2 Apopitozis veya Apopitoz, Yunanca: apoptosis yani "(ayrılarak) düşmek", apo="-den/-dan" ve ptosis="düşmek"Programlanmış hücre ölümünün ana tiplerinden biridir. Vücutta ihtiyaç duyulmayan veya anormalleşmiş hücrelerden kurtulmanın normal yoludur.Akut hücresel zarar sonucu olan hücre ölümü tipi nekrozdan farklı olarak apopitoz belirli bir moleküler işlemler serisinin sonunda hücrenin ölümünü sağlar ve aynı zamanda organizmanın yaşam döngüsü için gerekli ve yararlıdır.Örneğin gelişen bir embriyoda insan parmaklarının farklılaşması esnasında parmaklar arasındaki hücrelerin apopitoz başlatması gerekir ki parmaklar birbirinden ayrılabilsin.
3 Apopitozis örnekleri: Kemik iliğinden sürekli olarak hücre üretimi devam ederken, günde yaklaşık 5x1011 kan hücresi apoptozis yolu ile yok edilmektedir.Barsak epitel hücrelerinin devamlı yenilenmesiMenstruasyon esnasında uterusun iç yüzündeki hücrelerin öldürülerek uzaklaştırılması apopitozise örnektir.
4 Virüsle enfekte hücreler, hasarlı DNA bu yolla ortadan kaldırılır. Hücrenin DNA’sında meydana gelen mutasyonlar kanser gelişimine neden olabilecekleri için bu hasarlı hücrelerin apopitozis yolu ile öldürülmesi önemlidir.
5 Örneğin, böcek ve amfibi metamorfozunda apopitoz, larval dokuların elimine edilmesinde kullanılır
6 Apopitotik hücredeki morfolojik değişiklikler Işık mikroskobu,Elektron mikroskobu,Flow sitometri kullanılarak saptanır.
7 Apopitoziste morfoloji: Ana morfolojik olay, nükleusun kondensasyonu ve daha sonra parçalara ayrılmasıdır.Kromatin, normalde daha diffüz görünümdedir.
8 Apopitozisin erken evresinde hücreler birleşme bölgelerinden ayrılır, özelleşmiş yüzey organellerini kaybeder ve belirgin şekilde büzülür, bir kaç dakikada hacimlerinin 1/3’ünü kaybederler.Bu görünüm muhtemelen plazma membranında bulunan iyon kanalları ve pompalarında aktivasyonun bozulmasına bağlıdır.Işık mikroskobunda Apopitotik hücrelerin etrafında açık bir parlama şekli görülmektedir.
10 Hücrelerin tanınması, plazma membranındaki değişikliklerle olur. Apopitotik hücreler komşu hücreler ve makrofajlar tarafından tanınır ve fagosite edilir.Hücrelerin tanınması, plazma membranındaki değişikliklerle olur.Normalde hücre membranının iç tabakasında olan fosfatidil serin, aminofosfolipid transferaz enzimiyle membranın dış yaprağına göç eder.Fagositik hücrelerin vitronektin, lektin özelliğindeki reseptörleri fosfotidilserin ile bağlanır ve fagositozu uyarır.
11 Floresan boyamada DNA boncuklanmalar şeklinde görülür, bunun nedeni DNA’nın endonükleaz ile oldukça özgül şekilde internükleozomal bölgelerden bp (baz çifti) büyüklüğünde parçalara ayrılması olup DNA fragmentasyonu apopitozisin en önemli işaretidir.elektroforez yapıldığında ‘ladder patern’ merdiven şeklinde bir görünüm oluşur.Normalde bir hücrede birbirini takip eden 7 kırılma onarılırken, apopitoziste yaklaşık kırılma meydana gelir ve hücre onarımı yapılamaz.
13 Apopitozisi saptama yöntemleri Kaspaz aktivitesinin, hücreye kalsiyum akışının veya mitokondri disfonksiyonunun ölçülmesi gibi sitoplazmik değişiklerin saptanması.Membran geçirgenliğinin değişmesi gibi membran değişikliklerinin belirlenmesiApopitozda görevli çeşitli proteinlerin kanda veya dokuda düzeyinin ölçülmesi (Bcl2/Bax oranı).DNA parçalanmasının çeşitli özel immünohistokimyasal boyalarla saptanması.
14 Bütün bu yöntemler içinde en sık rastlanan yöntemler, DNA’daki değişikliklere dayalı olan; DNA agaroz jel elektroforezi ve TUNEL (terminal deoxytransferase mediated bio-dUTP nick end labeling) boyası ile formalinde fikse edilmiş materyalde yapılan mikroskobik incelemedir.Son dönemde kullanılan önemli ve güvenilir bir başka metod ise Annexin-V boyası uygulaması ve ELISA’ dır.
15 Nekroz? Apopitoz? Nekroz (Patolojik hücre ölümü) Fizyolojik olmayan şartlarda görülürAşırı doku hasarı görülürİnflamatuar yanıt gelişir
16 Apopitoz (Programlı hücre ölümü) Hücre ölümü fizyolojik şartlarda görülürDoku hasarı yoktur, lokal hücre kaybı (+)İnflamatuar yanıt görülmez
18 Biyokimyasal özellikler NEKROZ*Bozulmuş iyon homeostazisi*ATP gerekmez(pasif süreç)*+4 C’de gerçekleşebilir*DNA rastgele parçalanır(agaroz jel elektroforezinde “smear” görüntüsü)*Postlitik DNA fragmentasyonu (=ölümün geç safhasında)APOPİTOZ*İyi kontrollu, bazı aktivasyonların ve enzimatik basamakların olması*ATP gereklidir(aktif süreç)*+4 C’de gerçekleşmez)*DNA internukleozomal alanlarda180 kb çiftinin katları olacak şekilde kırılır mono ve oligonukleozomlara ayrılır (agaroz jel elektroforezinde merdiven patterni)*Prelitik DNA fragmentasyonu (=erken evrede gerçekleşir)
19 Apopitoz Mekanizmaları Hücrelerde primer başlatılabilir ya da bir uyaran sonucu sekonder olarak gelişir.Hücre dışı uyaranlar:Tümör nekroz faktörü (TNF)Koloni uyarıcı faktörler (CSF)Nöron büyüme faktörü (NGF)İnsülin benzeri büyüme faktörü (IGF)IL–2 gibi maddelerin ortamda azalması
20 Çeşitli antijenler olabilir. Glukokortikoidler,Radyasyon,İlaçlar,Çeşitli antijenler olabilir.Otoimmun hastalık gelişiminde rolü olduğu belirtilen Fas/FasL, sFas proteinleri, virüsler hücreyi apopitoza götürmektedir.
21 Örneğin sitoplazmik Ca+2 miktarında hafif artış c-fas, c-myc Uyarılar hücre içinde Ca +2 artışına neden olmakta ve/veya cAMP gibi hücre içi ikincil habercileri aktive etmektedir.Örneğin sitoplazmik Ca+2 miktarında hafif artışc-fas,c-mycsıcak şok proteini gibi yeni mRNA basamaklarını harekete geçirir.Ayrıca, apopitozda etkili endonükleaz, transglutaminaz gibi enzimleri de aktive eder.Bunlar da kromatinde parçalanmaya, hücre iskeletinde ve sitoplazmik proteinlerde değişikliklere neden olur.Sitoplazmik kalsiyum, kalmodulin ile bağlanırsa apopitoz inhibe edilebilir.
22 Tümör süpressör genler Hücre içi uyaranlar;Büyüme faktörleriOnkogenlerTümör süpressör genler
24 Apopitoz süreci; DNA hasarına genlerin yanıtı Hücre membranı tarafından ölüm sinyallerinin alınması (Fas ligandı gibi; Ekstrinsik yol veya ölüm reseptörleri)Hücreye doğrudan proteolitik enzim girişi (granzim) olmak üzere üç farklı şekilde gelişebilir.Bu süreçte belli başlı üç anahtar bileşen vardır. Bunlar;Bcl–2 ailesi proteinleri,kaspazlar veApaf-1 (Apoptotic protease activating factor-1) proteinidir.
25 DNA hasarına genlerin yanıtı İnsanda apopitozun düzenlenmesi, p53 ile başlayan ve kaspazlara kadar devam eden bir süreçtir.Bir tümör süpressör gen olarak çalışan p53 mutasyona uğradığı ya da bulunmadığı zaman hücre yaşamı uzar.Genotoksik olaylarla oluşan hücre hasarı p53’ü aktive eder. p53 protein ürünü DNA’ya doğrudan bağlanarak hasarı tanıdıktan sonra, ya G1’de hücre siklusunun durmasını indükleyerek tamir için gerekli zamanı kazanır ya da hasar fazlaysa apopitoza yönlendirir.Ayrıca p53’ün Bax/Bax, Bax/Bcl–2, Bcl-2/Bcl-2 gruplarının oranlarını düzenlediği de düşünülmektedir
26 p53 apopitozisi indükler. p53’ün apopitozisi indüklemesi, Bax’ın ekspresyonunu artırması böylece Bcl–2/Bax oranını değiştirmesi yoluyla gerçekleşir.Bazı virüsler (papillom virüsü, adenovirüs tip 12), ya p53’ü inaktive ederek ya da Bax’a bağlanarak apopitozu bloke ederler, böylece bu virüsler karsinogeneze bu yolla katkıda bulunurlar.p53 bax’ın indüksiyonu haricinde ayrıca Fas ve DR5 gibi hücre yüzey ölüm reseptörlerinin indüksiyonuna neden olarak da apopitoz başlatabilir.
27 Apopitozun regülasyonu Bcl–2/Bax gen ailesi ile sağlanır. Bcl–2 geni ilk olarak insandaki B hücreli foliküler lenfomada tanımlanmıştır.Bu ailenin 20 üyesi vardır; bunlardan bazıları apopitoz inhibitörü (antiapopitotik), bazıları ise apopitoz uyaranıdır ve proapopitotik genler olarak tanımlanır.Bu ailenin üyeleri kendi aralarında homo veya hetero-dimerler oluştururlar (Bcl-2, Bax ile heterodimer oluşturduğunda Bcl-2 etkisini antagonize ederler). Hücrenin sağkalımı bu ailenin proapopitotik ve antiapopitotik üyelerinin rölatif oranına bağlıdır.Bcl–2/Bax gen ailesinin ürünleri, mitokondri ve çekirdek zarlarının yanı sıra endoplazmik retikulum zarının üzerinde de yer alırlar.
28 Bcl-2 AilesiPro-apopitotik-Bax-Bcl-XS-Bak-Bad-Bid-Bik-Bim-NoxaAnti-apopitotik-Bcl-2-Bcl-XL-Bcl-W-Mcl-1-A1-Nr-13-Ced-9Antiapopitotik Bcl–2 üyeleri, aminoasit sıraları en az üç dört bölgede Bcl-2’ye benzerlik gösterir.Proapopitotik Bcl-2’lerin hepsinde BH3 bölgesi vardır. Antiapopitotiklerde bu bölge yoktur.
29 Anti-apopitotikBcl–2, 24–26 kDa’luk bir proteini kodlar, bu protein, mitokondrinin sitoplazmaya dönük dış zarı üzerinde ve endoplazmik retikulumun bir bölümü olan çekirdek zarında yerleşmiştir.
30 Anti-apopitotikBu proteinler iyon alış-verişini düzenler ve zarın parçalanmasına karşı koruyucu etki yaparlar.Özellikle antiapopitotik genler içinde yer alan Bcl-xL’in mitokondriyal hasarı engelleyerek mitokondriyi koruduğu ileri sürülmektedir. Bu sayede apopitoz inhibisyonu gerçekleşmektedir.
31 Apopitozu indükleyici faktörler Bax proteinleri sitoplazmada da bulunur. Apopitotik sinyalin alınmasından sonra Bax proteinleri, mitokondri zarının ‘permeabilite geçiş poru’na doğru yönlenirler ve buraya bağlanırlar.Bu bağlanma seçici iyon geçirgenliğini (permeabilitesini) azaltabilir. Zardaki bu değişiklikler nedeniyle sitokrom c ve AIF (Apoptozis Inducing Factor) gibi mitokondri zarı içinde yer alan faktörler sitoplazmaya geçerler.
32 Prokaspaz-9’ un aktivasyonu, bir seri kaspaz aktivasyonunu başlatır. AIF doğrudan kromatin yoğunlaşmasının ve nüklear fragmentasyonun meydana geldiği çekirdeğe doğru yönelir.Sitokrom c’nin bir sitoplazma proteini olan Apaf-1’e bağlanması prokaspaz-9’ u aktive eder ve oluşan bu kompleks ‘apoptosom’ olarak isimlendirilir. (Apaf–1 aynı zamanda ATP’ye de bağlanır.)Prokaspaz-9’ un aktivasyonu, bir seri kaspaz aktivasyonunu başlatır.Aktif kaspaz–9, efektör kaspazlardan prokaspaz-3’ü aktive eder.
33 Aktif kaspaz-3, kaspazla aktifleşen deoksiribonükleaz inhibitörünü (ICAD) inaktifleştirir, böylece bu inhibitörün bağladığı kaspazla aktifleşen deoksiribonükleaz (CAD) serbestleşir ve bu da apopitozisin karakteristik bulgularından biri olan kromatin yoğunlaşmasına ve DNA fragmentasyonuna neden olur.
34 Bak/Bax dış membranda yer alır, aktivasyonu cyt c salar, cyt c ise Apaf-1’in ATP varlığında caspase-9’a bağlanmasını sağlarSmac/DIABLO IAP’I inhibe ederek Apopitozise yol açarApopitotik sinyalin alınmasındansonra Bax proteinleri, mitokondrizarının ‘permeabilite geçiş poru’na yönlenirler ve buraya bağlanırlar.IAP:kaspazinhibitörleri
35 Sitokrom c’nin bir sitoplazma proteini olan Apaf-1’e bağlanması prokaspaz-9’ u aktive eder ve oluşan bu kompleks ‘apoptosom’ olarak isimlendirilir. (Apaf–1 aynı zamanda ATP’ye de bağlanır.)APAF-1MitokondriSitokrom-CProkas-paz9Sitokrom-CAIFApopitozisProteaz Active edici FaktörSistein proteaz pro-kaspaz
36 Prokaspaz-9’ un aktivasyonu, bir seri kaspaz aktivasyonunu başlatır. Aktif kaspaz–9, efektör kaspazlardan prokaspaz-3’ü aktive eder.Prokaspaz-9MitokondriAIF
38 Kaspaz-9 Fosfatlar Kaspaz-3 Kaspaz-6 Protein kinazlar Kaspaz-7 MitokondriFosfatlarMİTOKONDRİLERİN ROLÜMitokondriAPOPİTOZİSKaspaz-9Kaspaz-3Kaspaz-6Kaspaz-7Protein kinazlarFosfatlarSitoplazmaya salıverilen Sitokrom-C, diğer mitokondriyal faktörler (Apopitozis Proteaz Active edici Faktör (Apaf-1) + Sistein proteaz pro-kaspaz) ile birleşir.Oluşan komplekse “Apopitozom” adı verilir Apaf-1 aktivasyonu kaspaz-9’u; apopitozom ise kaspaz 3,6 ve 7’yi, protein kinazları, fosfatları aktive eder.Kaspaz-3Kaspaz-6Protein kinazlarKaspaz-7
39 Apopitozu İndükleyici Faktör (AIF) Apopitozu indükleyici faktör, normal olarak mitokondrinin intermembranal boşluğunda bulunan bir proteindir. Hücre ölüm sinyali aldığında mitokondriden salınır, nükleusa göç eder, DNA’ya bağlanır ve onun parçalanmasını ve sonuç olarak hücrenin ölümünü gerçekleştirir. Nöronlar ve belki de diğer hücreler de kaspazların kullanılmadığı durumlarda, kendi kendilerini parçalamaya yönelik olan bu yolun kullanıldığı düşünülebilir.
40 Sitokrom c, mitokondri iç membranında bulunan elektron transport zincirinin bir proteinidir. Apopitoz sürecinde merkezi bir konuma oturmuştur. Bu yüzden de sitokrom c’nin mitokondriden sitoplazmaya salıverilmesi irreversibl bir döneme girildiğini işaret eder.
41 Ekstrinsik yol veya ölüm reseptörleri: Salgılanan bazı polipeptidler (ölüm aktivatörleri) doğrudan reseptörleri uyararak kaspazları aktive ederlerTNF proteinleri TNF reseptörlerine bağlanırlarFas, TNF ailesindendir
42 Ekstrinsik yol ile Apopitoz mekanizmasında üç temel grup rol alır: Ölüm reseptörleriAdaptör proteinlerProteolitik enzimler (kaspazlar)
43 Ölüm reseptörleriTNF (Tümor Necrozis Factor) reseptör gen ailesine aittir. Bu reseptör polipeptidlerin sitoplazmik bölümleri ölüm alanı adı verilen bir aminoasit dizisini içerir ve adaptör proteinlere bağlanırlar.Ölüm reseptörleri:CD95 (APO–1/Fas)TRAIL (TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand) –R1TRAIL-R2TNF-R1DR3DR6 ‘dır.
44 Adaptör proteinler, reseptörle gelen sinyal sonucunda kaspazlara bağlanıp onları aktive ederler ve kaspazlar aktive olan DNAaz aracılığı ile DNA yıkımına neden olurlar.
45 Kaspazlar Sistein proteaz ailesindendir. Aktif merkezinde sistein yer alır ve sitoplazmada inaktif prekürsörler olarak bulunur.Aktif enzim 20 kD’luk subüniteye (Large) ilave olarak 10 kD’luk subüniti (small) bulunan bir heterotetramerdir.Kaspazlar, proteinleri yalnızca aspartik asit bulunan bölgelerden keser, bu nedenle c-asp-ases adını almışlardır.
47 Kaspazlar bir seri olaylar dizisinde diğer prokaspazları aktive ederek çalışırlar. Kaspaz kaskadı, sitokrom c’nin sitoplazmaya salıverilmesiyle prokaspaz-9’un aktivasyonu yoluyla aktifleştirildiği gibi, kaspazlarda sitokrom c’nin salıverilmesine neden olabilirler.
50 Kaspaz aktivasyonu hücreye özgüdür ve kaspaz inhibitörlerinin (IAP) effektör kaspazları inhibe ederek apopitozu engellediği gösterilmiştir.Bu inhibitörler malign hücrelerde aşırı olarak gözlenirler. Böylece kaspazların kısıtlı proteolizisi nedeniyle, hücrede lizis şekillenmez ve apopitotik cisimcikler oluşur.
52 Granzim veya Perforin Sistemi Apopitozu başlatan bir başka neden ise, sitotoksik T lenfositlerinden salıverilen granzim B’lerin hedef hücrede kaspaz sistemini aktifleştirmesidir.Bu salgısal apopitotik yol, patojenle enfekte hücreler ve tümör hücrelerinin ortadan kaldırılmasında etkilidir.Perforinler ve granzim B(serin proteaz), sitotoksik T lenfositler ve Natural Killer hücrelerinin sitoplazmik salgı granülleri içinde bulunan proteinlerdir.Sitotoksik T lenfositler, hedef hücreye bağlandığında perforinler salgılanır ve salgılanan perforinler hedef hücre üzerinde dairesel bir por oluştururlar.
53 Apopitoz büyüme faktörlerinin ortamdan eksilmesiyle de başlatılabilir. Apopitoz ayrıca reaktif oksijen radikallerinin hem mitokondri hem plazma membranı hem de genom üzerinde oluşturabileceği hasarlara bağlı olarak da başlatılabilir.Apopitoz büyüme faktörlerinin ortamdan eksilmesiyle de başlatılabilir.Hücre kültür ortamında büyütülen hücreler eğer serum açlığına maruz bırakılırlarsa apopitoz nedeniyle ölürler.
54 Ayrıca bir proapopitotik (apoptozu uyarıcı) bcl–2 ailesi üyesi olan Bad’ın fosforillenememesi sonucu aktifleşmesi ve böylece mitokondriden apopitozisi başlatıcı bir faktör olan sitokrom c’nin sitoplazmaya salıverilmesi yoluyla da gerçekleşir.
55 Apopitozda Mitokondrinin Rolü Mitokondrinin aktivasyonu (sitokrom c’nin mitokondriden sitoplazmaya salıverilmesi) apopitotik süreçte irreversible noktayı gösterir.Mitokondrinin aktivasyonuna yol açan en önemli faktör, bcl–2 ailesidir.Hem proapopitotik hem de antiapopitotik üyeleri olan bu ailenin üyelerinin mitokondri üzerindeki etkileriyle ya sitokrom c’nin sitoplazmaya salıverilmesi gerçekleşir (apopitozisin başlaması) veya sitokrom c’nin sitoplazmaya salıverilmesi baskılanır (apopitozisin inhibisyonu).
56 Hücre yaşamını sağlayan sinyal yolları Hücreler başka hücrelerden gelen canlılık sinyalleri ile baskılanmadıkça apopitoza programlanmıştır.Nöronların %50 si hedef hücrelerden yaşam sinyali alırlar (NGF protein tirozin kinaz reseptörlerini uyarır).
57 sürdürülmesine sadece PI 3-kinaz/Akt sinyal PI 3-kinaz/Akt yoluHücre yaşamınınsürdürülmesine sadece PI 3-kinaz/Akt sinyalyolu değil, aynı zamanda Ras/Raf/ERK yolugibi diğer sinyal yolları da aracılık eder.