Julia O’Hara Stiles, 28 Mart 1981’de Greenwich Village Judith Newcomb Stiles ve ilkokul öğretmeni John O’Hara’nın kızı olarak New York’da dünyaya gelmiştir. Üç çocuğun en büyüğü olan Stiles, İrlanda, İngiltere ve Almanya kökenine sahiptir.
Erken yaşta modern dans dersleri almaya teşvik edilerek Shakespeare ve tiyatroy ile tanışmıştır. 11 yaşındayken, deneysel off-Broadway La MaMa Tiyatrosu ile çocuk oyuncu olarak ilk defa gözler önüne çıkmıştır. Tutkusu büyüyen Stiles sonraki yıllarda profesyonel olarak performans sergilemeye ve reklamlarda çalışmaya başlamıştır. Erken gelişen ve parlak bir öğrenci olan Stiles 1994 yılında Vampirle Görüşme adlı filmdeki çocuk vampir rolü için düşünülmüş ancak daha sonra rolü Kirsten Dunst’a kaybetmiştir. New York’un Profesyonel Çocuk Okulu’nda eğitimine devam eden Stiles 15 yaşında, I Love You, I Love you Not (1996) filminde Claire Danes ile birlikte göze çarpmayı başarmıştır. Sessiz Düşman (1997) filminde Harrison Ford’un kızı olarak rol aldıktan sonra Stiles, ilk büyük çıkışını Oprah Winfrey tarafından yapılan çocuk istismarı ile ilgili olan Before Women Had Wings (1997) adlı filmle yakalamıştır. Senden Nefret Etmemin 10 Sebebi (1999), Hamlet (2000) ve O – Bir dev adam (2001) filmlerinde oynamasıyla Shakespeare’i oynama isteği de üç kat gerçekleşen Stiles, daha sonra, 2002’de “Twelfth Night” adlı bir Shakespeare-in-the-Park yapımında Broadway’den Viola’yı canlandırmıştır.
2000 yılında Columbia Üniversitesi’ne girmeye karar verdikten sonra meslek hayatını geçici olarak kesintiye uğratmış ve İngilizce alanından mezun olmuştur. Daha sonra Stiles, David Mamet’in Londra’daki “Oleanna” filminde sahneye çıkmıştır. Milenyum yılının gelmesiyle, Bourne serilerinde Matt Damon ile birlikte onu başarıya taşıyacak başrollerde oynamıştır. Bunlar; Geçmişi Olmayan Adam (2002), Medusa Darbesi (2004), and Son Ültimatom (2007) adlı filmlerdir. Bourne filmleri arasındaki dönemde, Julia Roberts’ın karşısında Mona Lisa Gülüşü (2003) adlı adlı film topluluk dramalarında görülen Stiles, Shirley MacLaine ve Randy Quaid ile başrolde yer aldığı Carolina (2003) adlı filmde alışılmadık şekilde dikkatleri üzerine çekmiştir. Aramızda (2012) ve bir komedi filmi olan It’s Disaster (2012) gibi filmlerle indie film köklerine de geri dönmüştür.2010 yılında ani bir sapma ile yönünü değiştirip Dexter’in beşinci sezonunda Lumen Pierce olarak karşımıza çıkan Stiles, bu performansı ile de en iyi yardımcı kadın oyuncu dalında Altın Küre ve Emmy adaylığını kazanmıştır.
3 Ocak 2016’da , Go With Me (2015) adlı çalışmasında birlikte çalıştığı kamera asistanı Preston Cook ile nişanlandığını duyurmuştur ve ilk çocuğunu beklemektedir.