine bir örnektir. Diyabetik olmayan kardiyak fibroblastlar plastik kültür tabaklarına kaplanmış ve yukarıda açıklandığı gibi çizik göçü telinde kullanılmıştır (ölçek çubuğu = 100 μm). (A) 92 yüzde 35.4'lük bir alana sahip fibroblastlar göç etmiş ve bu da 2.60'lık bir göç oranına yol açmıştır. (B) 45 fibroblast% 17.57 bir alan ile 2.56 oranında hesaplar göç etti. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
|Fibroblast Tipi||Geçirilen Hücrelerin Ortalama Sayısı||Çizilme Lerin Ortalama Alanı||Hücre Numarasından Çizilen Alan Oranına|
|Diyabetik Olmayan Kalplerden Fibroblastlar||46||24.78%||1.86|
|Diyabetik Kalplerden Fibroblastlar||129||16.77%||7.69|
Tablo 1: Diyabetik olmayan ve diyabetik kardiyak fibroblastlar kullanılarak göç sıfırdan alınan göç verileri. Göç eden diyabetik olmayan ve diyabetik fibroblastların sayısı Şekil 3kullanılarak belirlenmiştir. Her görüntü için yüzde alanı açıklanan yöntemler ve ImageJ kullanılarak hesaplanmıştır. Göç oranı, göç eden fibroblast sayısının göç alanı nın yüzde ye bölünmesiyle hesaplanmıştır.
Discussion
Sıfırdan geçiş tadına yönelik bu yeni yaklaşım, araştırmacıların hücre geçişindeki değişiklikleri incelemeleri için daha erişilebilir bir yöntem sağlar. Bu tahlil diğer çizik tahlilleri benzer bir çizik yönetmek için aynı prosedürü takip ederken, görüntüleme ve hücre göçü10doğru analizi için yeni bir yöntem sağlar. Bu yöntem, hızlandırılmış mikroskopi ve canlı hücre görüntüleme odalarının ekipman yoğun yöntemlerini kullanmak yerine, yaygın olarak kullanılan laboratuvar ekipmanlarının kullanımını ayrıntılarıyla anlatır. Genel bir ters mikroskop ve kamera kullanarak, tutarlı kültür koşulları korurken aynı anda göç görüntüleri yakalayabilir. Buna ek olarak, bu yöntem gelişmiş ekipman kullanmadan ilgi aynı bölgenin kesin bir görüntüleme sağlar. Aynı geçiş alanını yakalamak, hücre geçişini belirlemedeki tutarsızlıkları azaltacak ve hücre geçişinin daha titiz ve doğru bir ölçümünün sağlanmasını sağlayacaktır. Son olarak, bu yöntem çizilme alanını dikkate alır. Çiziklerde insan varyasyonlarını en aza indirmek için dikkatli olmakla birlikte, tutarsızlıklar hala oluşabilir, hücre göçü analizinde normalleştirici bir faktör olarak alan kullanarak önemini gösteren. Genel olarak, yukarıda ayrıntılı protokol hücre geçişini değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan güçlü bir araca yeni bir yaklaşım sağlar.
Uyarlanabilir bir geçiş tonu geliştirmek araştırma için yeni yollar sağlar. Burada sunulan geçiş testinin belirli araştırma sorularını incelemek için değiştirilebilme yeteneği vardır. Belirli ilgi proteinlerinin aktive edilmesi veya inhibe edilmesi ile ilgili değişiklikler yapılabilir. Farmakolojik değiştiriciler (agonistler veya antagonistler) ve RNA paraziti gibi reaktifler göç ve belirli proteinler hakkındaki soruları yanıtlamak için göç öncesi, sırasında veya sonrasında göç tadına uygulanabilir. 48 iyi çanak küçük hacimli de başka bir maliyet-etkin yöntemdir değiştiriciler, daha düşük miktarlarda eklenmesini sağlar. Buna ek olarak, bu tetkik hücre dışı matris bileşenlerinin (ECM) hücre geçişi üzerindeki etkisini incelemek için değiştirilebilir. Son zamanlarda bu yöntemi uyguladık, hücre kültürü plakaları diyabetik ve diyabetik olmayan farelerden izole kollajen ile kaplanmış olan diyabetik ekstrasellüler matriksin kardiyak fibroblast göçü üzerindeki etkisini değerlendirmek için20. Bu çalışmada izole kollajen kullanılırken, bu yöntem ilgi olabilir diğer hücre dışı bileşenlere adapte edilebilir. ECM göçünün etkisini değerlendirme yeteneği, ECM'nin göç üzerindeki önemini gösteren birden fazla çalışma nedeniyle çok yararlıdır20,21,22. ECM proteinlerinin kullanımı ve kuyuların yüksek konsantrasyonlu ECM çözeltisi ile kaplanması ile ortaya çıkabilecek potansiyel bir komplikasyon, hücrelerin görselleştirilmesi üzerinde bir etkidir. ECM'nin hücrelerin görüntülenmesini görsel olarak bozup bozamayacağını görmek için bir kuyuyu kaplamak ve Coomassie mavisi ile lekelemek için kollajen gibi ECM kullanılması önerilir. ECM hücreleri görselleştirme bozarsa, ECM çözümlerini seyreltmek bu sorunu iyileştirir ve ECM'deki hücreleri görselleştirmeye olanak sağlar.
Eski bir teknikteki bu yeni yaklaşım bazı sınırlamalar sunar. Bu yöntem küçük bir ölçekte (48-iyi hücre kültür plakası) uyarlanmıştır ve kolayca daha büyük plakalara geçiş olmayabilir. Kuyunun büyüklüğü ve görüntülerde yakalanan alan nedeniyle bu protokol göç alanının büyük bir bölümünü belgeleyebilir. Ancak, bu yöntemi daha büyük iyi boyutlara genişletmek geçiş alanının daha düşük bir bölümünün yakalanmasına neden olabilir. Yakalanan görüntü sayısı artırılarak bu durum potansiyel olarak çözülebilir, ancak görüntülenerek görüntülenerek alınan geçiş alanının 24 saat görüntüler için yeniden tanımlanabilmesi için ek yöntemlerin uygulanması gerekebilir. Buna ek olarak, bu yöntem bir çizik geçiş tsay kullanılabilir hücreleri ile sınırlıdır. Geleneksel bir çizik göçü telinde yanıt veramayan hücreler bu makalenin içinde sunulan yaklaşım için ideal olmayabilir. Bu yaklaşımla ilgili bazı sınırlamalar olsa da, bu makalede ayrıntılı olarak kullanılan yöntemlerin değiştirilmesi bazı sınırlamaları hafifletebilir.
Sıfırdan geçiş tamlaması basit bir yaklaşım izler, ancak başarılı bir türete üretmek için izlenmesi gereken bazı kritik adımlar vardır. Önemli bir adım kuyunun altındaki işaretleri çizmektir. Eğer göstergeler kuyulara çizilmezse, 24 saat görüntü için görüntülenmeleri gereken alanı ayırt etmek ve aynı göç alanının yeniden yakalanmasını önlemek çok zor/imkansız olacaktır. Ayrıca, 0 saat görüntüde yakalanan 24 saat görüntüde aynı geçiş alanını yeniden yakalamak önemlidir. Aynı alan saat 24'te yakalanmazsa, görüntüleri geçiş için üzerine koymak mümkün olmayacaktır. Üstte bulunan görüntüler olmadan hangi hücrelerin göç ettiğini belirlemek mümkün olmayacaktır. Kapatılan görüntüler bu yaklaşım için önemlidir, çünkü hücre geçişi için doğru bir belirleme sağlarlar. Çizilme yöntemi her zaman düz çizilme çizgileri sağlamadığından, üst üste bindirilmiş görüntüler oluşturmak için doğru alanların görüntülenmesini çok önemlidir. Kapatılan görüntüler, bu makalenin içinde sunulan bu geçiş tamadı doğruluğuiçin temel oluşturur.
Sıfırdan geçiş tsanının yeni bir uyarlaması, hücre geçişini incelemek için daha erişilebilir ve esnek bir yaklaşım sağlar. Önceki hücre göçü çalışmaları, her laboratuvariçin yaygın olarak bulunmayan ekipman yoğun yöntemler kullanmaktadır. Daha geniş bir erişilebilirlik aralığına sahip bir geçiş telbettegeliştirilmesinin şart olduğunu belirtmek. Bu makale, hücre göçü ile ilgilenen araştırmacıların erişilebilirliğini artıracak eski bir tekniğe yeni bir yaklaşım açıklanmıştır. Buna ek olarak, bu yöntem hücre içi matriks bileşenleri veya farmakolojik değiştiriciler kullanımı yoluyla olsun, hücre göçü üzerindeki etkisini belirlemek için hücre kültürü ortamını değiştirmek için yeteneği sağlar.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, ABD Ordusu Tıbbi Araştırma Ödülü #81XWH-16-1-0710, Mississippi Üniversitesi Eczacılık Fakültesi ve BiyoMoleküler Bilimler Bölümü tarafından desteklenmiştir.
Materials
|Name||Company||Catalog Number||Comments|
|Adobe All Apps||Adobe||This includes Adobe photoshop which is the imaging software used with this protocol|
|Avant Pipette Tips 200ul Binding non-sterile||MIDSCI||AVR1||Tips are autoclaved to sterilize|
|AxioCam Erc 5s Camera||Zeiss||426540-9901-000|
|Coomassie Brilliant Blue R-250||Fisher Scientific||BP101-25|
|Costar Flat Bottom Cell Culture Plates 48 Wells||Fisher Scientific||07-200-86|
|DMEM with L-Glutamine, 1g/L glucose and sodium pyruvate||Fisher Scientific||MT10014CM|
|Image J||NIH||This is a free software offered by the US government and is the analysis software used with this protocol|
|Paraformaldehyde||Fisher Scientific||AC416785000|
|Premium US origin fetal bovine serum||Innovative Research||IFBS-HU|
|Primocin||InvivoGEN||ant-pm-2||This is the anitmicrobial used for with this procotol to culture cardiac fibroblasts|
|Zeiss Primovert Microscope||Zeiss||491206-0002-000|
|Zen Blue Edition 2.3 software||Zeiss||software comes with camera purchase|
References
- Gilbert, S. F. Developmental biology. Sinauer Associates, Incorporated. (1997).
- Luster, A. D., Alon, R., Von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nature Immunology. 6, (2005).
- Yahata, Y., et al. A Novel Function of Angiotensin II in Skin Wound Healing Induction of Fibroblast and Keratinocyte Migration by Angiotensin II via Heparin-Binding Epidermal Growth Factor (EGF)-like Growth Factor-Mediated EGF Receptor Transactivation. The Journal of Biological Chemistry. 281, (19), 13209-13216 (2006).
- Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. Cell Migration Single-Cell Migration. Comprehensive Physiology. 2, (4), (2012).
- Brand, S., et al. IL-22 is increased in active Crohn's disease and promotes proinflammatory gene expression and intestinal epithelial cell migration. American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 290, 827-838 (2006).
- Chi, Z., Melendez, A. J. Role of Cell Adhesion Molecules and Immune-Cell Migration in the Initiation, Onset and Development of Atherosclerosis. Cell Adhesion & Migration. 1, (4), 171-175 (2007).
- Chen, H., Nalbantoglu, J. Ring cell migration assay identifies distinct effects of extracellular matrix proteins on cancer cell migration. BMC Research Notes. 7, (183), 1-9 (2014).
- Stewart, J. A., Massey, E. P., Fix, C., Zhu, J., Goldsmith, E. C., Carver, W. Temporal alterations in cardiac fibroblast function following induction of pressure overload. Cell and tissue research. 340, (1), 117-126 (2010).
- Darby, I. A., Laverdet, B., Bonté, F., Desmoulière, A. Fibroblasts and myofibroblasts in wound healing. Clinical, Cosmetic and Investigational Dermatology. 7 (2014).
- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research - Reviews in Mutation Research. 752, (1), 10-24 (2013).
- Even-Ram, S., Yamada, K. M. Cell migration in 3D matrix. Current Opinion in Cell Biology. (17), 524-532 (2005).
- Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37, 208-215 (2005).
- Pijuan, J., et al. In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 1-16 (2019).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2, (2), 329-333 (2007).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3, (1), 107-124 (2011).
- Walter, M. N. M., Wright, K. T., Fuller, H. R., MacNeil, S., Johnson, W. E. B. Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates skin wound healing: An in vitro study of fibroblast and keratinocyte scratch assays. Experimental Cell Research. 316, (7), 1271-1281 (2010).
- Chaudhary, A., Bag, S., Barui, A., Banerjee, P., Chatterjee, J. Honey dilution impact on in vitro wound healing: Normoxic and hypoxic condition. Wound Repair and Regeneration. 23, (3), 412-422 (2015).
- Lipton, A., Klinger, I., Paul, D., Holleyt, R. W. Migration of Mouse 3T3 Fibroblasts in Response to a Serum Factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68, (11), (1971).
- Ascione, F., Guarino, A. M., Calabrò, V., Guido, S., Caserta, S. A novel approach to quantify the wound closure dynamic. Experimental Cell Research. (352), 175-183 (2017).
- Burr, S. D., Harmon, M. B., S, J. A. The Impact of Diabetic Conditions and AGE/RAGE Signaling on Cardiac Fibroblast Migration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2020).
- Chang, S. S., Guo, W. H., Kim, Y., Wang, Y. L. Guidance of Cell Migration by Substrate Dimension. Biophysical Journal. 104, 313-321 (2013).
- Nguyen-Ngoc, K. V., et al. ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, (39), 2595-2604 (2012).