Tıbbi Genetikteki Uygulamalar – Laboratuvar Tanı Bilimi – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri
Temel Araştırmalarda Uygulamalar
Kromozom boyama, translokasyonların incelenmesi için özellikle yararlıdır. Bu, iyi bir şekilde gösterilmiştir. Burada kromozom boyama, bir insan tümöründe ortaya çıkan bir translokasyonda yer alan kromozomları tanımlamak için kullanılır. Küçük yer değiştirmiş kromozom parçaları genellikle yalnızca bu yaklaşım kullanılarak saptanabilir.
Kromozom boyama ilkesinin iyileştirilmesi, bir hücredeki her bir kromozom çiftinin aynı anda tanımlanabileceği protokollere yol açmıştır. Buna ‘spektral karyotipleme’ denir. Bu teknikte her bir kromozom çifti için boyalar aynı reaksiyonda kromozomlara hibritlenir.
Her kromozom boyası, farklı oranlarda birleştirilmiş birkaç farklı florokromun bir karışımıdır. Bu, her kromozom tarafından yayılan flüoresansın belirli bir spektruma sahip olduğu anlamına gelir.
Bu, sensör tarafından algılanır ve yazılım, her spektruma farklı bir yanlış renk atar. Sonuç, tüm kromozomların kendi özel renkleriyle tespit edilebildiği bir bilgisayar görüntüsüdür.
Spesifik bir gen dizisinin kromozomal lokasyonunu haritalamak için FISH’in daha karmaşık bir kullanımı gereklidir. Bu görev için YAC’ler, BAC’ler veya kozmitlerde klonlanmış DNA normalde prob olarak kullanılır. Bu, kolayca tespit edilebilecek yeterli floresan sağlar. Örnekler Şekil 37.1’de gösterilmiştir. İlgili prosedürler, kromozom boyama için kullanılanlara benzer, ancak sinyalin daha büyük bir amplifikasyonu gerekebilir.
FISH, azaltılmış arka plan ve deneyi tamamlamak için gereken kısa süre (otoradyografların maruz kalması için gereken birkaç haftaya kıyasla 2 gün) nedeniyle, bu görev için daha önce kullanılan radyo etiketli problardan çok daha başarılıdır.
Daha önce açıklandığı gibi, aynı anda birden fazla prob kullanılabilir. Bu yaklaşım farklı şekillerde kullanılabilir. Bir kromozom üzerinde bir probun yerini belirlemeye çalışırken, genellikle aynı anda kromozomu açık bir şekilde tanımlamak gerekir.
Bu, söz konusu kromozoma özgü bir sentromerik DNA tekrar dizisi için bir prob kullanılarak yapılır. Kromozom boyunca yakından bağlantılı genlerin sırasını belirlemek için çift veya üç renkli FISH kullanılabilir. Kullanılan renkler nedeniyle bu işleme genellikle ‘trafik aydınlatması’ denir.
Tıbbi Genetik ve Klinik Uygulamaları PDF
Tıbbi Genetik ve Klinik Uygulamaları pdf indir
Tıbbi Genetik Bölümü neye Bakar
Sondanın bir kromozom üzerindeki konumu bazen bantlama modeliyle tanımlanabilir, ancak genellikle basitçe Flpter birimleri olarak ifade edilir. Bunlar, tüm kromozomun uzunluğuna kıyasla kromozomun p kolunun telomerinden kesirli uzaklığı temsil eder.
FISH tarafından genlerin haritalanmasında ciddi bir sınırlama, nispeten yoğun mitotik metafaz kromozomları durumundan kaynaklanır. Bu, birbirinden yaklaşık 1-2 Mb uzaklıkta bulunan genlerden gelen sinyallerin üst üste geleceği ve iki ayrı sinyali ayırt etmenin mümkün olmadığı anlamına gelir. Bu sorunun üstesinden gelmek için bir dizi yaklaşım kullanılmıştır.
Kromatin, interfaz sırasında çok daha az yoğunlaşır ve metafaz kromozomları üzerinde ayrılamayan diziler, genellikle bölünmeyen hücrelerin çekirdeklerine probların hibridizasyonu ile çözülebilir. Bu sistemdeki bir dezavantaj, genleri sentromere göre yönlendirmenin mümkün olmamasıdır.
Buna izin veren alternatif bir süreç, mayotik kromozom preparasyonlarının kullanılmasıdır. Bunlar, mitotik kromozom preparatlarından çok daha uzundur. Ancak, hazırlamak için çok uygun değiller. Uzatılmış mitotik kromozomlar üretmek için başarıyla kullanılan bir yaklaşım, sabitlenmemiş metafazların sitospin preparatlarını kullanmak olmuştur.
Sitospin, hematolojide kan hücrelerinin slaytlarını hazırlamak için sıklıkla kullanılan bir cihazdır. Hücrelerin doğrudan slaytlar üzerine döndürüldüğü modifiye edilmiş bir santrifüjden oluşur. Hipotonik salin içinde şişmiş sabitlenmemiş metafazlar bu şekilde tedavi edildiğinde, santrifüj sırasında üretilen kesme kuvvetleri kromozomları normal uzunluklarının yirmi katına kadar gerer.
Bu, birçok metafazın bozulmasına ve kromozomların deforme olmasına neden olsa da, tek tek kromozomların tanımlanabilmesi ve FISH sinyallerinin sentromer ve telomerlere yöneliminin gözlemlenebilmesi açısından, interfaz analizine göre bir avantajı vardır.
FISH analizi ile elde edilebilecek nihai çözünürlük derecesi fiber FISH tekniğinde bulunur. Burada prob, kromatin paketinin çoğu veya tamamı çıkarıldıktan sonra bir slayt üzerine yayılmış DNA’ya hibridize edilir. Sinyalin kromozoma oryantasyonu hakkında hiçbir bilgi elde edilemez, ancak teknik, genomun küçük bölgelerinin ince ölçekli analizi için son derece güçlüdür.
DNA’nın yayılması birkaç yolla sağlanabilir. Genişletilmiş kromatin lifleri, histonları uzaklaştırmak için deterjan ve yüksek tuzla mikroskop lamları üzerinde muamele edilen sabitlenmemiş interfaz hücrelerinin çekirdeklerinden elde edilebilir. Bu, kromatinin ilmekli yapısının çözülmesine ve DNA’nın saf DNA ile karşılaştırılabilir bir uzunluğa ulaşmasına neden olur. Bu tür teknikler ‘halo üretimi’ veya DIRVISH (doğrudan görsel hibridizasyon) olarak bilinir.
Bunlar, probların 3-5 kb’lik daha düşük bir çözünürlük sınırına kadar sıralanmasına izin verir. Saflaştırılmış DNA, ince yapı analizinde kullanılmak üzere mikroskop lamlarına da yayılabilir. DNA, erimiş ve slayt üzerine nazikçe yayılan darbeli alan jel elektroforezi için kullanılanlar gibi agaroz tıkaçlarında tutulabilir veya çözelti içindeki DNA’nın silanlı slaytlar üzerinde yayılmasına izin verilebilir.
Bu durumda, molekülün ucu cama bağlanır ve DNA’nın geri kalanı, çözelti buharlaştıkça menisküs tarafından aşağı yukarı doğrusal olan bir modelde taranır.
Bu protokollerin her ikisi de son derece ince ölçekli çalışmayı kolaylaştırır. Tipik örnekler, YAC’lerde veya kozmidlerde klonlanmış DNA boyunca PCR tarafından üretilen probların sıralanmasını içerir. Bu, bir contig’in (sıralı örtüşen klonlanmış DNA parçaları grubu) eksik olduğu ve boşlukların boyutunun tahmin edilmesinin gerektiği durumlarda çok faydalı olabilir.
Tıbbi Genetikteki Uygulamalar
Yukarıda belirtildiği gibi, kromozom boyaması, açık bir şekilde geleneksel G-bantlamasının çözümlenmesi için çok küçük olabilecek translokasyonların saptanması için özellikle yararlıdır. FISH’den yapılabilecek diğer kullanımlar arasında, özellikle amniyosentezde anöploidi saptanması yer alır. Burada interfaz çekirdeklerinin analizi yine yapılabilir.
Homologların sayısını saptamak için tüm kromozom boyalarını kullanmak yerine, farklı kromozomların sentromerlerinde bulunan tekrarlanan DNA dizilerine özgü problar kullanılır. Bu, Down’s, Edward’s ve Pateau’s gibi yaygın anöploid sendromlarda yer alan kromozomların fazladan kopyalarının varlığını tespit edebilir.
Bir embriyonun cinsiyeti, X ve Y kromozomları için iki renkli problar kullanılarak amniyotik hücrelerde de belirlenebilir. Bu prosedürlerde FISH, hücrelerin kültürlenmesi gereken geleneksel kromozom analizinden çok daha kısa sürede bir sonucun elde edilmesini sağlar ve yalnızca interfaz hücrelerin gerekli olduğu için puanlanan hücre sayısının çok yüksek olabilmesi gibi ek bir avantaja sahiptir. .
Ancak daha pahalıdır ve herhangi bir sitogenetik anormalliğin doğası hakkında G-bantlaması kadar bilgi vermez, örn. bozulmamış bir ekstra kromozomun varlığı ile sentromer içeren kromozomun bir parçası arasında ayrım yapmayacaktır.