Isabella, 22 Nisan 1451'de, Kastilya Krallığı'nın (şu anda İspanya topraklarında bulunan) Avila eyaletinin Madrigal de las Altas Torres bölgesinde doğdu. Babası Kastilya Kralı II. John, annesi ise Portekizli Isabella'dır. Doğumuyla beraber üvey ağabeyi Kastilyalı IV. Henry'den sonra tahtın ikinci vârisi oldu. Fakat öz erkek kardeşi Kastilyalı Alfonso'nun kendisinden iki yıl sonra doğmasıya birlikte veraset sırasında üçüncülüğe düştü.
Kastilya Kralı II. John 1454'te öldü ve yerine, Isabella'nın üvey ağabeyi IV. Henry geçti. Isabella ve kardeşi Alfonso, Arevalo'ya taşındı. Bu dönemde Isabella ile Alfonso, ölen babalarının vasiyetinin Kral IV. Henry tarafından uygulanmaması sebebiyle fakirlikle mücadele etmek zorunda kaldı. Isabella bu dönemde dinî bir eğitimden geçti.
Kral IV. Henry'nin Joanna adında bir kızı olunca, Isabella ile Alfonso Segovia'ya nakledildi ve Kral'ın bizzat gözetimi altında tutulmaya başlandı. Isabella, Kraliçe Portekizli Joan'ın kalesinde kalmaya başladı. Bu dönemde Isabella'nın hayat standardı yükseldi. Daha iyi bir eğitim almaya ve eğlenceli bir hayat sürmeye başladı. Fakat Kral'ın, ülkedeki karışıklıklar sebebiyle bunları yasaklaması üzerine Isabella Segovia'dan ayrıldı.
Alfonso, taht üzerinde hak iddia etmeye başladı ve 1467'de, Kral'ın ordusuyla çarpıştı. İkinci Olmedo Muharebesi berabere bitti. Kral, Alfonso'dan, kendi kızı Joanna ile evlenmesini istedi. Alfonso Joanna ile evlendi ve Austrias Prensi unvanını aldı. Fakat Temmuz 1468'de öldü. Isabella'dan, öz ağabeyinin yerine geçmesi istendi. Kral ile Isabella bir uzlaşmaya vardı ve 19 Eylül 1468'de Toros de Gusando Antlaşması imzalandı. Isabella artık bir sonraki vâristi.
Bu verasetle beraber Isabel'in evliliği konusu gündeme geldi. Portekiz, Aragon ve Fransa'dan evlilik teklifleri geldi. Kral IV. Henry, Isabella'nın Portekiz Kralı V. Afonso'yla evlenmesini istemekteydi. Fakat Isabel, Aragon Kralı Ferdinand'la evlenmeyi uygun buldu ve onunla Ekim 1469'da evlendi. Böylelikle Kastilya ile Aragon Krallıkları birleşerek İspanya'nın temeli atılmış oldu. Kral IV. Henry, yaptıkları antlaşmaya uymaması gerekçesiyle Isabella'nın, verasetini feshetti ve kendi kızı Joan'ı yeni vâris tayin etti.
Isabella'nın Ekim 1470'te aynı adlı bir kızı oldu.
Kral VI. Henry Aralık 1474'te öldü. Kastilyalı asiller, Kardinal Mendoza ve Amiral Engiques tarafından desteklenen Isabella, Leon ve Kastilya Kraliçesi olarak ilan edildi. Karşı cenahta ise Kral'ın kızı Joan vardı. Portekizli V. Alfonso, Mayıs 1475'te Kastilya'yı işgal etti ve Joan'la nişanlandı.
Ağustos 1475'te Segovia'da ayaklanma çıktı. Isabella ordusuyla onları bastırdı ve şehir meydanına giderek isyancılarla konuştu. Haziran 1478'de oğlu John doğdu. Böylelikle Isabella'nın kraliçe olarak konumu, vâris olacak erkek bir evlat doğurmasıyla yasallaştı.
Bu dönemde Kastilya ve Portekiz orduları, Atlantik Okyanusu hâkimiyeti için savaşmaya başladı. Dört yıl devam eden savaş, Kastilyalıların kara, Portekizlilerinse deniz zaferiyle sonuçlandı. 4 Eylül 1479'da Alcaçovas Antlaşması imzalandı. Portekiz Kastilya tahtından vazgeçti, buna karşılık Kastilya'da bulunan Atlantik toprakları Portekiz'e verildi. Isabella'nın Kastilya Kraliçeliği bu antlaşmayla tanınmış oldu.
Isabella ile Ferdinand ülke tahtına oturduktan sonra birçok reforma girişti. Yönetim sistemini yeniden organize etti. 1476'da, 'Santa Hermandad/Kutsal Kardeşlik' adı verilen kolluk kuvvetleri uygulamaya konularak ülkedeki suç oranı düşürüldü. Kral IV. Henry'nin bıraktığı borçlar azaltıldı. Kristof Kolomb'un 1492'deki Yeni Dünya seyahati finanse edildi. İber Yarımadası'ndaki Müslümanların ortadan kaldırılmasını amaçlayan 'Reconquista/Yeniden Fetih' projesi 1492'de tamamlandı. Direnişi kırılan Müslümanlar Afrika'ya sürüldü. Isabella ile Ferdinand, Papa VI. Alexander tarafından 'Katolik Kral ve Kraliçe' unvanını aldı.
Kastilya Kraliçesi I. Isabella 26 Kasım 1504'te öldü.