Doku ve Hücre Kültürleri gelen Ultrasonik Protein Ekstraksiyon
- Protein ekstre etme proteomik önemli bir örnek hazırlama adımdır.
- Proteinler, bitki ve hayvan dokusu, maya ve mikroorganizmalar elde edilebilir.
- Sonikasyon kısa ekstraksiyon süre içinde yüksek bir protein verimi de güvenli, etkin protein ekstraksiyon yöntemidir.
Doku ve hücrelerden protein çıkarma
dokular ve kültürlenmiş hücrelerden protein ekstraksiyonu, ELISA gibi PAGE gibi pek çok biyokimyasal ve analitik teknikler sırasında gerçekleştirilir temel bir numune hazırlama adımı Western lekelemeKütle spektrometrisi, ya da protein saflaştırma. Ultrasonik hücrelerin parçalanması, parçalama ve ekstraksiyon proteinlerin yüksek verim sağlamak için tam olarak kontrol edilebilir bir yöntemdir.
hayvan dokusundan protein ekstraksiyonu
Tam boyutlu doku (örneğin, böbrek, kalp, akciğer, kas vb.) Hazırlanması için, doku, tercihen buz üzerinde, temiz araçlarla çok küçük parçalara ayrılmalı ve proteazlar tarafından bozunmayı önlemek için mümkün olduğunca çabuk olmalıdır. proteaz ve fosfataz inhibitörü kokteyli içeren RIPA veya hipotonik lizis tamponu gibi liziz tamponu). Diseksiyon işleminden sonra, numune ek dondurma için sıvı azot içine daldırılır. Numune daha sonra kullanmak için -80 ° C'de saklanabilir veya hemen homojenizasyon için buz üzerinde tutulabilir. Ultrasonik ekstraksiyondan hemen önce, buz soğuk liziz tamponu (proteaz inhibitörleri DTT, leupeptin ve aprotinin ile) örnek tüpüne hızla eklenir (yaklaşık 10 mg doku başına yaklaşık 600 uL tampon önerilir). Yaklaşık. Örnek tüp başına 20-60 mg doku önerilir.
Ultrasonik homojenizasyon, parçalama ve ekstraksiyon gibi bir ultrasonik homojenleştirici ile gerçekleştirilir UP200Ht veya UP200StBir mikro-uçlu sonotrot ile donatılmıştır. Sonikasyon süresinin 60-90 saniyedir. 15 saniye ultrasonik döngü modunda. sonikasyon ve 10 san. dinlenme zamanı. Numune buz içinde her zaman tutulmalıdır.
Ultrasonik homojenizasyon / Ekstraksiyon işleminden sonra, lizat yaklaşık 27,000 g'de santrifüjlenir. 20 Dakika. Protein konsantrasyonu, Pierce BCA protein deneyi gibi bir protein deneyi ile tespit edilebilir, böylece sonra üstte kalan sıvı toplanır.
Kan serum protein ekstraksiyonu
Serum ve fosfat tampon maddesi, homojen bir karışım için, örnek ultrasonik hücre lizizi ilk önce vortekslenir. Ultrasonik liziz, numune gibi ultrasonik laboratuar homojenleştiricisi uygulamr UP100H her 5 saniyede devir için 20% genlikte 8 döngü ve kapalı 15 saniye. Sonocation döngüsü içinde sonicationg ile ve numunenin bir aşırı ısınma ve termal bozunmasının önüne geçildiği şekilde buz üzerinde örnek yerleştirilmesiyle gerçekleştirilir. Serum IEF sırasında düşük molekül ağırlıklı proteinlerin ayrılması müdahale (örneğin albumin, α1-antitripsin, transferrin, Haptoglobulin, immünoglobülin G ve immünoglobulin A gibi) yüksek molekül ağırlıklı proteinlerin, büyük bir miktarda içerdiği için, bunları yok etmek üzere önerilir tükenim kolonu kullanılarak serumdan.
bitki dokusundan protein ekstraksiyonu
Taze, yumuşak bitki dokusu, ör yosun vs. kolayca sadece sonication için liziz tamponunda kıyılmış numune malzemesi yerleştirerek bozulabilmektedir. FIR iğneler vb tohumlar gibi zor, ligenous bitki dokuları, kuru zemin olmalıdır. Bazı sabit, odunsu bitki materyalleri dondurulmuş olması ve sıvı azot içinde öğütülmüş önce sonikasyon ile ekstre edilmiştir. bitki hücre kültür süspansiyonlar, bir liziz tamponu içinde 30 ile 150 saniye arasında bir ultrasonik tedavi çoğunlukla yeterlidir. aşağıda açıklandığı gibi bu tür kabak çekirdeği olarak Sıkı malzeme daha yoğun sonication gerektirir.
kabak çekirdeği albumin ultrasonik ekstraksiyon için protokol
ince zemin kabak çekirdeği tozu albumin ultrasonik protein ekstraksiyonu için, yağı alınmış kabak çekirdeği tozu, 10 g ve çözücü olarak iyonu giderilmiş suyun 100 mL '250 mL'lik bir cam beher içinde ilave edilir. İlk olarak, numune, bir prob tipi ultrasonikleştirici uygulamr: Protein ekstraksiyon, iki adımda oluşur UP400St (400W, 24kHz) monte sonotrode S24d7 ile. Cam beher, ultrasonik homojenleştirme sırasında bir soğuk su banyosu içine yerleştirilir. ultrasonikleştirici ayarı UP400St Takılabilir sıcaklık sensörü ile numune sıcaklığının daima 30 ° C'nin altında tutulması sağlanmıştır. Sonikasyon sırasında hassas sıcaklık kontrolü ile albüminin denatürasyonu önlenir. İkincisi, ekstraksiyon, 200 rpm hızında ve 30 ° C'de bir karıştırıcı ile gerçekleştirilmiştir. Daha sonra beher, bir termostatik çalkalayıcıya aktarılır. Globulin, damıtılmış su ile diyaliz yoluyla çıkarılır. Globulin çıkarıldıktan sonra, protein ekstresi albümin profilinin belirlenmesi için örneklenebilir ve daha sonra albümin pıhtılaşması için 0.1 M HC1 kullanılarak pI = 3.0'a ayarlanır. Katı faz, 5000 g, 20 ° C'de santrifüjleme ile ayrılır ve deiyonize su içinde yeniden çözülür. Albümin konsantresinde protein oranını arttırmak için albümin pıhtılaşması iki kez gerçekleştirilir.
pirinç kepeğinden protein konsantresinin hazırlanması için ultrasonik alkali protein izolasyonu gösteren belirgin bir şekilde daha kısa hızınm yüksek protein verimle ultrasonik tedavi sonuçları – Geleneksel ekstre etme yöntemleri ile karşılaştırıldığında.
- hızlı
- yüksek verim
- Yüksek verimli
- parametreleri üzerinde hassas kontrol
- tekrarlanabilir sonuçlar
- doğrusal ölçeklenebilirlik
Fonksiyonel İNOS enzimi için örnek hazırlama protokolü
(Örneğin, ilaç taraması için) tam olarak işlevsel İNOS enzim elde etmek için aşağıdaki protokol önerilir: Hücre süspansiyonu buz ve sonikasyon yerleştirilmelidir UP100H 5 saniye döngü modunda 10 um genlikte. sonikasyon ve 25 sn. buz üzerinde bekletin. işlem yaklaşık tekrarlanmalıdır. 3 kere. sonikasyon döngüleri arasındaki dinlenme süresi sıcaklık artışını azaltan ve bu nedenle denatürasyon riskini azaltacaktır.
Ultrasonik Protein Çözündürme
Sonikasyon genellikle birkaç saat gerektiren protein Çözündürme işleminin, hızlandırabilir. üre ihtiva eden çözeltiler içinde protein degradasyonunu ve modifikasyon örneği aşırı ısınmasına ve önlemek için amacıyla, ultrasonik patlamaları birkaç saniye daha uzun süre gerekmektedir.
Genel Talimatlar
Sıcaklık kontrolü: Termal denatürasyon olmaksızın yüksek bir protein verimi sağlamak için, ekstraksiyon sırasında sıcaklık kontrol edilmelidir. Hielscher state-of-art ultrasonik homojenleştiriciler – ayrıca ultrasonik parçalayıcı veya sonificator adı – hassas kontrol edilebiliyor. Onlar plugable sıcaklık sensörü ile donatılmıştır. ultrasonik Homojenizatörün ayar seçeneklerinde bir maksimum sıcaklık ayarlanabilir. Bu sıcaklık en ulaşıldığında örnek soğuyana kadar, ultrasonikatör otomatik olarak durur.
Tampon: Uygun bir tampon maddesi ve tampon doğru hacminin seçimi dokudan dokuya değişir ve deneme-yanılma testi ile biçim Çıkış olmalıdır.
İzolasyon / saflaştırma: Protein lizatlan çok protein çökelmesi (deoksikolat-trikloroasetik asit) ile bertaraf edilebilir, örneğin DNA ya da karbonhidratlar gibi biyomoleküllerin bir fazlalık ihtiva ederler ya da tampon değişimi olabilir.
Chittapalo ve (2009) Noomhorm protein verimi sonikasyon kullanılarak arttığı ve ultrasonik doku homojenizasyon ve parçalama işlemi belirgin olarak mevcut çıkartma işlemlerini geliştirmek için rapor – yeni ticari çıkarma fırsatları için etkinleştirme.
Protein Ekstraksiyon Ultrasonik Ekipmanları
Hielscher Ultrasonics hücre, doku, bakteri, mikroorganizmalar, maya ve sporlar dağılması için ultrasonik homojenizatör geniş bir yelpazesi mevcuttur.
Hielscher laboratuvar ultrasonicators güçlü ve işletmek kolaydır. 24/7 işlemi için dahili, dayanıklı ve etkili bir laboratuar tezgah üstü cihazları olarak tasarlanmıştır. Tüm cihazlar için, enerji çıkışı ve genlik hassas kontrol edilebilir. geniş aralığı Aksesuarlar ayrıca ayar seçeneklerini açar. gibi dijital aygıtlar VialTweeter, UP200Ht, UP200St, ve UP400St entegre bir sıcaklık kontrol ve bir yerleşik olarak otomatik veri kayıt için SD kart.
Dolaylı, çapraz kontaminasyon içermeyen ve çoklu numunelerin aynı anda sonication için, teklif VialTweeter ya da ultrasonik cuphorn.
Başvurunuz, malzeme ve numune hacmine bağlı olarak, size örnek hazırlık için en uygun kurulum tavsiye eder. Bize bugün!
Edebiyat referansları
- Chittapalo T Noomhorm A (2009): Ultrasonik yağı alınmış pirinç kepeği ve protein konsantrelerinin özelliklerinden protein alkali ekstraksiyon yardımcı olmuştur. Int J Food Sci Technol 44: 1843-1849.
- Simoes, Andre deneyden:; Pereira, Diane M.; Amaral Joan.; Nunes Ana M.; Gomes, Sofia e.; Roberts Peter M.; Lo Adrian Cı.; D'Hooge Rudi; Clifford J yönlendirmek.; Thibodeau, Stephen C.; Borralho Peter M.; Rodrigues Cecilia M.P. (2013): Trizol veya Trizol LS RNA ekstraksiyonu ve uzun süreli saklama sonunda birden fazla kaynak örneklerinden proteinlerin verimli geri kazanımı. BMC Genomics 2013, 14: 181.
Bilinmesi Gereken Gerçekler
proteomiks
Proteomiks proteinleri ve Proteomun araştıran bir araştırma alanıdır. Proteinler organizmaların içinde hayati fonksiyonların geniş bir dizi fullfil. proteom belirli bir zamanda bir genom, hücre, doku veya organizma tarafından ifade edilen proteinler, tüm dizi. proteom, bir hücre ya da organizma maruz olduğu zaman ve farklı gereklilikleri veya stresleri ile değişir. Daha özel olarak ise, bu hücre ya da organizmanın belirli bir türü ifade edilen proteinlerin kümesidir, tanımlanan koşullar altında, belirli bir zamanda. terimi, proteinleri ve genomunun bir karışımıdır. Proteomiks proteomun çalışmadır.
Protein
Büyük biyomoleküllerin olan olan proteinler olarak adlandırılan makromoleküller – Bir veya daha fazla uzun amino asit kalıntısı zincirinden oluşur. Proteinler hem bitkisel hem de hayvansal kaynaklı tüm organizmalarda bulunurlar ve biyolojik fonksiyonların çoğu için çok önemlidirler. Proteinler birçok biyolojik bilgi içerdiğinden, analitik amaç için, örneğin proteomik araştırmalar için çıkarılırlar. Proteinler tarafından gerçekleştirilen en önemli işlev, metabolik reaksiyonların katalizini, DNA replikasyonunu, uyaranlara cevabı ve moleküllerin bir yerden diğerine taşınmasını içerir. Proteinler, esas olarak, genlerinin nükleotid dizisi tarafından dikte edilen ve genellikle aktivitesini belirleyen belirli bir üç boyutlu yapıya katlanan protein ile sonuçlanan amino asit dizileri bakımından birbirlerinden farklıdır. Proteinler – peptidler yanında – Gıda temel bileşenlerinden biri. Bu nedenle, proteomik süreçleri, gıda güvenliği ve beslenme değerlendirmesi optimize etmek gıda bilimi güçlü bir araçtır.
Jel elektroforezi
Jel elektroforezi ayırma ve örneğin, DNA, RNA ve proteinler ve aynı zamanda bunların büyüklüğü ve şarj göre bunların parçaları gibi makromoleküllerin analizi için önemli bir yöntemdir. Şarj ve / veya boyutta proteinleri ayırmak için klinik kimyada kullanılan (IEF agaroz, esas olarak boyutunu bağımsız) ve biyokimyasal, moleküler biyoloji ve proteomik DNA boyutunu tahmin etmek için, uzunluk DNA ve RNA parçaları içeren karışık bir popülasyonunu ayırmak için ve ya da RNA fragmanları şarj proteinleri ayırmak için.
Hücre Kültürleri
Hücre kültürü hücreleri kontrollü şartlar altında yetiştirilen hangi tarafından kontrol büyüyen bir süreçtir. Hücre kültürü koşulları, her hücre türü için değişir. Genel olarak, bir hücre kültürü ortamında alt-tabaka ya da temel besin (amino asitler, karbonhidratlar, vitaminler, mineraller), büyüme faktörleri, hormonlar malzemeleri orta ve gazlar (CO ile, uygun bir kap (örn Petri tabağı) oluşmaktadır2,2) Ve fizyo-kimyasal ortamı (pH tamponu, ozmotik basınç, ısı) düzenler. Diğer hücre kültürleri kültür ortamında (süspansiyon kültürü, hücre süspansiyonu) içinde serbest hareket ekilecek iken en hücreler, bir yüzey ya da yapay substrat gerekir.
Hayvan hücre çizgilerinin kütle kültürleri, viral aşılar ve diğer biyoteknolojik olarak türetilen ürünlerin endüstriyel üretiminde kullanılır. İnsan kök hücreler hücrelerin sayısının artırılması ve transplantasyon amacıyla çeşitli somatik hücre tiplerine hücreleri ayırt etmek üzere kültürlenmektedir.
Doku örnekleri
Hücre malzemesi, hücreleri ve tam bir organ arasındaki bir organizasyon düzeyinde olduğu dönem doku, hücresel ara ürün tarif etmektedir. dokusunda, içindeki hücreler, birlikte özel bir işlevi yerine aynı kaynaktan gelen, monte edilir. Birden çok doku işlemsel olarak, organların karmaşık yapılar oluşturulur.
Doku biyoloji, histoloji / histopatoloji, parazitoloji, biyokimya, immünohistokimya araştırma hem de yetiştirmek ve DNA elde etmek için örneklenir. ve bitki dokusu: Hayvan (memeli doku, alt bölüm) arasında ayırt edilebilir. Hayvan dokular bağ, kas, sinir ve epitel doku dört ana tipte gruplandırılır. epidermis, zemin dokusu ve damar dokusu: Bitki dokusu şu üç doku sistemlerinin bölünmüştür.
Doku örnekleri, hayvan ya da bitki parçaları, örneğin hazırlanabilir Kemik, kas, yapraklar, vb
Vücut sıvısı
Kan, serum, plazma, beyin omurilik sıvısı, tükürük ve sinoviyal sıvı tanısal olarak ilgili bilgilerin büyük bir kaynak sunmaktadır vücut sıvıları, bulunmaktadır. Bu nedenle, analiz için vücut sıvısı örneklerinin, gelişmiş bir preparat önemlidir. birinci sorun vücut sıvıları içinde bulunan bileşenlerin geniş bir dinamik aralık ile ilişkilidir.
Protein konsantrasyonunun saptanması
Bradford tahlili, Lowry deneyi ve bisinkoninik asit (BCA) deneyi protein konsantrasyonunu belirlemek için ortak deneylerdir. Sığır serum albümini (BSA), en sık kullanılan protein standardı biridir.
Liziz Tamponu
Liziz tamponu hücre malzeme veya doku (doku kültürü, bitki, bakteri, mantar, vb) için uygun olarak seçilmiş, ve gereken hücreler, bir yapı ve yapının türü olup olmadığı. liziz geniş bir yelpazede proteinlerinin membran ekstraksiyonu için tampon ve organeller bir veya daha fazla deterjan ile birlikte formüle edilir. Deterjan genellikle deneme-yanılma testi veya üzerinden seçilir – mümkün ise – Mevcut bir proteini ekstraksiyon protokolüne göre. Deterjan doku kaynağı ve proteinler ile uyumlu olmalıdır. Genel olarak, belirli bir doku / protein için çalışan en hafif deterjan özü maksimal işlevselliğini korumak amacıyla seçilir. Ayrıca, membran ve organellerinin bir ekstraksiyon yapılması halinde ise, bir deterjan membran hiç değişiklik olmaz. lizis tampon içinde yaygın olarak kullanılan, örneğin deterjanlar, çoğunlukla iyonik olmayan veya zwitteriyonik olarak CHAPS, deoksikolat, Triton ™ X-100, NP-40, Tween 20 ve.
Örneğin, bu tür beyin, karaciğer, bağırsak, böbrek gibi dokuların, dalak gibi sadece RIPA ile tamponlanabilen – Bununla birlikte, proteaz inhibitörleri ve (örneğin jel elektroforezi için) DTT dahil edilmelidir.
20 mM Tris (pH 7.8), 137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 1 mM MgCI2,% 1 Triton X-100,% 10 gliserol (ağırlık / hacim), 1 mM EDTA: iskelet kası dokusu (buz soğuğu) için Liziz tamponu , 1 mM proteaz ve fosfataz inhibitör kokteyli ile takviye ditiyotreitol
ortak tampon Tablo ve pH aralığı. Genel olarak, bu tamponlar normal olarak 20-50 mM arasında değişen konsantrasyonlarda kullanılmaktadır.
|Tampon||pH aralığı,|
|Sitrik asit – Naoh||2,2 – 6,5|
|Sodyum sitrat – Sitrik asit||3,0 – 6,2|
|Sodyum asetat – asetik asit||3,6 – 5,6|
|Cacodylic asit sodyum tuzu – Hcl||5,0 – 7,4|
|MY – Naoh||5,6 – 6,8|
|Sodyum dihidrojen fosfat – disodyum hidrojen fosfat||5,8 – 8|
|İmidazol – Hcl||6,2 – 7,8|
|Moplar – Koh||6,6 – 7,8|
|Triethanolamin hidroklorür – Naoh||6,8 – 8,8|
|Tris – Hcl||7 – 9,0|
|HEPES – Naoh||7,2 – 8,2|
|trişin – Naoh||7,6 – 8,6|
|Sodyum tetraborat – borik asit||7,6 – 9,2|
|bisin – Naoh||7,7 – 8,9|
|glisin – Naoh||8,6 – 10,6|
En çok tampon sıcaklığı olan bir pH bağımlılığını göstermektedir. Bu Tris tampon için özellikle doğrudur. pKa, 0 ° C'de 8.85 ila 25 ° C 'de 8.06 değişir.
bir tampon (pH ve pKa: pH bir sulu çözelti içinde hidrojen iyonlarının konsantrasyonunu ölçen pKa (= asit ayrışma sabiti) ilgili, ancak daha özel ölçü, bir molekülün spesifik olarak nasıl hareket edeceklerini tahmin edilmesine yardımcı olur olmasıyla vardır. PH değeri.)
TRlzol
TRlzol guanidinyum tiosianat-fenol-kloroform ekstraksiyonu sırasında RNA / DNA / protein elde etmek için kullanılan bir kimyasal çözüm. Aynı örnek, yüksek DNA, RNA ve protein verimleri Ultrasonik destekli TRlzol ekstraksiyon sonuçlarının kullanılması ve bu şekilde, diğer ekstre etme yöntemleri öne çıkmaktadır.