Summary
Biz, küresel ya da lokalize gerginlik uygulama yanıt tek, yaşayan yapışık hücrelere kaynaklı nükleer ve iskelet deformasyonları ölçmek için, iki bağımsız, mikroskop tabanlı araçlar sunuyoruz. Bu teknikler, nükleer sertliği belirlemek için (yani, deformabilitesi) ve, çekirdek ve hücre iskeletinin arasındaki hücre içi kuvvet iletim prob kullanılır.
Abstract
Çoğu ökaryotik hücre çekirdeği büyük organel ve genellikle çevresindeki hücre iskeletinin daha 2 ila 10 kat daha sert, dolayısıyla çekirdeğin fiziksel özelliklerini, fizyolojik ve patolojik koşullar altında hücre genel biyomekanik davranış önemli ölçüde katkıda bulunur. Örneğin, nötrofil göç ve kanser hücreleri istila, nükleer sertlik dokuların içindeki dar alanlarda yoluyla ekstravazasyonu veya geçiş sırasında büyük bir engel teşkil edebilir. 1 Öte yandan, böyle bir kas gibi mekanik olarak aktif bir doku hücrelerinin çekirdeği için yeterli yapısal destek gerektirir tekrarlayan mekanik stres dayanacak. Önemlisi, çekirdeğinde sıkı bir şekilde hücresel mimarisine entegre; fiziksel polarize hücreler, nöromüsküler kavşaklarda sinaptik çekirdekleri örneğin çekirdeğin hücre içi hareket ve konumlandırma için kritik bir gereklilik, çevredeki hücre iskeletinin, bağlı, ya da göç hücrelerinde 2 şaşırtıcı değil, nükleer sertliği ve Nucleo iskelet kaplin belirlenmesinde kritik bir rol oynayan lamins ve nesprins gibi çekirdek zarı proteinleri mutasyonlar, bir numara da dahil olmak üzere insan hastalıkları, neden son zamanlarda gösterilen edilmiştir Emery- Dreifuss müsküler distrofi, kol, bacak-girdle musküler distrofi ve dilate kardiyomiyopati 3 biyofiziksel fonksiyonu çeşitli çekirdek zarı proteinleri ve belirli mutasyonların etkisini araştırmak için, tek, canlı hücrelerin çekirdeğinde fiziksel özelliklerini incelemek için deneysel yöntemler geliştirdik küresel veya lokalize mekanik pertürbasyon tabi. Tam olarak uygulandığında yüzey gerilme uygulama yanıt indüklenen nükleer deformasyonlar Ölçüm çekirdeğin deformabilitesi hakkında önemli bilgiler verir ve farklı mutasyon veya özel nükleer zarf proteinlerin eksik hücre hatları arasında kantitatif karşılaştırılmasına olanak sağlar. Bir microneedle lokalize sitoskeletal gerginlik uygulaması bu testte tamamlamak için kullanılır ve çekirdek ve hücre iskeletinin arasındaki hücre içi kuvvet aktarımı hakkında ek bilgi verim alınabilir. Bozulmamış canlı hücreler nükleer mekaniğinin incelenmesi, normal hücre içi mimariyi korur ve izole çekirdekleri ile çalışırken ortaya çıkabilecek potansiyel eserler önler. Ayrıca, yüzey gerilme uygulama, fizyolojik stres, kas hücreleri ve diğer dokulara (örneğin, damar düz kas hücrelerinin damar zorlamalara maruz) tarafından deneyimli iyi bir model sunar. Son olarak, bu araçların, öncelikle nükleer mekaniği çalışma geliştirilmiştir ise aynı zamanda iskelet proteinleri ve mechanotransduction sinyal fonksiyonu araştırmak için uygulanan olabilir.
Protocol
1. Yüzey gerilme uygulama
Normalize nükleer gerginlik ölçümü yemekleri üzerine hücreler, kaplama, ve (veya iki eksenli tek eksenli) suşu uygulama öncesinde, sırasında ve sonrasında görüntüleri alan hücrelerin, hücre kültürü yüzey olarak şeffaf, elastik silikon membran ile gerginlik yemeklerin hazırlanması içerir.
Silikon membran yemekleri ve hücrelerin bağlılık hazırlanması
- Her suş çanak çapı 3 ısmarlama dipsiz plastik tabak oluşur "ve hücre kültürü substrat olarak hizmet veren bir silikon membran, tutmak için plastik bir O-ring. Gerilme yemeklerin hazırlanması için, 4 kelepçe" x 4 "O-ring ve çanak arasında silikon membran parçası. dikkatlice, aşırı membran kesip, deiyonize su ile durulayın ve gerginlik yemekleri otoklavda.
- Ekstraselüler matriks molekülleri (örneğin, fibronektin) ile silikon membranlar membran kaplama öncesi alt merkezi (dışında) bir referans noktası Mark. Bu dönüm noktası gerilme deneyler sırasında aynı hücrelere belirlemenize yardımcı olacaktır. (Opsiyonel: tek eksenli gerilme uygulama için, iki paralel çizgiler seloteyip referans noktası etrafında bir boyut membran deformasyon kısıtlamak için uygulanır.)
- 10 ml PBS veya uygun herhangi bir ekstrasellüler matriks proteinleri seyreltilmiş 3 mikrogram / ml fibronektin ile optimum hücre eki, kat silikon membranlar sağlamak. Kapak, ters bir 10cm polistiren çanak gerginlik çanak ve 4 gece boyunca yemekler inkübe ° C
- Fosfat, aşırı protein kaldırmak için Tamponlu Salin (PBS) Ertesi gün, bir kez membranlar durulayın. Çanak büyüme orta 10ml (Dulbecco'nun Modifiye Eagles Orta (yüksek glukoz),% 10 fetal sığır serumu ve% 1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş) ile doldurun ve bir kenara koyun.
- Normal kültür koşulları altında 48 saat - 24 kaplı silikon membran çanak ve inkübe üzerine yaklaşık% 30 izdiham fare embriyonik fibroblastlar büyüme orta ve% 0.05 tripsin ve numaralı seribaşı tripsinize vardır.
Yüzey gerilme deneyleri
- Deneyler için mikroskop kadar ayarlayın. Deneyler, 60x objektif ve uygun görüntü alma yazılımı (örneğin, IPLab veya Metamorph) kullanarak bir inverted mikroskop, floresan mikroskobu, faz kontrast ya da DIC için uygun bir dijital kamera ile yapılmaktadır. Dik bir mikroskop, bu uygulama için uygun değildir. Gerinim Cihaz mikroskop sahneye uygun bir taban plakası oluşur ve merkezi bir silindirik silikon membran, hareketli plaka gerginlik çanak tutan bir merkez bölümüne gerginlik uygulamak için hizmet vermektedir merdane ve yukarı ve aşağı doğru kaydırın tutan dört rehberlik iğne, bir yük uygulamak için 5 kg ağırlık plakası gibi.
- Çekirdeklerin görselleştirmek için Hoechst 33.342 15 dakika için 1 mcg / ml, 37 suşu çanak hücrelerin inkübe ° C Aspire orta ve 15 ml fenol-kırmızı büyüme orta (% 10 fetal sığır serumu ve% 1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş fenol-kırmızı ücretsiz Dulbecco'nun Modifiye Eagles Orta (yüksek glukoz), 25 mM HEPES) ile değiştirin. Suşu çanak çanak tutucu plakası içine vidalayın. Dikkatlice merkezi merdane boyunca membran kayganlık sağlamak için silikon membran altındaki çevre gres (Braycote 804 Vakum Gres) uygulanır. Membran merkezi bölümünde açık tutmak için emin olun.
- Mikroskop sahneye taban plakası yerleştirin. Taban plakası dikkatle Mount çanak tutucu plakası. Ilk dinlenme pozisyonunda, gerginlik çanak silikon membran gevşek merkezi merdane dayanmaktadır sağlamak.
- İlk olarak, silikon membran alt odağı ve merkezi siyah referans nokta bulmak. Nokta, tüm görüntü satın almalar ve streç sırasında ve sonrasında aynı hücrelerin yerini yardımcı için başlangıç noktası olarak hizmet verecek. Biz hücre konumları depolamak için ve deneme sırasında bu hücreler taşınmaya özel bir yazılı otomatik görüntüleme programı kullanabilirsiniz, ancak bu da manuel olarak elde edilebilir.
- Noktadan başlayarak, hücreleri ve silikon membran üst görselleştirmek için odağı ayarlayın. Merkezi bulunan çekirdekleri ile iyi yayılmış hücreleri bulup bir faz kontrast ve floresan görüntü nükleer Hoechst bir leke elde. , Floresan görüntüleri çekirdeğin merkez düzlemine odaklanması gerektiğini, faz kontrast görüntü, hücre anahat ve silikon membran odaklanmak gerekir.
- 5 ila 15 hücre görüntüleri aldıktan sonra, merkezi nokta geri hareket ettirin. Yavaş yavaş çanağı merkezinde aynı suş uygulama sonucunda gerginlik çanak ağırlığı uygulanır. Uygulanan maksimum substrat gerginlik dikey hizalama pimleri (rehberlik pin) yerleştirilen naylon ayırıcılar ile sınırlıdır.
- Silikon membran alt odaklanın ve tekrar referans nokta bulun. Itibarennokta, aynı hücrelerin yerini değiştirin ve tekrar ilk görüntüler odak uçakları yakından maç için çalışırken, faz kontrast ve tam baskı altında hücreleri ve çekirdekleri bir floresan görüntü elde. Bu süreç aktif şekillenmesi ve gergin substrat hücre adaptasyonu önlemek için 10 dakika geçmemelidir.
- Ilgili tüm görüntüleri elde edildikten sonra, mikroskop aşamasında başlangıç noktasına geri hareket ettirin. Dikkatlice çanak tutucu plakası ağırlık kaldırmak ve silikon membran rahatlamasını sağlamak. Gerekirse, başlangıç pozisyonuna gelene kadar yavaşça gerginlik çanak yukarı itin. Sonra, faz kontrast ve gerilme görüntüler için yukarıda açıklanan sonrası gerginlik hücreleri floresan görüntü kazanır.
Analiz
- Görüntüler ve hücrelerin çekirdekleri, floresan etiketli gerginlik uygulama öncesinde, esnasında ve sonrasında normalize nükleer gerginlik hesaplamak için analiz edilir. Laboratuvarımızda analizi için özel bir yazılı MATLAB komut dosyası kullanıyorsanız, ancak birkaç alternatif seçenekler mevcuttur. Analizi üç adımda yapılır.
- İlk olarak, uygulanan substrat gerginlik hesaplamak için, membran üzerinde bulunan 3 ila 6 kontrol noktalarının konumları ilgili önceden tam ve sonrası deformasyon görüntüler arasında elle eşleştirilir. MATLAB programı daha sonra uygulanan membran gerginlik öncesi gerginlik ve tam suşu görüntüler ve aynı zamanda öncesi gerginlik ve sonrası gerginlik görüntüler arasında kalan zorlanma arasındaki kontrol noktaları eşleşen pozisyonlar karşılaştırarak hesaplar. Aynı zamanda, kontrol noktaları, hasarlı veya ayrılmakta hücre (bkz. Şekil 1) tespit etmek için yardımcı olacak çift, görüntü kaydetmek için kullanılır.
- İkinci adımda ise, elle çekirdekleri nükleer boyut veya ilgili önceden tam ve sonrası deformasyon floresan görüntüler arasında intranükleer belirteçleri ile eşleşen her bir çekirdeği nükleer gerginlik hesaplar ayrı bir MATLAB programı kullanılarak seçilir. Farklı deneyler arasında uygulanan membran zorlanma küçük varyasyonları için hesap için, sonuç olarak her çekirdeği için hesaplanan uygulanan membran zorlanma kaynaklı nükleer gerginlik oranı olarak tanımlanan Normalize Nükleer Strain, ifade eder. MATLAB komut isteği üzerine Lammerding laboratuar mevcuttur.
- Son olarak, her bir çekirdek, ayırmak ya da zorlanma uygulaması (Şekil 1) sırasında zarar gören hücrelerin ölçümleri hariç onaylanmıştır.
2. Microneedle manipülasyon tahlil
Yemekleri, yapışkan hücreleri ve microneedles hazırlanması
- 37 Hank Tamponlu Tuz Saline fibronektin düşük konsantrasyonda (0.5ug/ml) (HBSS) ya da 2 saat süreyle herhangi bir uygun ekstraselüler matriks proteinleri ile 35 mm cam alt hücre kültürü yemekleri inkübe ° C. Yemekleri HBSS iki kez yıkayın ve bir sonraki adıma geçmeden önce çanak 2 ml besi ekleyin.
- Fare embriyonik fibroblastlar fibronektin kaplı cam alt yemekleri üzerine 7.5 x 10 4 hücre / ml 2 ml besi numaralı seribaşı% 0.05 tripsin ve numaralı seribaşı ile tripsinize. Gecede geri inkübatörde Yeri hücrelerinin. Gecede geri inkübatörde Yeri hücrelerinin. Bir hücre sayısı diğer hücre türleri için tek yapışık olmayan konfluent hücreleri elde etmek için optimize etmeniz gerektiğini.
- Microneedles borosilikat camdan yapılmış, ticari bir pipet çektirmesi (örneğin, Sutter Instrument Company) ile yaklaşık 1 ila 3 mm çapları ucuna çekin.
Microneedle manipülasyon deney
- Ertesi gün, MitoTracker hücreler inkübasyon mitokondriyal leke (600 mcM; Invitrogen) ve Hoechst 33.342 nükleer leke (1 mcg / ml), 30 dakika 37 ° C inkübatör büyüme ortamına eklenir.
- Oda sıcaklığında 5 dakika HBSS hücreler bir kez yıkayın ve sonra görüntüleme için hücreler fenol-kırmızı besi ekleyin.
- Faz kontrast hücre iskeletinin takılı microneedle olmadan tek bir hücrenin tek bir görüntü elde mitokondriyal Hoechst 33.342 leke ve bir floresan görüntü bir floresan görüntü 60x objektif (0.70 NA, Plan-Achromat), ters bir leke , bir dijital şarj çiftli aygıt kamera ile mikroskop.
- Mikromanipülatör (örneğin, InjectMan NI 2, Eppendorf), bir hücre nükleer çevre uzakta sabit bir mesafe (genellikle 5 mikron) sitoplazma içine dikkatlice microneedle eklemek ve bir faz kontrast görüntü, Hoechst 33.342 floresan görüntü almak leke ve leke mitokondriyal bir floresan görüntü. Bu uygulama için, tutarlı mikromanipülasyon prosedürleri elde etmek için, örneğin, bir bilgisayar aracılığıyla Windows Hyperterminal, mikromanipülatör kontrol etmek için yardımcı olur.
- Eş zamanlı olarak floresan, faz kontrast görüntüler her 10 toplarken microneedle, belirli bir mesafe 1 mm / sn hücre çevreye doğru hareket ettirin (genellikle 10 veya 20 mikron)saniye. Microneedle hücre çevre doğru belirli bir mesafe için hareket ediyor. Microneedle hücre çevre doğru belirli bir mesafe hareket olarak seçilen parametreler ile, bu manipülasyon işlemi sırasında 2-3 kare karşılık gelir.
- Son microneedle hücre iskeletinin kaldırıldıktan sonra ek görüntüler elde.
Analiz
- Deplasman haritalar, çekirdek ve sitoplazma izleme floresan etiketli özelliklere dayalı özel bir yazılı MATLAB komut dosyası kullanılarak hesaplanır. (MATLAB komut dosyası istek üzerine Lammerding laboratuar temin edilebilir). Bu program, bir sonraki görüntü kareleri küçük görüntü bölgelerde (yaklaşık 10 mm x 10 mm boyut ve arayla 5 mikron) arasında normalize çapraz korelasyon algoritması kullanır. Her bölge merkezi için, deplasman x-ve y-yönünde özgün konumu ve yeni tanımlanan bir pozisyon arasındaki değişim olarak hesaplanır ve bir öteleme vektörü olarak gösterilir ve aynı zamanda sayısal değerler olarak saklanır. Displacement haritaları, önceden tanımlanmış bölgeler içinde ortalama değiştirmeler hesaplanır. Hoechst 33.342 sinyale karşılık gelen floresan kanal nükleer değiştirmeler hesaplanır sitoskeletal deplasmanları, floresan sitoskeletal belirteçleri (örneğin, MitoTracker mitokondriyal leke) için kanal dayandığını unutmayın. Bizim uygulama için, aşağıdaki bölgeler rutin incelemek; gerginlik uygulama yeri doğru çekirdek içinde bir bölge (ii) nükleer gerginlik; (i) (iii) nükleer gerginlik uygulama sitesi, yani microneedle ekleme sitesi sitoskeletal gerginlik uygulama yeri uzak bir nükleer bölgede zorlanma ve (iv) sitoskeletal gerginlik sitoplazmik çekirdeği çapında bir bölgede. Buna ek olarak, bir de doğrudan faz kontrast veya Hoechst 33.342 floresan görüntü dizileri nükleer uzama ölçebilirsiniz. Bu durumda nükleer gerginlik, nükleer uzama (ΔL = L - L 0) bölünmesi ile hesaplanır uygulanan L, gerilme uygulama ve L 0 sonunda çekirdeğin son uzunluğu başlangıç uzunluğu, L 0 çekirdeğin başlangıç uzunluğu. Nucleo-iskelet sağlam bir kaplin ile hücre çekirdeği gerilim uygulama yeri doğru uzayacaktır. Buna karşılık, Nucleo-iskelet kaplin, yani bozulur hücreleri, kuvvet iskeleti ve çekirdeği arasında daha verimli bir şekilde iletilir, çekirdek gerginlik uygulama sitenin yönde önemli ölçüde daha az uzamasına bekleniyor. Böylece, çekirdek ve hücre iskeletinin arasında (kısmi) uncoupling anlamına sitoskeletal gerginlik uygulaması yanıt nükleer deformasyonlar azaldı.
3. Temsilcisi sonuçları:
Yüzey gerilme uygulama
Biz sırasında, önce görüntüleri elde ve A / C eksikliği heterozigot ve homozigot Lamin fare embriyonik fibroblastlar gerilme uygulama sonrası (Lmna + / - ve Lmna - / -) daha sonra, wild-tip (Lmna + / +) fareler ve her hücre için normalize nükleer gerginlik hesaplanır. Analizinden sonra, çekirdekleri doğrulanır ve hücrelerin hasar görmesine ya da gerginlik başvuru sırasında geri çekme analiz dışında tutulmuştur. Şekil 1B analiz dışında olmalıdır hücreleri gösteriyor ise Şekil 1A, geçerli üç hücre çekirdekleri gösteriyor. Normalize nükleer gerginlik verileri en az üç bağımsız deneyler (her biri ~ 5-10 çekirdekleri ölçümleri içeren) toplanmış ve istatistiksel analizi ile diğer hücre ya da tedavi grupları ile karşılaştırılmıştır. Artan normalize nükleer gerginlik azalır nükleer sertlik, A / C (Şekil 2) Lamin çekirdek zarı proteinleri azalmış ekspresyonu ile hücrelerde görüldüğü gibi gösterir.
Microneedle manipülasyon tahlil
Microneedle manipülasyon tahlil için, lokalize sitoskeletal gerginlik uygulama sırasında nükleer ve iskelet değiştirmeler görüntülenmiş. Hasar görmüş ya da müstakil hale Hücreler analize dahil. Analizi için, kuvvet uygulama sitesi tek, yapışık hücrelere karşı nükleer ve iskelet hareketleri büyüklüğünü ölçer. Örneğin, Şekil 3, mitokondriyal (hücre iskeleti için işaretleyici) deplasmanları sitoskeletal gerginlik öncesi ve sonrası takip ve sonra vektör olarak değiştirmeler arsa. Her vektör özgün konumu ve yeni tanımlanan pozisyonu arasında vardiya olarak hesaplanan deplasman temsil eder. Görüntü yoğunluğu düşük ya da yetersiz doku (örneğin, hücre dışına bölgeler) Bölgeler analiz dışında tutulmuştur. Iskelet ve nükleer değiştirmeler sonra artan gerginlik uygulama sitesinden mesafeler (Şekil 4, renkli bo ilgili alanlarda belirli alanlarda sayısaliçerlek olarak XES). Sağlam Nucleo sitoskeletal kaplin ile fare embriyonik fibroblastlar, güçleri yavaş yavaş gerilme uygulama sitesi (Şekil 4) dağıtmak başlatılan nükleer ve iskelet deformasyonları, tüm hücreleri aracılığıyla iletilir. Buna karşılık, rahatsız Nucleo-iskelet kaplin (veya değiştirilmiş sitoskeletal kuruluş) ile fibroblastlar, Şekil 4'te gösterildiği gibi uygulama alanının yakınında lokalize değiştirmeler ve daha uzağa sadece küçük indüklenen deformasyonlar ekran. Microneedle ekleme sitesi (turuncu kutu) Karşılaştırılabilir sitoskeletal gerginlik uygulaması her iki kontrol fibroblastlar (mCherry tek başına) ve kesintiye Nucleo sitoskeletal kaplin (DN Kash) ile fibroblastlar görülmektedir. Ancak, diğer bölgelerde başlatılan nükleer ve sitoskeletal değiştirmeler (mavi, sarı ve kırmızı kutuları) kontrolü hücreleri (mCherry tek başına) (Şekil 4) daha kesintiye Nucleo-hücre iskeletinin kaplin (DN Kash) ile fibroblastlar anlamlı olarak daha küçüktü. Böylece, gerilme uygulama yeri uzak iskelet ve nükleer değiştirmeler azalma, hücre iskeleti ve çekirdek arasındaki kuvvet aktarımı rahatsız gösterir.
Da önemlisi, biz de, GFP veya mCherry aktin ve GFP-vimentin ile transfekte ve floresan Mitotracker Yeşil veya Kırmızı etiketli fare embriyonik fibroblastlar üzerinde microneedle manipülasyon yaparak, mitokondri uygun sitoskeletal işaretleyici olduğunu onaylamıştır. Sitoskeletal deplasman haritalar mitokondri ve aktin ve vimentin hücre iskeletinin floresan sinyal bağımsız olarak hesaplandı. Ortalama mutlak deplasman, gerilme uygulama yeri uzak artan mesafelerde, dört ayrı sitoskeletal bölge için hesaplanmıştır. Mitokondri ve aktin ve vimentin, elde edilen ölçümler arasındaki lineer regresyon eğim ve R-kare değerleri hesaplandı. Aktin için eğim 0.99 ve R 2 değeri 0,986; vimentin, eğim 1.04 ve R2 değeri mitokondriyal değiştirmeler iskelet deformasyonları için güvenilir bir göstergesi olarak hizmet ettiğini teyit 0,971.
Şekil 1. Fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) Yüzey gerilme uygulama silikon membranı iki farklı alanda yayılmış Fare embriyonik fibroblastlar% 20 tek eksenli gerilme uygulama sırasında ve sonrasında, önce faz kontrast ve floresan mikroskobu ile görüntülenmiş. (A) Örnek gerginlik uygulama, herhangi bir hasar ya da dekolmanı ve gerginlik uygulama sırasında kısmen müstakil / geri çekme hücreleri (B) örneği olmadan hayatta hücrelerin geçerli çekirdekleri ile başarılı bir deney; tasvir hücreleri elde edilen sonuçlar (B) hariç. analiz. Sağ tarafında hücre suşu uygulama sırasında kısmen ayırır ve geri çekilmeler (B), sol tarafında hücre, iskelet hasarı ve nükleer çöküşü (ok) belirtileri gösterir. Bu aşırı zorlanma uygulamasının bir göstergesi olabilir. Daha iyi bir karşılaştırma için, (A) ve (B) gerilmemiş hücre zarının bir sınır kırmızı özetlenen ve gerginlik uygulama sırasında ve sonrasında aynı hücre üzerine bindirilmiş. (A) gerilmemiş çekirdeğin sınır yeşil özetlenen ve gerginlik uygulama sırasında ve sonrasında aynı çekirdeği üzerine bindirilmiş.
Şekil 2. Farklı MEF hücre hatları bir panel normalize nükleer gerilme analizi Lmna MEFS - / - ve Lmna + / - genetik arka plan ektopik ya boş bir vektör ya da yabani tip Lamin A incelendi ifade. Tarafından yansıtılan yabani tip littermates (Lmna + / +), Lamin kaybı MEFS kıyasla tamamen yabani tip Lamin A yeniden yerleştirilmesi tarafından restore edilebilir azalmış nükleer sertliği A / C ifadesi sonuçları, özellikle nükleer sertliği azaltılmış normalize nükleer gerginlik artan değerler. Hata çubukları standart hataları temsil eder.
Şekil 3. Intrasellüler kuvvet aktarımı ölçmek için Microneedle manipülasyon tahlil Faz kontrast (A, B) ve floresan (C, D) nükleer leke (mavi) etiketli bir fibroblast görüntüleri ve mitokondriyal leke (yeşil) MitoTracker. Microneedle çekirdeği (A ve C) belirli bir mesafe hücre iskeletinin içine yerleştirilir ve daha sonra hücre çevre (B, D) doğru taşındı. Iskelet ve nükleer değiştirmeler yazılmış özel bir çapraz korelasyon algoritması kullanılarak izleme floresan etiketli çekirdek ve mitokondri tarafından ölçüldü. (E) floresan görüntü serisi hesaplanan nihai sitoskeletal Displacement map (yeşil) deformasyonlar, ok uzunluğu, daha iyi güvenlik ve geniş için 2x tarafından büyütülmüş.lity. Ölçek barlar, 10 mm.
Şekil 4. Microneedle manipülasyon sırasında hücre içi kuvvet aktarımı Analizi renkli kutulara ilgili alanlarda (A İçerlek) olarak ölçülür, microneedle manipülasyon sırasında iskelet ve nükleer değiştirmeler İndüklenmiş. Turuncu bir kutu gerginlik uygulama sitesidir. Indüklenen hücre iskeletinin (turuncu kutu), nükleer ve iskelet değiştirmeler (mavi, sarı ve kırmızı kutuları) benzer bir gerginlik uygulama rağmen kesintiye Nucleo sitoskeletal kaplin (DN Kash) kontrole göre (fare embriyonik fibroblastlar anlamlı olarak daha küçüktü mCherry tek başına) hücreleri.
Discussion
Yüzey gerilme tahlil
Gerilme uygulamanın başarıyla mekanik strese maruz hücre kaynaklı nükleer deformasyonlar ve çalışma nükleer sertliği belirli bir çekirdek zarı proteinleri katkısını araştırmak için bize ve diğer gruplar tarafından kullanılmıştır. 4-8 Bu tekniğin avantajı, mekanik özellikleri probları çekirdekleri, normal hücresel ve hücre iskeleti çevre ve yaşam yüzey gerilme uygulama gibi, kas ve kan damarı duvarlarının müteahhitlik gibi birçok dokuda bulunan fizyolojik yük uygulama andırıyor. 9 Ayrıca, sayısını artırarak, paralel olarak birçok hücre suşu uygulama sağlar hücreleri tek bir deneyde analiz edilebilir. Substrat suşu testinin bir sınırlama, doğrudan nükleer sertlik ölçümleri izin vermediği. Bunun yerine, bu yöntem, çekirdeğin çevresindeki hücre iskeletinin karşılaştırıldığında göreli rijitlik belirler. Yabani tip hücre, iskelet gerilme uygulanan substrat gerginlik karşılaştırılabilir olduğunu eksenli yüzey gerilme gösterisi tabi hücreleri indüklenen nükleer ve iskelet suşu detaylı analizi, sert çekirdeği önemli ölçüde daha az deforme ise 4 Bununla birlikte, ek testleri gibi microneedle manipülasyon tahlil, farklı hücre hatları arasında nükleer deformasyon gözlenen farklılıklar sonuçları değişmiş Nucleo sitoskeletal kaplin veya iskelet yapısı olmadığını sağlamak için gerekli olabilir. Bu kısıtlamalara rağmen, sağlam hücreler yerine izole çekirdeklerindeki nükleer mekaniği ölçüm, ozmotik etkileri, izolasyon prosedürü sırasında hasar veya nükleer izolasyonu ile ilgili diğer değişiklikler ile indüklenen eserler riskini en aza indirir. Ancak, substrat suş tayini için bir sıkı ihtiyacı hücreler yüzeye sıkıca uymanız. Hücresel adezyon artırmak için, yemekler, fibronektin, kolajen ya da değişken konsantrasyonlarda laminin gibi farklı ekstraselüler matriks proteinleri ile kaplı olabilir; deneylerde kullanılan her yeni hücre tipi için en uygun kaplama koşullarının belirlenmesi önerilir.
Ayrıca, en iyi sonuçlar için, uygulanan substrat gerginlik hücrelerin zarar görmesini en aza indirirken, nükleer deformasyonları tespit etmek için yeterince büyük olmalıdır. Fare ve insan fibroblastlar için, biz genellikle belirgin hücre hasarı olmaksızın% 5 iki eksenli gerilme veya% 20 tek eksenli gerilme uygulanır. Genel olarak, membran alanda küçük değişiklikler gerekli olan hücreler, tek eksenli gerilme uygulaması iki eksenli gerilme uygulama daha iyi tolere bulabilirsiniz. Ekstraselüler matriks kaplama olarak, gerilme uygulama optimal koşullarda test edilecek her yeni hücre hattı için tespit edilmelidir.
Buna ek olarak, deneylerde hücre yoğunluğu duyarlı olduğunu buldu. Deneyler ideal hücre-hücre etkileşimleri en aza indirmek için alt-konfluent hücreleri üzerinde yapılan olmalı, ancak çok düşük hücre yoğunlukları genellikle zorlanma yanıt ve deneyler başına hücre düşük bir verim hücrelerin kötü sağkalım ile sonuçlanabilir. Öte yandan, çok yüksek bir hücre yoğunluğu zor sırasında, önce aynı hücreleri tespit ve gerginlik uygulamasından sonra yapar. Biz bireysel hücre tipleri için en uygun hücre yoğunluğunu test etmek için önerilir.
Deneyler için diğer bir önemli tavsiyem, gerginlik uygulama iskelet elemanları itilme gibi hücresel adaptasyon, önlemek için 10 dakika veya daha az sınırlı olmalıdır. Bu amaçla, otomatik görüntüleme yazılımı, örneğin IPlab, motorlu bir sahne ile birlikte kullanımı, deformasyon çanağı ve daha hızlı görüntü elde etme hücreleri otomatik olarak yeniden yerelleştirme sağlar. Ayrıca, veri analizi için özel olarak yazılmış bir görüntü analiz yazılımı (örneğin MATLAB) kullanın. Yazılım, uygulanan nokta, küçük floresan boncuklar veya silikon membran üzerinde belirgin düzensizlikler olarak uygulanan bir substrat gerilme, membran hesaplamak için bazı marker noktaları gerektirir. Son olarak, bu hücrelerin ölçülen nükleer deformasyonlar temsilcisi değildir, her çekirdeğin doğrulama, hasarlı ya da geri çekilmeden hücrelerin bu dışlamak için gereklidir. Yüzey gerilme tekniği olası bir uyum, daha fizyolojik şartlar altında nükleer mekanik özellikleri analiz yanı sıra daha zayıf yapışık hücrelere yöntemini uygulamak için izin verir, üç boyutlu kolajen jeller, kültür hücreleri substrat gerginlik uygulamaktır. Başka bir varyasyonu micropatterned substratlar, silikon membran fibronektin örneğin, yuvarlak ya da dikdörtgen yamaları, zorlanma uygulama sırasında tutarlı yayılan hücre ve uyum sağlamak için kullanmak. Son olarak, daha fizyolojik bir düzeyde nükleer mekaniği daha iyi anlamak için, hücresel suşu izole hücrelerinin yerine tüm dokular üzerinde uygulanabilir. Şu anda başarılı bir model organizasy nükleer sertliği ölçmek için bu tekniği kullanarakDrosophila melanogaster veya Caenorhabditis elegans gibi nisms.
Microneedle manipülasyon tahlil
Microneedle manipülasyon tahlil, böylece, Maniotis ve arkadaşları tarafından öncülük daha önceki bir yaklaşım ilerleyen lokalize sitoskeletal gerilme uygulama sonrası başlatılan nükleer ve iskelet değiştirmeler niceleme intrasellüler kuvvet aktarımı prob tek bir hücre tabanlı bir yöntemdir. 10 Bu teknik diğer lokalize gücü üzerinde çeşitli avantajlar sunuyor uygulama yöntemleri, manyetik cımbız veya optik tuzakları gibi. Örneğin, hücre iskeletinin gerginlik doğrudan uygulanabilir olabilir ve microneedle mesafe değişen modifiye edilebilir. Microneedle deney çok tekrarlanabilir hale yüksek doğruluk ile hücre yerleştirilmiş olabilir ve microneedle hız doğrudan ilgili kuvvet uygulama oranı, tam olarak programlanmış mikromanipülatör tarafından kontrol edilebilir. Buna karşın, manyetik boncuklar, manyetik cımbız ve optik tuzakları kullanılan genellikle rastgele apikal hücre yüzeyinde lokalize ve hem optik ve manyetik cımbız, birçok hücre tipleri büyük ölçekli sitoskeletal deformasyonlar sonucu yetersiz kuvvetler oluşturmak. Microneedle manipülasyon testinin invaziv bir tekniktir ve iskelet yapıları microneedle yapışır, daha az invaziv yaklaşımlar (örn. substrat suşu) sonuçları onaylamak üzerinde sınırlı bir kontrolü var olmasına rağmen. Böylece, microneedle manipülasyon ve substrat zorlanma iki tamamlayıcı testleri normal nükleer ve iskelet mimarisinin korunması ve doğru kimyasal bileşimi, çekirdek plazması ve sitoplazma korurken bozulmadan yaşayan hücrelerde nükleer mekaniği hakkında bilgi verir.
Aşağıda, olası değişiklikler veya iyileştirmeler öneririz. Hücreleri çok iyi yayılmış ince (1-2 mikron) hücre iskeletinin içinde konumlandırmak için çalışırken, microneedle bir ucu cam alt çanak karşı kırılabilir. Bu sorunları önlemek için, biz hücreleri çok ince yaymak için izin vermeden, yeterli hücre adezyon elde koşulları belirlemek için, fibronektin, kollajen ve laminin gibi ekstrasellüler matriks (ECM) moleküller, konsantrasyonları bir dizi test öneririz. Başka bir değişiklik de, tek tip hücre yayılmasını ve oryantasyon sağlamak için micropatterned ECM-kaplı yüzeylerde hücreleri plakaya olabilir. Ilave ya da tamamlayıcı bir yaklaşım ECM-kaplı poliakrilamid jeller plaka hücrelere ve hücre iskeletinin tektip gerginlik uygulanmasını sağlamak için jel hücre iskeletinin üzerinden microneedle eklemek olabilir. Sağlam ve ince uçlu bir microneedle deneylerin başarısı için kesinlikle gereklidir. Biz rutin olarak kendi microneedles çekin ve biri farklı şekil ve boyutları ile deneme yapabilirsiniz. Alternatif olarak, bir de (örneğin, Eppendorf Femtotips) ayrı ayrı paketlenmiş microneedles tutarlı geometri ile satın alabilirsiniz. Her durumda, microneedle kırık bir microneedle ucu, cam yüzey ile birlikte temas yaptıktan sonra, hücreleri zarar verir, örneğin, deneyler sırasında hasarsız kalmasını sağlamak için çok önemlidir. Microneedle manipülasyon prosedürü sırasında, çekirdek ve hücre iskeletinin zamana bağlı davranış viskoelastik malzemeler olarak, tutarlı bir hız ve microneedle hareket aralığı uygulamak için önemli bu. Biz aynı zamanda, microneedle hareket ve görüntü elde koordinasyon içinde yardımcı olacak bir bilgisayar kontrollü mikromanipülatör, kullanmanızı öneririz. Tecrübemizi Mitotracker sitotoksik, böylece, 30 dakika deneyler sınırlamak veya diğer floresan işaretleri, GFP-aktin veya GFP-vimentin gibi kullanabilirsiniz. Nucleo-iskelet kaplin eğitim yaklaşımın bir değişiklik, özellikle burada açıklanan microneedle, yerine hücre iskeletinin çekirdeği içine yerleştirin ve hücre çevreye doğru hareket ettirmek için.
Deneyler genellikle büyük hücre-hücre değişkenliği nedeniyle tüm çalışmalar için en az 15-25 toplam geçerli hücrelerinin bir ölçüm elde etmek için, en az üç bağımsız kez olmalıdır.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma, Ulusal Sağlık (R01 HL082792 ve R01 NS059348) ve Brigham ve Kadın Hastanesi Kalp ve Damar Liderlik Grubu Ödülü Enstitüleri tarafından da desteklenmiştir.
Materials
|Name||Company||Catalog Number||Comments|
|Fibronectin||EMD Millipore||FC010|
|MitoTracker Red FM and Green FM||Invitrogen||M22425 and M-7514|
|H–chst 33342||Invitrogen||H3570|
|Hank’s Buffered Salt Saline||Invitrogen||14185|
|Phenol free, DMEM||Invitrogen||21063|
|Fetal bovine serum||Aleken Biologicals||FBSS500|
|Penicillin/Streptomycin||Sigma-Aldrich||P0781-100ML|
|Borosilicate Glass with filament||Sutter Instrument Co.||BF100-78-10|
|Gloss/Gloss non-reinforced silicone sheeting, 0.005"||Specialty Manufacturing Inc.|
|Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline||Invitrogen||14200|
|35 mm glass bottom culture dishes (FluoroDish)||World Precision Instruments, Inc.||FD35-100|
|Braycote 804 Vacuum Grease||SPI Supplies||05133A-AB|
References
- Friedl, P., Wolf, K., Lammerding, J. Nuclear mechanics during cell migration. Curr Opin Cell Biol. 23, 55-64 (2011).
- Mejat, A., Misteli, T. LINC complexes in health and disease. Nucleus. 1, 40-52 (2010).
- Worman, H. J., Fong, L. G., Muchir, A., Young, S. G. Laminopathies and the long strange trip from basic cell biology to therapy. J Clin Invest. 119, 1825-1836 (2009).
- Caille, N., Tardy, Y., Meister, J. J. Assessment of strain field in endothelial cells subjected to uniaxial deformation of their substrate. Ann Biomed Eng. 26, 409-416 (1998).
- Lammerding, J. Lamins A and C but not lamin B1 regulate nuclear mechanics. J Biol Chem. 281, 25768-25780 (2006).
- Lammerding, J. Abnormal nuclear shape and impaired mechanotransduction in emerin-deficient cells. J Cell Biol. 170, 781-791 (2005).
- Lammerding, J. Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction. J Clin Invest. 113, 370-378 (2004).
- Verstraeten, V. L., Ji, J. Y., Cummings, K. S., Lee, R. T., Lammerding, J. Increased mechanosensitivity and nuclear stiffness in Hutchinson-Gilford progeria cells: effects of farnesyltransferase inhibitors. Aging Cell. 7, 383-393 (2008).
- Brooks, S. V., Zerba, E., Faulkner, J. A. Injury to muscle fibres after single stretches of passive and maximally stimulated muscles in mice. J Physiol. 488, 459-469 (1995).
- Maniotis, A. J., Chen, C. S., Ingber, D. E. Demonstration of mechanical connections between integrins, cytoskeletal filaments, and nucleoplasm that stabilize nuclear structure. Proc Natl Acad Sci. 94, 849-854 (1997).